Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Данио рерио модели сахарного диабета и метаболических памяти

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

Метаболическая память явления, которые диабетических осложнений сохраняться и развиваться беспрепятственно, даже после euglycemia достигается фармацевтически. Здесь мы опишем сахарного диабета у рыбок данио модель, которая уникальна тем, что она позволяет рассмотрении митотически передаваться эпигенетические компонентов метаболического памяти

Abstract

Сахарный диабет в настоящее время затрагивает 346 миллионов лиц, и это, по прогнозам, увеличится до 400 миллионов к 2030 году. Данные из обеих лабораторий и крупных клинических испытаний показали, что диабетические осложнения прогресса беспрепятственно через явления метаболической памяти, даже когда гликемического контроля является фармацевтически достигнута. Экспрессия генов может быть стабильно изменены через эпигенетические изменения, которые позволяют не только клеток и организмов быстро реагировать на изменяющиеся внешние стимулы, но и придает способность клетки "запоминают" это встречается один раз стимул удаляется. Таким образом, роль, которую играют эти механизмы в метаболических явление памяти в настоящее время изучаются.

Недавно мы сообщили о разработке рыбок данио модели типа I сахарного диабета и характеризуется эту модель, чтобы показать, что диабетическая рыбок данио не только отображать известные вторичные осложнения, в том числе изменений, связанныхс диабетической ретинопатии, диабетической нефропатии и ухудшение заживления ран, но также демонстрируют нарушение хвостового плавника регенерации. Эта модель уникальна тем, что у рыбок данио способны к регенерации поврежденных свою поджелудочную железу и восстановлению euglycemic состояние, подобное тому, что можно было бы ожидать в период после трансплантации человеческих пациентов. Кроме того, несколько раундов хвостового плавника позволяют ампутации для разделения и изучения чистых эпигенетические эффекты в системе естественных условиях без потенциальных осложняющих факторов из предыдущего состояния диабетом. Хотя euglycemia достигается после регенерации поджелудочной железы, диабетические осложнения вторичной регенерации плавников и исцеления ран кожи сохраняется на неопределенный срок. В случае нарушения регенерации плавников, эта патология сохраняется даже после нескольких раундов плавник регенерации в тканях дочь плавник. Эти наблюдения указывают на основных эпигенетических процессов, существующих в метаболическое состояние памяти. Здесь мы представляем методы, необходимые для успешного поколенияerate диабетом и метаболическим памяти групп рыб и обсудить преимущества этой модели.

Introduction

Сахарный диабет (СД) является серьезной и растущей проблемой здравоохранения, что приводит к сокращению продолжительности жизни из-за болезни конкретного микрососудистых (ретинопатия, нефропатия, нейропатия, нарушение заживления ран) и макро (болезни сердца и инсульта) осложнений 1. Как только начато, диабетические осложнения продолжают прогрессировать непрерывно, даже когда гликемический контроль достигается за 2,3, и это явление получило название метаболического памяти или наследие эффект. Наличие этого явления была признана клинически в начале 1990-х годов как "контролю диабета и осложнений (DCCT)" прогрессировал и с тех пор поддерживает несколько дополнительных клинических испытаний 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Животные модели DM были важны для открытий, связанных с патофизиологии осложнений диабета и метаболических памяти. В самом деле, сохранение диабетических осложнений была впервые зарегистрирована в собачьей модели диабетическойретинопатия, которая впоследствии была поддержана несколькими линиями экспериментальных данных с использованием различных в пробирке культуру систем и животных моделях 15,16,17,18,19,20,21. Эти исследования ясно показывают, что начальный период гипергликемии приводит к постоянному нарушений (в том числе аберрантной экспрессии генов) органов-мишеней / клетки и механистически предполагает участие эпигенома.

Epigenomes состоит из всех модификаций хроматина для данного типа клеток и отвечает за уникальный профиль экспрессии генов клетки. Хромосомы изменения являются динамическими в процессе развития, дифференцировки клеток поддержки, которые реагируют на внешние раздражители, которые митотически стабильно наследуется 22,23 и могут быть изменены при болезни 24,25,26. Эти эпигенетические механизмы включают в себя: посттрансляционных модификации гистонов, неканонические гистонов включения вариант в octomers, хроматин доступ изменений через метилирование ДНК и геновВыражение управления через некодирующих РНК, микро 27,28,29,30. В общей сложности эпигенетические процессы позволяют клеток / организмов быстро реагировать на изменяющиеся внешние стимулы 31,32,33, они также предоставляют возможности для клетки "запоминают" это встречается один раз стимул удаляется 23,22. Поэтому, как измененное профили экспрессии генов в результате эпигенетических процессов являются стабильными при отсутствии сигнала (ы), которая инициировала их и наследственные через деление клеток, они приобрели большой интерес как молекулярные механизмы, лежащие в основе патологий человека, включая метаболическую память. Результаты, которые возникают в контексте DM и эпигенетика параллельных достижений в области других заболеваний, в том, что множество эпигенетических изменений, вызванных гипергликемией привести к замечательным стойкие изменения транскрипционных сетей клеток (обзор в 34,35,36,37,38).

Данио уже давно премьер-министр организм модель студентовду развития позвоночных, однако в последние 15 лет наблюдается экспоненциальный рост использования этого организма для изучения человеческих болезней. 39. Данио рерио моделей человеческих болезней были созданы охватывающих широкий спектр человеческих патологий, в том числе генетические нарушения и приобретенные болезни 40,41,42. Много преимуществ по сравнению с другими рыбок данио модельных организмов позвоночных включает высокую плодовитость, короткие сроки поколения, прозрачности за счет раннем взрослом возрасте, снижение затрат на жилье и набор инструментов для генной манипуляции. Кроме того, благодаря широкому сохранению генетических путей и клеточной физиологии среди позвоночных и способность выполнять высокие показы наркотиков пропускную способность, рыбок данио была успешно использована для фармацевтических открытий.

Мы разработали взрослые модели рыбок данио тип I сахарного диабета использовании сахарного диабета наркотиков, стрептозоцин. Мы охарактеризовали эту модель, чтобы показать, что диабетическая рыбок данио нетт отображать только известных человеческих вторичных осложнений, но, кроме того, обладают нарушенной регенерации конечностей (хвостовой плавник регенерации) вследствие гипергликемии окружающей среды. Кроме того, мы сообщили, что гипергликемическое рыбок данио вернуться к нормальной гликемии через 2 недели после удаления препарата за счет регенерации эндогенных бета-клеток поджелудочной железы в результате физиологически нормального гликемического состояния. Однако, в отличие от конечностей регенерации у этих рыб остается нарушениями в той же степени, как в остром состоянии диабетической указывает это осложнение сохраняется и восприимчив к метаболической памяти. Основным стимулом для создания этой модели было создание системы для изучения митотически стабильный эпигенетические компоненты, которые поддерживают метаболические явление памяти в отсутствие фонового шума из предыдущих окружающей среды гипергликемии. В заключении протокола, представленная здесь рыбок данио и или селективные ткани могут быть обработаны любым подходящим для анализа исследовrchers нуждается. Мы успешно использовали эту процедуру для определения генома стойкие изменения метилирования ДНК индуцированных гипергликемией, которые ведутся в метаболическое состояние памяти 21.

Мы считаем, что это данио модели типа I сахарный диабет имеет ряд инновационных преимуществ перед другими системами моделью для изучения метаболических памяти. 1) Все наши исследования могут проводиться в естественных условиях и в предыдущем рыбы гипергликемическое вернуться к euglycemia через восстановление эндогенного инсулина, они не требуют экзогенных инъекции инсулина. Таким образом, это позволяет избежать осложняющих шипы и долин в гликемического контроля, которые могут возникнуть у животных, требует экзогенного инсулина. 2) Как описано выше, на фоне стимуляции от предыдущего состояния диабетической (то есть продолжающееся присутствие гликирования конечных продуктов и реактивных форм кислорода маркеров) будут устранены, и поэтому можно рассмотреть чисто epigenetic факторами метаболических памяти. 3) эксперименты могут быть выполнены быстро, как это требуется около 80 дней, от диабета до индукции метаболических экспертиза памяти. 4) Хвостовой плавник регенерации экспериментально очень доступным и позволяет легко генетической и экспериментальной манипуляции, для которых существует широкий спектр инструментов. 5) Хвостовой плавник регенерации обеспечивает очень простой и количественных методов для оценки метаболической памяти и, следовательно, позволит будущим лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры выполняются в соответствии с инструкциями описано в разделе "Принципы ухода за животными лаборатория" (Национальные Институты Здоровья публикации нет. 85-23, пересмотренная 1985) и утвержденным Розалинд Франклин университета Институциональные уходу и использованию животных комитета животных протокола 08-19.

Есть 2 важных сокращений, которые используются в этой рукописи. 1) DM: относится к рыбам, которые находятся в остром (300 мг / дл) гипергликемическое состоянии и были в течение не менее 3 недель. 2) MM: относится к рыбам, которые были 21 день (см. протокол) DM рыбы и позволило восстановить контроль гликемии через поджелудочной железы регенерации. Это достигается в течение (14) дней лекарственных удаления. Рыба считается MM рыбу с этого момента. Важно также отметить, что рыбы, которые называются контроля обрабатываются одинаково, как DM или ММ рыб с точки зрения количества инъекций (физиологический раствор только), время инкубации при различных температурах и количество и срокихвостового плавника ампутации.

1. Генерация данио рерио с сахарным диабетом, DM рыбы

  1. Подготовка и восстановление и обезболивающий емкостей для воды. Восстановление вода нормальная рыба. Для анестетика воду добавить достаточное 2-феноксиэтанол, так что разведение 1:1000 в обычной воде рыба достигнута.
  2. Подготовка 0,3% раствора (в вытяжном шкафу) из стрептозоцин (СТЗ), добавляя 6 мг STZ к 2 мл 0,09% хлорида натрия и сразу же разместить решение на льду. Это обеспечит достаточный инъекционного раствора для инъекций около 20 рыб за 20 мин. Если вы превысите 20-й минуте, остановить, и сделать свежий раствор STZ прежде чем продолжить. В отдельной трубке аликвоту достаточно солевой раствор для контроля рыбы. После STZ растворяется все последующие шаги не требуют использования дыма капот.
  3. Наполните шприц ½ см оснащена 27 1/2 иглы с СТЗ или контроля решений обеспечения того, чтобы не быть пузырьков воздуха.
  4. АнестезииTize каждой рыбы индивидуально, поместив рыбу в воде анестезии, и ждать, пока их бассейн движение прекращается (1-2 мин).
  5. После наркоза кратко поместить рыбу на бумажное полотенце, чтобы впитывать лишнюю воду, положите рыбу в лодку весом и измерить массу рыбы.
  6. Поместите рыбу на твердой поверхности (чашки Петри крышкой) для инъекций.
  7. Inject СТЗ или контрольного раствора в брюшную полость рыбы, вставив иглу прошлом конические в задней поверхности вентрального брюшины.
  8. 0,35 мг / г (350 мг / кг) СТЗ должны быть доставлены в каждой рыбы и объем в 0,3% растворе требуется может быть рассчитана следующим образом.
    1. Умножить массу рыбы (г) на 0,35 и получают количество СТЗ в мг требуется.
    2. делить продукт, полученному выше на 3 с получением объема 0,3% раствор необходимо для инъекций в мкл.
      Пример: на 0,5 г рыбы: а) 0,5 х 0,35 = 0,175 б) .0175 / 3 = 0,058 мл= 58 мкл.
      Такой же объем без СТЗ будет введен для контроля рыбы. Лист для объемов вводить в массе рыбы должны быть созданы и используются для быстрого ознакомления.
  9. После инъекции поместить рыб в аквариуме вода восстановление и контролировать их нормальной деятельности плавание. Как только это было достигнуто рыба переводится в нормальный танк жизни, который поддерживается на пониженном температурном диапазоне от 22 ° C - 24 ° C. Это привело к снижению температуры имеет решающее значение для эффективной индукции гипергликемии (сахарный диабет, DM).
  10. Несмотря на то, гипергликемия обнаружен в течение 24 ч первую инъекцию, для того, чтобы вызвать длительное состояние очень высокой гипергликемии у рыбок данио требуются частые инъекции фазы индукции следуют еженедельные инъекции обслуживания, как показано ниже.

Неделя 1: 3 инъекции (День 1, 3, 5), 2-я неделя: 1 инъекция (День 12), 3-я неделя: 1 инъекция (День 19),
4-я неделя (День 21) ВыполнитеАнализ интересов.

На данный момент у рыбок данио, как считается, был в состоянии длительной гипергликемии и проявлять диабетических осложнений ретинопатии, нефропатии, а также нарушение регенерации плавников. Они называют DM рыбы. Кроме того, при желании рыбу можно поддерживать в состоянии гипергликемии с еженедельными инъекциями обслуживания. Приблизительно 5% смерть во время этого процесса ожидать не следует.

2. Коллекция крови и уровень глюкозы натощак крови (FBGL) Определение

  1. Каждая группа DM и контроль рыба должна включать достаточно рыбы, чтобы точно определить среднюю FBGL группы, так как это требует анализа этих рыб в жертву.
  2. Подготовка меченым PCR трубы для каждого крови, содержащей 5 мкл стерильного физиологического раствора.
  3. Для сбора крови, анестезии рыб, как указано выше, удалить всю воду, положите рыбу на предметное стекло и с помощью скальпеля, удалить голову рыбына базе крышечкой.
  4. Сбор крови (до 2 мкл), который высвобождается из рыбы на слайде и быстро добавить его в 5 мкл стерильного физиологического раствора пипетки вверх и вниз, чтобы убедиться, что кровь не забивают. Немедленно поместите образец на льду.
  5. Определить объем крови путем измерения объема жидкости (физиологический раствор + кровь), а затем вычитая из 5 мкл физиологического раствора.
  6. Передача 5 мкл разведенной крови из каждой трубки ПЦР в 1,5 мл трубки микроцентрифуге и определения концентрации глюкозы в крови использованием QuantiChrome Kit анализа глюкозы. Это осуществляется следующим протоколом производителя без исключения. Ожидаемые результаты: нормальный / контрольных рыб 60 мг / дл и DM рыбы 310 мг / дл.

3. Хвостовой плавник регенерации исследований

  1. Anesthetize рыбы, как описано в 1.0-1.4.
  2. Место рыбу на крышку чашки Петри и ампутировать хвостового плавника по прямой линии, используя стерильный размер10 Скальпель проксимальнее первого лепидотрихий точки ветвления при просмотре через плавник рассекает микроскопом.
  3. Дайте рыбе восстановиться, как и в 1.10, однако поместить рыбу при 33 ° C для регенеративной фазе роста анализа. Это установленной температуры для ускоренного анализа регенерации плавников.
  4. Ребра могут быть отображены в любом ампутации сообщению время, однако мы регулярно исследовать восстановительный рост на 24, 28 и 72 часа после транс-раздел.
  5. Anesthetize рыбы, как и раньше (см. 1.0-1.4), поместите рыбу под рассекает микроскопом оснащен камерой (мы используем Nikon СМЗ-1500 оснащена Q-изображений камера) и собрать все ребра изображений на увеличение 1x с программным обеспечением NIS элементов . Плавника должны быть распределены для работы с изображениями так, чтобы она полностью вытянута, не растягивая и не повредить ткань и должна быть свободна от любых капель воды. Для согласованности всегда размещать спинной стороне справа.
  6. Печать изображений и измерения регенеративной ГруWTH области с помощью программного обеспечения J изображения и использования блокнот для рисования. След вокруг всей площади нового роста и определить области. Каждое измерение должно быть в пять раз и составил в среднем для обеспечения точности трассировки. Важно, что изображения, используемые не имеют тени или капельки воды, как это способствует ошибкам в измерении вырост области.
  7. Измерьте длину ампутации сайт вдоль спинной-вентральной оси и делит площадь определена в 3,6 по этому измерению. Это позволяет рыб разных размеров, чтобы напрямую сравнивать.

4. Генерация метаболическая память (MM) данио рерио

  1. Инициировать группы DM рыб и их соответствующие элементы управления, как описано в разделе 1.
  2. На 21 дней определить FBGL для подмножества группы и разделить DM рыбы на 2 подгруппы. Продолжить еженедельные инъекции СТЗ для одной из групп, DM контроля в течение всего срока эксперимента. Прекратить STZ инъекций для второй группы и incubatе рыбы при нормальной температуре. В течение 14 дней эти рыбки данио будет восстановить нормальный инсулин крови и контроль уровня глюкозы через поджелудочной железы регенерации. Эти рыбы теперь называется MM (метаболический рыба памяти).
  3. На 30-й день поста наркотиков удаления ампутировать хвостовой плавники контроля, Д. и М. рыбу с помощью метода, описанного в п. 3.2.
  4. Вернуться рыбы нормальных условиях вода для регенерации плавников в течение 30 дней. Это позволяет рост, что мы называем, метаболических тканях памяти.
  5. На 60-й день провести вторую ампутацию (как описано в 3,2) в ткани, которые регенерируют в период с 30-60 дней и выполнить хвостовой плавник анализа регенерации (3,1-3,7) Рисунок 1.
  6. Изолировать тканей и выполнять анализ интересов. См. Таблицу 1 для протокола резюме.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Тип I диабетической рыбок данио не только отображать известные вторичных осложнений ретинопатии и нефропатии, но и обладают дополнительными осложнения: нарушение регенерации хвостового плавника. Это позже осложнений сохраняется в связи с метаболическим памяти рыб, которые восстановили нормальную контроля уровня глюкозы после гипергликемическое период. На рисунке 2А (контроль) и рис. 2В (метаболическая память) представитель изображений плавники регенерирующее, которые были захвачены в 72 часа после ампутации представлены. Дефицит может быть определена количественно и, как показано на рисунке 2C DM и М. рыбок данио демонстрируют дефицит примерно на 40% в 72 часа по сравнению с контролем рыб. Хотя данные, включенные в рисунок 2С заканчивается в 90 дней это же нарушение было наблюдать, как далеко, как 150 дней.

Таблица 1. Протокол резюме.

Рисунок 1
Рисунок 1. Карикатура, изображающая ампутации сайтов для метаболического эксперимента памяти. Синий цвет представляет ткань, которая была разоблачена в предыдущее состояние гипергликемии. Зеленый цвет указывает на ткани, который был выращен из 30-60 дней после гипергликемии. Черная пунктирная линия указывает на первое место ампутации выполняются на 30-й день и красного указывает на потенциальную сайте ампутации, что будет происходить в течение 60 дней.

Рисунок 2
Рисунок 2. Хвостовой плавник регенерации Уменьшение в Диабетическая (DM) и метаболическая память (MM) данио рерио. А. Представитель хвостового плавника изображение от контроля вводили рыбу показывает нормальное количество регenerative рост 72 часов после ампутации. Белая пунктирная линия представляет собой ампутацию плоскости и розовые сплошная линия demarks регенеративной вырост. Количество регенерации определяется путем отслеживания область, содержащихся в розовых и белых линий, деленная на длину белой линии для нормализации различия плавник размера. B. представитель хвостового плавника изображение с любой DM или ММ иллюстрирующие уменьшение количества восстановительного роста 72 часа сообщению ампутации. Линий и измерения площади такие же, как для панельных А. С. Графическое представление относительная скорость регенерации DM и М. рыбок данио по сравнению с контрольной группой. Относительная доля (с контролем установлен на уровне 100%) DM и М. рыбок данио регенеративный продукт на 72 часа показан. Время в дни изображены относительно того, когда СТЗ администрация была остановлена ​​для метаболических группы памяти. Эти данные, в которых генерируют несколько исследователей и включают более 1000 рыб в группе. <сильная> 2A рис и рис. 2В были адаптированы с разрешения Olsen и др. 43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сахарный диабет является заболеванием метаболической регуляции, первоначально диагноз гипергликемии, что в конечном итоге приводит к повреждению кровеносных сосудов приводит ко многим осложнениям, которые все сохраняются даже после euglycemia достигается хотя фармацевтического вмешательства. Это сохранение осложнений называют метаболическим памяти и несколько последних исследованиях изучалась роль, которую эпигенетические механизмы играют в этом явлении. Здесь мы подробно протокол, который позволяет генерировать как острых, так и диабетическая метаболическая память (восстановлен контроль уровня глюкозы) у рыбок данио. Кроме того, мы описали методологию, которая может быть использована для отделить эпигенетические взносы от потенциально осложняющих компонентов предыдущего состояния диабетом. Мы хотели бы подчеркнуть, что рыба может быть рассмотрен в любой момент с любого анализа представляют интерес для конкретного исследователя и, следовательно, ниже по течению приложений для будущих открытий бесконечны.

Тамэлектронной несколько шагов в протоколе, которые требуют некоторого дальнейшего обсуждения и внимания. По нашему опыту 0,3% СТЗ в растворе ухудшается и теряет свою эффективность после примерно 20 минут. Поэтому мы предполагаем, что таймер использовать и свежие решения быть сделаны в 20-минутными интервалами. Во время наших первых попыток создать диабетической рыбок данио мы были только с помощью одной инъекции в течение первой недели и были успешными с примерно 40% рыбы. Как таковой, не существует жесткое требование в течение трех инъекций, однако, когда трое выполняют норму успеха превышает 95%. Во-вторых, при введении СТЗ в данио важно, чтобы игла вводится таким образом, что срез иглы полностью находится внутри рыбы для обеспечения надлежащего дозирования раствора, однако, предостережение должно быть принято, что она проникает слишком далеко, чтобы предотвращение внутренних повреждений. После СТЗ или контрольный раствор вводят рыбу выдерживают при пониженной температуре (22 ° C - 24 & Dнапример, C). Мы не можем более подчеркивают важность пониженной температуре как без него рыбок данио будут восстанавливать свои бета-клетки (СТЗ вводили) и гипергликемии не может быть эффективно стимулировать. Наконец, у нас в крови у рыбок данио руках сгустки очень быстро, что предотвращает необходимые капиллярного действия, необходимые для эффективного использования глюкометра, и поэтому мы не выступаем за их использование. Мы обнаружили, что QuantiChrome анализа, описанного является не только самым надежным, но самым простым для выполнения и научить персонал лаборатории. Вместе методов, описанных в протоколе не трудно, и если надлежащие меры предосторожности при шаги, описанные выше поколение диабетической рыбок данио все, но уверен.

Есть очень мало ограничений в процедуре, описанной в этой рукописи, однако все наркотики индуцированных моделях болезни всегда есть критики с эффектами целевой выравнивается на них. Мы отсылаем читателя к нашей первоначальной рукописи detailinг эта модель, как мы предоставлена ​​5 независимых линий доказательств (в том числе с непосредственным впрыском СТЗ в ластах) документирование, что нет никаких эффектов с целью STZ 43. Другим потенциальным ограничением исходит не от самой процедуры, но из того, что реагенты для исследования рыбок данио еще не достигли уровня других модельных организмов, таких как мыши. К счастью, у рыбок данио все шире используется в качестве модельного организма для человека болезни этот недостаток в настоящее время быстро устранены.

В целом, как указано в предисловии, у рыбок данио модели сахарного диабета описано здесь имеет ряд преимуществ перед другими организмами модели. Важно отметить, что позволяет для изучения чисто эпигенетические компоненты, которые поддерживают метаболические феномен памяти. Как прогнозируется, что 400 миллионов людей будут поражены этим заболеванием мы считаем, что вклад от исследований с использованием этой модели может иметь значительное воздействие на здоровье человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом от Якокка Family Foundation, Розалинд Франклин университета запуск фондов и Национального института здоровья Грант DK092721 (для RVI). Авторы хотели бы поблагодарить Nikki Intine за помощь в подготовке рукописи.

Materials

ДЕНЬ ПОРЯДОК
1
3 DM = STZ инъекций (350 мг / дл), Control = введения физиологического раствора
5 DM = STZ инъекций (350 мг / дл), Control = введения физиологического раствора
12 DM = STZ инъекций (350 мг / дл), Control = введения физиологического раствора
19 DM = STZ инъекций (350 мг / дл), Control = введения физиологического раствора
21 Либо выполнить анализ представляет интерес для DM рыбы или перейти, чтобы сделать MM групп снятия давления СТЗ.
51 Ампутировать Fins 30 дней после последней инъекции STZ контроля, DM и СТЗ групп в целях получения MM ткани.
81 Re-ампутировать плавники всех групп в ткани, которая была выращена между днем ​​51 и 81 для выполнения регенерации исследования. Кроме лечения рыб / ткани с анализом интересов.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. , (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. , (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. , (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. , (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).

Tags

Медицина выпуск 72 генетика геномика физиологии анатомии биомедицинской инженерии Metabolomics данио рерио сахарный диабет метаболический памяти регенерации тканей стрептозоцин эпигенетика, Животной модели сахарный диабет диабет лекарственных средств гипергликемия
Данио рерио модели сахарного диабета и метаболических памяти
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras… More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter