Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Diabetes Mellitus ve Metabolik Belleğinin Zebrafish Modeli

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

Metabolik bellek diyabetik komplikasyonlar inat ve öglisemi farmasötik elde edildikten sonra bile engelsiz ilerleme hangi olgudur. İşte biz metabolik bellek mitotik bulaşıcı epigenetik bileşenlerinin incelenmesi için izin verdiği benzersiz bir diyabet zebrafish modeli açıklamak

Abstract

Diabetes mellitus, şu anda 346 milyon kişi etkiler ve bu sayının 2030 yılında 400 milyon artması beklenmektedir. Laboratuvar ve büyük ölçekli klinik çalışmalarda hem Kanıt diyabetik komplikasyonların gelişme glisemik kontrol farmasötik gerçekleşse bile metabolik bellek fenomen aracılığıyla engelsiz olduğunu ortaya koymuştur. Gen ekspresyonu stabil bir şekilde hücreler ve organizmalar hızla çevresel uyarıcılar değişen cevap vermesine izin verir, sadece epigenetik değişiklikleri yoluyla değiştirilen değil aynı zamanda bu uyarıcı çıkartıldıktan sonra karşılaşır "hatırlamak" için hücre yeteneği vermek edilebilir. Gibi, bu mekanizmaların metabolik bellek fenomen oynadığı roller henüz incelenmektedir.

Biz son zamanlarda tip I diabet zebrafish modelinin geliştirilmesi bildirdi ve ilişkili değişiklikler dahil olmak üzere bilinen sekonder komplikasyonların görüntüleyemez sadece diyabetik zebrafish göstermek için bu modeli karakterize etmişDiyabetik retinopati, diyabetik nefropati ve bozulmuş yara iyileşmesi ile değil, aynı zamanda engelli Kuyruk yüzgecinin rejenerasyon sergilerler. Bu model zebrafish hasar görmüş pankreas yeniden ve transplant sonrası insan hastalarda beklenen ne benzer bir öglisemik durumuna geri yüklemek için yeteneğine sahip olduğunu benzersizdir. Ayrıca, Kuyruk yüzgecinin amputasyon çok sayıda mermi önceki Diyabetik devlet potansiyel zorlaştıran faktörler olmadan vivo sistemde saf epigenetik etkileri ayrılması ve çalışma için izin verir. Öglisemi pankreas rejenerasyon sonrasında elde olmasına rağmen, yüzgeç yenilenmesi ve cilt yara iyileşmesi Diyabetik sekonder komplikasyon süresiz devam. Bozulmuş yüzgeç rejenerasyon durumunda, bu patoloji hatta kız yüzgeç dokularda kanat rejenerasyon çok sayıda mermi sonra saklanır. Bu gözlemler, metabolik bellekte varolan bir durumda bulunan altta yatan epigenetik sürecine işaret etmektedir. Burada başarılı bir nesil için gerekli yöntemleri anlatmakbalık diyabetik ve metabolik bellek grupları hafiften orta ve bu modelin avantajları tartışacağız.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) ciddi ve büyüyen bir sağlık sorunu olduğunu hastalığa özgü mikrovasküler (retinopati, nefropati, nöropati, yara iyileşmesinde bozulma) ve makrovasküler (kalp hastalığı ve inme) komplikasyonlar 1 nedeniyle azalmış yaşam beklentisi sonuçlar. Bir kez başlatılan, diyabet komplikasyonları glisemik kontrol 2,3 elde edilmiş olsa bile kesintisiz ilerlemeye devam ediyor ve bu fenomenin metabolik bellek veya eski etkisi olarak adlandırılır olmuştur. Bu olayın varlığı, "Diyabet Kontrol ve Komplikasyonları Çalışması (DCCT)" ilerledi ve o zamandan beri birçok ek klinik 4,5,6,7,8,9,10 tarafından desteklenmektedir olarak 1990'ların başlarında klinik olarak tanındı 11,12,13,14. DM Hayvan modelleri diyabetik komplikasyonlar ve metabolik bellek pato-fizyolojisi ile ilgili keşifler için kritik olmuştur. Aslında, diyabetik komplikasyonların sebat ilk diyabetik bir köpek modelinde belgelendiHangi retinopati yana in vitro kültür sistemleri ve hayvan modelleri 15,16,17,18,19,20,21 içinde çeşitli kullanarak deneysel kanıt birkaç satırlık tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmalar, net bir şekilde hedef organ / hücrelerin sürekli bozukluklar (anormal gen ekspresyonu dahil olmak üzere) ve mekanistik bir ilk dönem sonuçlarının hiperglisemik epigenom katılımı göstermektedir göstermektedir.

Epigenomes belirli bir hücre tipi için tüm kromatin modifikasyonları oluşur ve hücre benzersiz gen ekspresyon profili sorumludur. Kromozom değişiklikler, geliştirme, destek hücre farklılaşması sırasında dinamik dış uyaranlara duyarlı, mitotik stabil 22,23 devralınan ve hastalık 24,25,26 değişmiş olabilir. Bu epigenetik mekanizmalar şunlardır: translasyonel histon modifikasyonları, octomers olmayan kanonik histon varyant içerme, DNA metilasyonu ile kromatin erişim değişiklikler ve gen yayınlayınmikro RNA'lar 27,28,29,30 kodlamayan yoluyla ifade kontrolü. Toplamda, epigenetik süreçleri hücre / organizma hızlı çevresel uyaranlara 31,32,33 değişen yanıt vermesini sağlamak, onlar da bu uyarıcı 23,22 çıkartıldıktan sonra karşılaştığında "hatırlamak" için hücre için yeteneği kazandırmaz. Epigenetik süreçler sonucunda değişmiş gen ekspresyon profilleri bunları başlatılan sinyalinin olmaması (ler) in kararlı ve hücre bölünmesi yoluyla kalıtsal olarak, bu nedenle, onların metabolik bellek dahil olmak üzere insan patolojilerin moleküler mekanizmalar olarak büyük ilgi kazanmıştır. DM ve epigenetik hiperglisemi ile indüklenmiş epigenetik değişikliklerin bir bolluk hücre transkripsiyonel ağlarda kayda değer kalıcı değişiklikler (34,35,36,37,38 olarak gözden geçirilmiştir) neden olduğu diğer hastalıkların paralel gelişmeler bağlamında ortaya çıkmaktadır sonuçlanır.

Zebrafish uzun stu için önde gelen bir model organizma olmuşturdy omurgalı gelişimi Ancak son 15 yılda insan hastalık çalışma için bu organizma kullanan bir üstel büyüme. 39. gördü. Insan hastalık Zebrafish modeller genetik bozukluklar ve edinilmiş hastalığı 40,41,42 dahil olmak üzere insan patolojileri geniş bir aralığı kapsayan kurulmuştur. Diğer omurgalı model organizmalar üzerinde zebrafish birçok avantajı yüksek doğurganlık, kısa döl süresi, erken yetişkinlik yoluyla şeffaflık, düşük konut maliyetleri ve gen manipülasyonu için bir dizi araç içerir. Dahası, omurgalılarda ve yüksek verimli ilaç taramalarında gerçekleştirmek için kapasite arasında genetik yolları ve hücre fizyolojisi geniş koruma dolayı, zebrabalığı başarılı ilaç keşfi için kullanılmıştır.

Biz diyabetojenik ilaç, streptozosin kullanarak tip I diyabet, yetişkin zebrafish modeli geliştirdik. Biz diyabetik zebrafish hiçbir göstermek için bu modeli karakterize etmişt sadece bilinen insan ikincil komplikasyonlar görüntüler, ancak ilave olarak, çevre hiperglisemik bir sonucu olarak bozulmuş uzuv yenilenme (kaudal yüzgeç rejenerasyon) sergiler. Ayrıca, hiperglisemik zebrafish bir fizyolojik normal glisemik devlet sonuçlanan endojen pankreatik beta hücrelerinin yenilenmesi nedeniyle uzaklaştırılan ilaç 2 hafta içinde normal glisemi geri dönmek olduğunu bildirdi. Bu komplikasyonun devam ve metabolik bellek duyarlı olduğunu belirten akut diyabetik devlet Ancak, aksine, bu balık uzuv rejenerasyon aynı ölçüde bozulmuş kalır. Bu modelin üretilmesi için ana hız önceki hiperglisemik çevre arka plan gürültü yokluğunda metabolik bellek fenomen destek mitotik olarak kararlı epigenetik bileşenini ve bir sistem sağlamaktır. Protokolü bitiminde zebrafish ve veya seçici dokuların resea uygun herhangi bir tahlil ile işlenebilir Burada sağlananrchers gerekmektedir. Biz başarıyla metabolik bellek durumu 21 tutulur hiperglisemi ile indüklenen DNA metilasyonu genom kalıcı değişiklikleri tanımlamak için bu prosedürü kullandık.

Biz tip I diyabet bu zebrafish modeli metabolik bellek incelenmesi için diğer model sistemler üzerinde birçok yenilikçi avantajları olduğunu hissediyorum. 1) bizim Tüm çalışmalarda, in vivo olarak gerçekleştirilebilir ve önceki hiperglisemik balık endojen insülin üretiminin rejenerasyonu ile öglisemi dönmek gibi, eksojen insülin enjeksiyonları gerekmez. Bu nedenle, bu dışsal ensülin gerektiren hayvanların oluşabilir glisemik kontrol zorlaştıran ani ve vadiler önler. 2) yukarıda tarif edilen önceki diyabetik durumuna (yani ileri glikasyon son-ürünleri ve reaktif oksijen türlerinin belirteçlerin devam eden varlığı) için arka plan uyarım elimine edilir ve bu nedenle tek bir saf epig incelemek üzeremetabolik bellek enetic faktörleri. Bu metabolik bellek inceleme kadar diyabet indüksiyon yaklaşık 80 gün sürer olarak 3) deneyleri hızla gerçekleştirilebilir. 4) Kuyruk yüzgeci rejenerasyon deneysel çok cana yakın ve araçları geniş bir dizi var olduğu için kolay genetik ve deneysel manipülasyon için izin verir. 5) Kuyruk yüzgeci rejenerasyon metabolik bellek değerlendirmek ve bu nedenle gelecekteki ilaç keşfi için izin verecek bir çok basit ve ölçülebilir bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm işlemler "Laboratuar Hayvan Bakımı İlkeleri" konusunda açıklanan kuralları (Sağlık yayının National Institutes hayır. 85-23, 1985 revize) ve onaylanmış Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım sonrasında gerçekleştirilen ve Komite hayvan protokolü 08-19 kullanın edilir.

Bu yazıda kullanılan 2 önemli kısaltmalar vardır. 1) DM: akut (300 mg / dl) hiperglisemik hal içinde olan ve en azından 3 hafta olmuştur balık anlamına gelir. 2) MM: (bkz protokolü) DM balık 21 gün vardı ve pankreatik rejenerasyonu ile glisemik kontrolün yeniden izin verilen balık anlamına gelir. Bu ilaç çıkarma (14) gün sonra elde edilir. Balık bu noktadan itibaren MM balık olarak kabul edilir. Kontrol olarak adlandırılan bu balık dikkat etmek de önemlidir DM veya MM enjeksiyon sayısı açısından balık (sadece tuzlu su), çeşitli sıcaklıklarda inkübasyon süreleri ve sayı ve zamanlama gibi aynı şekilde muamele edilmiştirKuyruk yüzgecinin amputasyonların.

1. Diabetes mellitus, DM Balığı Zebra balığı üretimi

  1. Kurtarma ve anestezik su tankları hem hazırlayın. Kurtarma su normal balık sudur. 2-fenoksietanol yüzden normal balık su içinde bir 1:1,000 seyreltme elde edilir yeterli eklemek anestezik su için.
  2. % 0.09 sodyum klorür 2 ml STZ 6 mg eklenmesi ve hemen buz üzerinde çözüm yerleştirin tarafından streptozosin (STZ) bir% 0.3 solüsyonu (bir davlumbaz) hazırlayın. Bu, 20 dakika içinde yaklaşık 20 balık enjeksiyon için yeterli enjeksiyon solüsyonu sağlayacaktır. Eğer 20 dakika işareti aşarsa, durdurmak ve devam etmeden önce yeni bir STZ çözüm olun. Kontrol balık için ayrı bir tüp kısım yeterince tuz çözeltisi içinde. STZ çözündüğünü sonra tüm sonraki adımları davlumbaz kullanılması gerekmez.
  3. Hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat sağlayarak STZ veya kontrol çözümleri ile 27 1/2 gauge iğne ile donatılmış bir ½ cc şırınga doldurun.
  4. Anestezianestezik suda balık yerleştirerek, her bir balık Tize ve onların yüzme hareketi (1-2 dk) geçene kadar bekleyin.
  5. Bir kez anestezi kısaca herhangi bir aşırı su emmek için bir kağıt havlu üzerine balık yer, tekne ağırlığında balık yerleştirin ve balık kütlesi ölçer.
  6. Enjeksiyon için bir sert yüzey (Petri çanağı kapak) üzerinde balık yerleştirin.
  7. Ventral peritonun posterior yönü içine konik geçmişte iğne sokarak balık periton boşluğuna STZ veya kontrol solüsyonu enjekte edilir.
  8. 0.35 mg / g arasında STZ ile (350 mg / kg) her biri balık ve aşağıdaki şekilde hesaplanabilir gereken% 0.3 çözelti hacmine göre teslim edilmelidir.
    1. Gerekli mg STZ miktarını elde etmek için 0.35 ile balık kütlesi (g) çarpar.
    2. ul enjeksiyon için gerekli olan% 0.3 çözelti hacmi elde etmek için 3 ile oluşturulan yukarıdaki ürün bölün.
      Örnek: 0.5 gr balık için: a) 0.5 x 0.35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0.058 ml= 58 ul.
      STZ olmadan aynı hacimde bir kontrol balıklar için enjekte edilecektir. Balık kütlesi başına enjekte hacimleri için sac oluşturulan ve hızlı başvuru için kullanılmalıdır.
  9. Aşağıdaki enjeksiyon kurtarma su tankındaki balık yerleştirin ve normal yüzme aktivitesi için onları izlemek. Bir kez bu balık elde edilmiştir 22, indirgenmiş sıcaklık aralığında muhafaza edilir, normal bir yaşam tankına transfer edilir ° C - 24 ° C. Bu azaltılmış sıcaklık hiperglisemi verimli indüksiyonu (diabetes mellitus, DM) için önemlidir.
  10. Hiperglisemi çok yüksek bir hiperglisemi uzatılmış durumuna neden olmak amacıyla, ilk enjeksiyondan 24 saat içinde tespit olmasına rağmen zebrabalığı aşağıda gösterildiği gibi bir sık ​​enjeksiyon indüksiyon fazı haftalık bakım enjeksiyonlar izledi gerektirir.

1. Hafta: 3 enjeksiyon (Gün 1, 3, 5), Hafta 2: 1 enjeksiyon (Gün 12), 3. Hafta: 1 enjeksiyon (Gün 19)
4. Hafta: (Gün 21) gerçekleştirinilgi tahlil.

Bu noktada zebrafish hiperglisemi uzun bir devlet olmuştur sayılır ve retinopati, nefropati ve ayrıca engelli fin rejenerasyon diyabetik komplikasyonların sergilerler. Bunlar, DM balık olarak adlandırılır. Ek olarak arzu edilirse balık haftalık bakım enjeksiyonu ile hiperglisemik hal içinde muhafaza edilebilir. Bu işlem sırasında yaklaşık olarak% 5 oranında ölüm olması beklenmektedir.

2. Kan Toplama ve Açlık Kan Şekeri Seviyesi (FBGL) Belirlenmesi

  1. DM ve kontrol balık Her grup Bu deneyde, bu balık feda edilmesi için gerekli olduğu gibi tam olarak grubunun ortalama FBGL belirlemek için yeterli balık içermelidir.
  2. Steril serum fizyolojik 5 ul içeren her kan örneği için bir etiketli PCR tüpü hazırlayın.
  3. Kan toplama için, yukarıdaki gibi balık uyutmak, tüm su kaldırmak bir mikroskop lamı üzerine balık yerleştirin ve bir neşter kullanılarak, balık kafası kaldırmaoperculum'un dibinde.
  4. Slayt üzerine balık serbest ve hızlı kan yapışmasına etmediğinden emin olmak için yukarı ve aşağı pipetleme steril normal salin 5 ul bunu ekleyin kanı (en fazla 2 ul) toplayın. Hemen buz üzerinde örneği yerleştirin.
  5. Sıvı toplam hacmi ölçülerek kan numune hacmi (tuzlu + kan) belirlenmesi ve daha sonra tuzlu su 5 ul dışarı çıkartılması.
  6. 1.5 ml mikrofuge'de tüp içine her PCR tüp seyreltilmiş kan 5 ul aktarın ve QuantiChrome Glukoz Testi Kiti kullanarak kan glukoz konsantrasyonunu belirlemek. Bu istisnasız üreticinin protokolü takip ederek gerçekleştirilir. Beklenen sonuçlar: Normal / kontrol balık 60 mg / dl ve DM balık 310 mg / dl.

3. Kuyruk Yenileme Çalışmaları

  1. 1,0-1,4 tarif edildiği gibi balık anestetize.
  2. Steril bir boyutu kullanarak Place bir Petri kabı kapağının üzerinde balık ve düz bir çizgi kuyruk yüzgeci organını10 bir diseksiyon mikroskobu ile fin izlerken ilk lepidotrichia dallanma noktasına proksimal neşter.
  3. Balık 1.10 olarak kurtarabilirsiniz ancak testin rejeneratif büyüme fazı için 33 ° C'de balık yerleştirmek için izin ver. Bu hızlandırılmış yüzgeç yenilenmesi analizi için kurulmuş bir sıcaklıktır.
  4. Yüzgeçleri ancak biz rutin ötesi bölümünden sonra 24, 28 ve 72 saatte rejeneratif büyümenin incelenmesi sonrası herhangi amputasyon de görüntülenebilir.
  5. (1,0-1,4 bakınız) daha önce olduğu gibi balık uyuştur, bir kamera (biz bir Q-görüntüleme Kamera ile donatılmış Nikon SMZ-1500 kullanımı) ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu altında balık yer ve NIS elemanlar yazılımı ile 1X büyütme tüm fin görüntüler toplamak . Yüzgeç tamamen doku germe veya zarar vermeden genişletilmiş ve herhangi bir su damlacıklarının arındırılmış olmalıdır, böylece görüntüleme için yayılmış olmalıdır. Tutarlılık için her zaman sağ dorsal tarafına yerleştirin.
  6. Görüntüler yazdırın ve rejeneratif Gro ölçmekwth alanı Görüntü J yazılım ve çizim pedi kullanımı kullanarak. Yeni büyüme tüm çevresi izleme ve alanı belirler. Her ölçüm beş kez yapılan ve izleme doğruluğunu sağlamak için ortalama edilmelidir. O bu akıbet alanda ölçüm hataları katkıda olarak kullanılan görüntüleri gölgeler veya su damlacıkları yok olması önemlidir.
  7. Dorsal karın eksen boyunca kesilmesi site uzunluğu ölçülür ve bu ölçüm ile 3.6 olarak tespit edilen alan bölün. Bu, farklı boyutlarda balık doğrudan mukayese edilmesi verir.

4. Metabolik Bellek (MM) Zebra balığı üretimi

  1. DM balık ve Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi bunların uygun bir kontrol grubu başlatın.
  2. 21 günün sonunda grubun bir alt kümesi için FBGL belirlemek ve 2 alt gruba DM balık bölün. Deney süresi için DM kontrol olarak gruplardan biri için haftalık STZ enjeksiyonu devam edin. Ikinci grup ve incubat için STZ enjeksiyonu kesE normal sıcaklıkta balık. 14 gün içinde bu zebrafish normal kan insülin ve glukoz pankreas rejenerasyon yoluyla kontrolü geri yüklenir. Bu balıklar artık MM (metabolik bellek balık) denir.
  3. Günde 30 mesaja uzaklaştırılan ilaç 3.2 'de açıklanan yöntemle balık DM ve MM kontrol kaudal yüzgeçler, organını.
  4. 30 gün boyunca yüzgeç yenilenmesi için normal su koşullarına balık dönün. Bu ne terim, metabolik bellek doku büyümesini sağlar.
  5. Günde 60 30-60 gün dönemde rejenere edilmiş doku içinde ikinci amputasyon (as 3.2 'de açıklanan) gerçekleştirmek ve kuyruk yüzgeci rejenerasyon assay (3,1-3,7) Şekil 1 gerçekleştirin.
  6. Doku izole ve ilgi testi gerçekleştirin. Bir protokol özeti için Tablo 1'e bakınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bozulmuş Kuyruk yüzgecinin rejenerasyonu: I diyabetik zebrafish sadece retinopati ve nefropati bilinen sekonder komplikasyonların gösterilecek, ama aynı zamanda, ek bir komplikasyon sergilerler yazın. Bu daha sonra bir komplikasyonudur hiperglisemik dönemi sonrasında normal glukoz kontrolü restore balık metabolik bellek nedeniyle devam etmektedir. Şekil 2A (kontrol) ve Şekil 2B (metabolik bellek) 72 saat sonrası amputasyon ele geçirildi yenileyici yüzgeçleri temsili görüntü sunuldu. Açığı nicel ve sıra balık kontrol grubuna kıyasla 72 saatte yaklaşık% 40 bir açığı gösteren Şekil 2C DM ve MM zebrafish gösterilebilir. Şekil 2C dahil verileri 90 gün biter rağmen bu aynı değer 150 gün olarak dışarı kadar gözlenmiştir.

Tablo 1. Protokol Özeti.

Şekil 1
Şekil 1. Karikatür metabolik hafıza deneyleri için amputasyon siteleri resmeden. Mavi rengi önceki hiperglisemik durum maruz kalmıştır doku gösterir. Yeşil renk 30-60 gün sonrası hiperglisemi büyüdü edildi doku gösterir. Siyah noktalı çizgi günde 30 ve kırmızı gerçekleştirilen ilk amputasyon sitesinde 60 gün oluşacak olası bir amputasyon sitesi belirtmektedir.

Şekil 2,
Şekil 2. Kuyruk Rejenerasyon Diyabetik (DM) ve Metabolik Bellek (MM) Zebra balığı olarak Kartıdır. A. kontrolü bir temsilci Kuyruk yüzgecinin görüntü reg normal bir miktarını gösteren balık enjekteenerative büyüme 72 saat sonrası amputasyon. Beyaz noktalı çizgi amputasyon düzlemini temsil ve pembe düz çizgi rejeneratif akıbet demarks. Yenilenme miktarı yüzgeç boyutu farkları normalleştirmek için beyaz çizgi uzunluğu ile bölünmüş pembe ve beyaz hatları içinde yer alan izleme ile tespit edilir. B. iyileştirici büyüme çok daha az miktarda gösteren DM veya mm bir temsilci kuyruk yüzgeç görseli 72 saat sonrası amputasyon. Hatları ve alan ölçümleri, kontrollere göre DM ve MM zebrafish göreceli yenilenme hızı paneli A. C. grafik sunumu için aynıdır. 72 saatte DM ve MM zebrafish rejeneratif akıbet göreli yüzdesi (% 100 set kontrolleri için) gösterilir. STZ idaresi metabolik bellek grubu için durduruldu zaman tasvir gün içinde zaman görecelidir. Bu veriler nerede birçok araştırmacı tarafından oluşturmak ve grup başına 1.000 balık üzerinde birleştiriyor. <strong> Şekil 2A ve Şekil 2B Olsen ve ark 43 izniyle uyarlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diabetes mellitus, başlangıçta sonuçta öglisemi farmasötik müdahale olsa elde edildikten sonra tüm bile devam birçok komplikasyonlara yol açan kan damarı hasar ile sonuçlanan hiperglisemi, tanısı metabolik düzensizlik bir hastalıktır. Komplikasyonların Bu sebat metabolik bellek ve çeşitli yeni çalışmalar epigenetik mekanizmalar bu fenomeni oynadığı rolü incelenmiştir olarak adlandırılır. Burada akut diyabetik ve metabolik bellek (restore şekeri kontrolü) zebrafish hem üretimi için izin veren bir protokol detaylandırılmıştır. Biz daha önceki diyabetik devletin potansiyel zorlaştıran bileşenleri epigenetik katkıları ayırmak için istihdam edilebilir metodoloji açıklanmalıdır. Biz balık özellikle araştırmacı ve bu nedenle gelecekteki keşif için downstream uygulamalar sonsuzdur ilgilendiren herhangi bir deneyde olduğu herhangi bir noktada incelenebilir vurgulamak istiyoruz.

TherE biraz daha fazla tartışma ve vurgu garanti protokolü çeşitli adımlar vardır. Bizim tecrübelerimize göre çözüm% 0.3 STZ bozulur ve yaklaşık 20 dakika sonra etkisini kaybeder. Bu yüzden, bir zamanlayıcı kullanılabilir ve taze bir çözelti 20 dakikalık aralıklarla yapılması göstermektedir. Diyabetik zebrafish oluşturmak için bizim ilk girişimleri sırasında biz sadece ilk haftasında bir enjeksiyon kullanarak ve balık yaklaşık% 40 ile başarılı olmuşlardır. Bu nedenle, üç enjeksiyon için katı bir gereklilik yoktur, ancak, üç gerçekleştirildiğinde başarı oranı% 95 üzerindedir. İkinci olarak, zebrabalığı STZ içine enjekte zaman iğnenin iğne konik tam çözelti uygun dozaj sağlamak için balık içinde olacak şekilde yerleştirilir önemlidir, ancak, dikkatli bir çok uzak nüfuz etmez dikkat edilmelidir iç hasarı önlemek. Sonra, STZ ya da kontrol solüsyonu balık tatbik edilmektedir daha düşük bir sıcaklıkta (22 inkübe edilir ° C - 24 ve dörneğin, C). Zebrafish onların beta hücreleri (STZ enjeksiyonu) ve hiperglisemi verimli indüklenen edilemez yenileyecek onsuz Biz üzerinde indirgenmiş sıcaklığın önemini vurgulamak olamaz. Son olarak, bizim eller zebrafish kandaki etkin glukometre kullanımı için gerekli olan kapiller eylem engeller ve bu nedenle biz onların kullanılmasını savunan yok ki çok hızlı bir şekilde pıhtılaşması. Biz tarif QuantiChrome tahlil sadece en güvenilir değil ama kolay gerçekleştirmek için ve laboratuvar personeli öğretmek olduğunu bulduk. Topluca protokolü açıklanan teknikler zor değildir ve uygun önlemler diyabetik zebrafish nesil yukarıda anlatılan adımları ile alındığı takdirde tüm ama emin.

Ancak hastalığın tüm ilaçlara bağlı modeller her zaman onlara yöneltilen şut etkileri eleştiri var bu yazıda anlatılan yordamı içinde çok az sınırlama vardır. Biz bizim ilk el yazması bunlar ayrıntılı için okuyucu bakınBiz STZ 43 hayır şut etkileri olduğunu belgeleyen deliller 5 bağımsız hatları (yüzgeçleri içine doğrudan STZ enjeksiyonu dahil) sağlanan g Bu modeli olarak. Başka potansiyel sınırlama prosedür kendisi ancak zebrafish araştırma için reaktifler örneğin, fare gibi diğer model organizma seviyesinde henüz yok olması gelmez. Zebrafish giderek insan hastalığı için bir model organizma olarak kullanılıyor gibi Neyse, bu eksikliği kısa sürede giderildiği ediliyor.

Özetle, gibi giriş için ayrıntılı olarak burada açıklanan diyabet zebrafish model diğer model organizmalar üzerinde birçok avantajı vardır. Önemlisi, bu metabolik bellek fenomeni destekleyen tamamen epigenetik bileşenlerinin incelenmesi için izin verir. Bunun 400 Milyon kişi bu bozukluk ile tutulmuş olacağı tahmin edilmektedir gibi bu modeli kullanan çalışmaların katkısı, insan sağlığı üzerinde önemli etkileri olabileceğini hissediyorum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma Iacocca Aile Vakfı, Rosalind Franklin Üniversitesi start-up fonları ve Sağlık Grant DK092721 Ulusal Enstitüsü (RVI için) bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar makalenin hazırlanmasında yardımı için Nikki Intine teşekkür etmek istiyorum.

Materials

GÜN PROSEDÜRÜ
1
3 DM = STZ enjeksiyonu (350 mg / dl), Kontrol = salin enjeksiyonu
5 DM = STZ enjeksiyonu (350 mg / dl), Kontrol = salin enjeksiyonu
12 DM = STZ enjeksiyonu (350 mg / dl), Kontrol = salin enjeksiyonu
19 DM = STZ enjeksiyonu (350 mg / dl), Kontrol = salin enjeksiyonu
21 Ya DM balık ilgi deney gerçekleştirmek veya STZ basıncının çıkarılması ile MM grup oluşturmaya devam edin.
51 Denetimlerin son STZ enjeksiyonu takiben 30 gün, DM ve STZ gruplarının Fins MM dokusunda oluşturmak amacıyla kesmek.
81 Rejenerasyon çalışması gerçekleştirmek için günlük 51 ve 81 arasında büyüdüğü dokusunda tüm grupların yeniden organını yüzgeçleri. Alternatif ilgi tayini ile balık / doku tedavi.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. , (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. , (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. , (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. , (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).

Tags

Tıp Sayı 72 Genetik Genomik Fizyoloji Anatomi Biyomedikal Mühendisliği Metabolomik Zebra balığı diyabet metabolik bellek doku rejenerasyonu streptozosin epigenetik, Hayvan modeli diyabet diyabet ilaç keşfi hiperglisemi
Diabetes Mellitus ve Metabolik Belleğinin Zebrafish Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras… More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter