Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Zebrafish modell av diabetes mellitus och metabola Memory

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

Metabolisk minne är det fenomen genom vilket diabeteskomplikationer kvarstår och utvecklas obehindrat även efter euglykemi uppnås farmaceutiskt. Här beskriver vi en diabetes mellitus zebrafisk modell som är unik genom att den möjliggör granskning av de mitotiskt överförbara epigenetiska komponenter i metabolisk minne

Abstract

Diabetes mellitus drabbar idag 346 miljoner människor och detta förväntas öka till 400 miljoner år 2030. Bevis från både laboratorie-och storskaliga kliniska prövningar har visat att diabeteskomplikationer framsteg obehindrat genom fenomenet metabola minnet även när glykemisk kontroll farmaceutiskt uppnås. Genuttryck kan stabilt förändras genom epigenetiska förändringar som inte bara tillåter celler och organismer att snabbt reagera på förändrade miljön stimuli, utan också ger möjlighet för cellen att "memorera" dessa möten när stimulansen avlägsnats. Som sådana är de roller som dessa mekanismer spelar i den metaboliska minnet fenomenet närvarande granskas.

Vi har nyligen rapporterat att utveckla en zebrafisk modell typ I diabetes mellitus och kännetecknas denna modell för att visa att diabetiker zebrafisk inte bara visa de kända sekundära komplikationer inklusive tillhörande ändringarmed diabetesretinopati, diabetesnefropati och försämrad sårläkning, men också uppvisar nedsatt stjärtfenan förnyelse. Denna modell är unik i att zebrafisk är kapabel att regenerera dess skadade bukspottkörteln och återställa ett euglykemiska tillstånd som liknar vad som skulle förväntas i efter transplantation humanpatienter. Dessutom, flera omgångar av stjärtfenan amputering möjliggöra separation och studiet av rena epigenetiska effekter i ett in vivo-system utan potentiella komplicerande faktorer från föregående diabetiska tillståndet. Även euglykemi uppnås efter pankreas förnyelse, kvarstår den diabetiska sekundära komplikation av fin förnyelse och hud sårläkning obestämd tid. I fallet med nedsatt fin förnyelse, detta patologi kvar även efter flera omgångar av fin förnyelse i vävnaderna dotter fin. Dessa observationer pekar på en underliggande epigenetisk process som finns i den metaboliska minnet staten. Här presenterar vi de metoder som krävs för att framgångsrikt gendande av diabetes och metabola minne grupper av fisk och diskutera fördelarna med denna modell.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) är ett allvarligt och växande hälsoproblem som leder till minskad medellivslängd på grund av sjukdom specifik mikrovaskulära (retinopati, nefropati, neuropati, försämrad sårläkning) och makrovaskulär (hjärtsjukdomar och stroke) komplikationer 1. När initierats diabeteskomplikationer fortsätta att utvecklas utan avbrott även när glykemisk kontroll uppnås 2,3 och detta fenomen har benämnts metabolisk minne eller äldre effekten. Förekomsten av detta fenomen erkändes kliniskt under tidigt 1990-tal som "Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" utvecklats och sedan har fått stöd av flera ytterligare kliniska prövningar 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Djurmodeller för DM har varit kritiska för upptäckter relaterade till pato-fysiologi diabeteskomplikationer och metabolisk minne. I själva verket var ihållande diabeteskomplikationer första dokumenterade i en hundmodell av diabetesretinopati som sedan fått stöd av flera rader av experimentella bevis med hjälp av olika in vitro kultur system och djurmodeller 15,16,17,18,19,20,21. Dessa studier visar tydligt att en första hyperglykemiska period resulterar i permanenta avvikelser (inklusive avvikande genuttryck) av målorgan / celler och mekanistiskt föreslår engagemang epigenomet.

Epigenomes består av alla de kromatin ändringar för en viss celltyp och ansvarar för en cell unika genuttryck profil. Kromosomen ändringar är dynamiska under utvecklingen, stöd celldifferentiering, är lyhörda för yttre stimuli, är mitotiskt stabilt ärvda 22,23 och kan ändras i sjukdom 24,25,26. Dessa epigenetiska mekanismer är: posttranslationell histon modifieringar, icke-kanoniska histon varianten integration i octomers, kromatin förändringar tillgång genom DNA-metylering och genuttryck kontroll genom icke-kodande mikro RNA 27,28,29,30. Sammantaget epigenetiska processer tillåter celler / organismer att snabbt reagera på förändrade miljön stimuli 31,32,33, ger de också möjlighet för cellen att "memorera" dessa möten när stimulansen avlägsnats 23,22. Därför, eftersom förändrade genuttryck profiler till följd av epigenetiska processer är stabila i frånvaro av signalen (er) som initierade dem och ärftlig genom celldelning, har de vunnit stort intresse som underliggande molekylära mekanismer för mänskliga sjukdomar, inklusive metabolisk minne. De resultat som växer fram i samband med DM och epigenetik parallella framsteg i andra sjukdomar genom att en uppsjö av epigenetiska förändringar inducerade av hyperglykemi orsakar anmärkningsvärda ihållande förändringar i transkriptions nätverk av celler (granskas 34,35,36,37,38).

Zebrafisk har länge varit en ledande modell organism till study ryggradsdjur utveckling men de senaste 15 åren har sett en exponentiell tillväxt i utnyttja denna organism för studier av sjukdomar hos människor. 39. Zebrafisk modeller av mänsklig sjukdom har fastställts spänner över ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar, inklusive genetiska sjukdomar och förvärvad sjukdom 40,41,42. De många fördelarna med zebrafisk över andra organismer ryggradsdjur modell inkluderar hög fruktsamhet, kort generationstid, öppenheten genom tidig vuxen ålder, minskade kostnader bostäder och en mängd verktyg för genmanipulation. Dessutom, på grund av den omfattande bevarande av genetiska vägar och cellulär fysiologi bland ryggradsdjur och kapacitet att utföra stora visningar genomströmning läkemedel har zebrafisk framgångsrikt använts för läkemedelsforskning.

Vi har utvecklat en vuxen zebrafisk modell av typ I diabetes mellitus och med den diabetogena drogen, streptozocin. Vi har karakteriserat denna modell för att visa att diabetiker zebrafisk intet visa bara de kända humana sekundära komplikationer men dessutom uppvisar nedsatt lem regenerering (stjärtfenan regenerering) som en följd av hyperglykemiska miljön. Dessutom har vi rapporterat att hyperglykemiska zebrafisk återgår till normal glykemi inom 2 veckor av läkemedel bort på grund av förnyelse av endogena betacellerna vilket resulterar i en fysiologiskt normal glukoskontroll tillstånd. Men däremot är lem förnyelse i dessa fiskar försämras i samma utsträckning som i den akuta diabetiska tillståndet anger denna komplikation kvarstår och är mottaglig för metabolisk minne. Den huvudsakliga drivkraften för att generera denna modell var att skapa ett system för att studera mitotiskt stabila epigenetiska komponenter som stödjer det metabola minnet fenomenet i frånvaro av bakgrundsbrus tidigare hyperglykemiska miljön. Vid slutet av det protokoll som avses här de zebrafisk och eller selektiva vävnader kan bearbetas av någon analys är lämplig för forsknrchers behöver. Vi har framgångsrikt använt detta förfarande för att identifiera de genomet hela ihållande förändringar i DNA-metylering som induceras av hyperglykemi som hålls i den metaboliska minnet tillståndet 21.

Vi anser att detta zebrafisk modell av typ I diabetes mellitus har flera innovativa fördelar jämfört med andra modellsystem för att undersöka metabolisk minne. 1) Alla våra studier kan utföras in vivo och som tidigare hyperglykemiska fisken tillbaka till euglykemi genom regenerering av endogen insulinproduktion de inte kräver exogena insulininjektioner. Därför undviker detta de komplicerande spikar och dalar i glykemisk kontroll som kan förekomma i djur som kräver exogent insulin. 2) Som beskrivits ovan är bakgrunden stimulans från föregående diabetiska tillståndet (dvs. den fortsatta närvaron av avancerade glykation slutprodukter och reaktiva syre markörer arter) elimineras och därmed kan man undersöka rent epigenetic faktorer metabolisk minne. 3) Försöken kan utföras snabbt eftersom det tar ca 80 dagar från diabetes induktion tills metabolisk minne undersökning. 4) Stjärtfena regenerering är experimentellt mycket trevligt ut och gör det lätt att genetisk och experimentell manipulation för vilka det finns ett brett utbud av verktyg. 5) Stjärtfena regenerering ger en mycket enkel och kvantifierbar metod för att bedöma den metaboliska minne och därför kommer att möjliggöra framtida läkemedelsutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer utförs enligt de riktlinjer som beskrivs i "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikation nr. 85-23, reviderad 1985) och den godkända Rosalind Franklin University Institutional Animal Care och användning kommittén djur protokoll 08-19.

Det finns 2 viktiga förkortningar som används i detta manuskript. 1) DM: hänvisar till fisk som befinner sig i ett akut (300 mg / dl) hyperglykemiska tillstånd och har varit i minst 3 veckor. 2) MM: hänvisar till fisk som var 21 dag (se protokoll) DM fisk och får återställa glykemisk kontroll genom bukspottkörteln förnyelse. Detta uppnås inom (14) dagar av läkemedel bort. Fisken anses MM fisk från denna punkt och framåt. Det är också viktigt att notera att fisk som kallas kontroll behandlas identiskt som DM eller MM fisk i termer av antalet injektioner (enbart saltlösning), de inkubationstider vid de olika temperaturer och antal och tidpunktav stjärtfenan amputationer.

1. Generering av Zebrafish med diabetes mellitus, DM fisk

  1. Förbered både återhämtning och anestetiska vattentankar. Återvinning vatten är normalt fisk vatten. För bedövningsmedel vatten och tillsätt tillräckligt med 2-fenoxietanol så att en 1:1000 spädning i normal fisk vatten uppnås.
  2. Bered en 0,3% lösning (i ett dragskåp) av streptozocin (STZ) genom tillsats av 6 mg STZ till 2 ml 0,09% natriumklorid och omedelbart placera lösningen på is. Detta kommer att ge tillräckligt injektionslösning för injektion av ungefär 20 fiskar i 20 minuter. Om du överskrider 20 minuters märket, stoppa och göra en ny STZ lösning innan du fortsätter. I ett separat rör alikvot tillräckligt saltlösning för kontroll fisk. När STZ solubiliseras alla efterföljande steg inte kräver dragskåp användning.
  3. Fyll en spruta ½ cc utrustad med en 27 1/2 nål med STZ eller kontroll-lösningar som säkerställer att inga luftbubblor fångas.
  4. AnestesiTize varje fisk individuellt genom att placera fisken i narkos vatten och vänta tills deras simning rörelse upphör (1-2 minuter).
  5. När sövda kort placera fisken på en pappershandduk för att absorbera överflödigt vatten, placera fisken i väger båt och mäta massan av fisken.
  6. Placera fisken på ett fast underlag (Petriskål lock) för injektion.
  7. Injicera STZ eller kontrollösning i peritonealhålan av fisken genom att föra in nålen förbi avfasningen i den bakre aspekten av ventrala bukhinnan.
  8. 0,35 mg / g bör (350 mg / kg) av STZ levereras till varje fisk och volymen av 0,3% lösning krävs kan beräknas på följande sätt.
    1. Multiplicera massa av fisk (g) med 0,35 för att ge mängden av STZ i mg erfordras.
    2. dela den produkt som genererats ovan med 3 för att ge volym 0,3% lösning som krävs för injektion i il.
      Prov: För en 0,5 g fisk: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 pl.
      Samma volym utan STZ skulle injiceras för kontroll fisk. Ett ark för volymer att injicera per fisk massa ska genereras och användas för snabb referens.
  9. Efter injektionen placerar fisken i återhämtningen vattentanken och övervaka dem för normal simning aktivitet. När detta har uppnåtts fisken överförs till en normalt tank som hålls vid reducerad temperatur mellan 22 ° C - 24 ° C. Denna reducerade temperatur är kritisk för effektiv induktion av hyperglykemi (diabetes mellitus, DM).
  10. Även hyperglykemi detekteras inom 24 timmar från den första injektionen för att inducera en förlängd tillstånd av mycket hög hyperglykemi zebrafisk kräver en frekvent injektion induktionsfas följt av Veckotillsyn injektioner enligt nedan.

Vecka 1: 3 injektioner (dag 1, 3, 5), Vecka 2: 1 injektion (dag 12), Vecka 3: 1 injektion (dag 19),
Vecka 4: (Dag 21) Utföranalys av intresse.

Vid denna punkt zebrafisk anses ha varit i ett långvarigt tillstånd av hyperglykemi och uppvisar diabetiska komplikationer av retinopati, nefropati och även nedsatt fin förnyelse. Dessa kallas DM fisk. Dessutom om så önskas fisken kan bibehållas i hyperglykemiska tillstånd med Veckotillsyn injektioner. Cirka 5% död under denna process bör förväntas.

2. Bloduppsamling och fastande blodglukos nivå (FBGL) Fastställande

  1. Varje grupp av DM och kontroll fisk måste innehålla tillräckligt med fisk för att exakt fastställa den genomsnittliga FBGL av gruppen som denna analys kräver dessa fiskar att offras.
  2. Bered en märkt PCR-rör för varje blodprov innehållande 5 il steril normal saltlösning.
  3. För bloduppsamling, söva fisk som ovan, avlägsna allt vatten, placera fisken på ett objektglas och med en skalpell, ta bort huvudet på fiskenvid basen av kapseln.
  4. Samla blodet (upp till 2 ^) som frigörs från fisken på objektglaset och snabbt lägga till den 5 il steril normal saltlösning pipettera upp och ned för att säkerställa att blodet inte täppa. Omedelbart placera provet på is.
  5. Bestäm volymen blodprovet genom att mäta den totala volymen av vätskan (saltlösning + blod) och därefter subtrahera ut 5 pl koksaltlösning.
  6. Överför 5 pl av det utspädda blodet från varje PCR-rör i ett 1,5 ml mikrofugrör och bestämma blodglukoskoncentrationen med QuantiChrome Kit glukosanalys. Detta görs genom att följa tillverkarens protokoll utan undantag. Förväntade resultat: normal / kontroll fisk 60 mg / dl och DM fisk 310 mg / dl.

3. Stjärtfena Regenerering Studies

  1. Söva fisk enligt 1,0-1,4.
  2. Placera fisken på en petriskål lock och amputera stjärtfenan i en rak linje med en steril storlek10 skalpell proximalt till den första lepidotrichia förgreningspunkt medan du tittar fenan genom ett dissektionsmikroskop.
  3. Låt fisken att återvinna så i 1,10 men placera fisken vid 33 ° C för den regenerativa tillväxtfasen av analysen. Detta är en etablerad temperatur för accelererad fin förnyelse analys.
  4. Fenorna kan avbildas vid någon tidpunkt efter amputation men vi rutinmässigt undersöka den regenerativa tillväxt vid 24, 28 och 72 h efter trans-sektionen.
  5. Söva fisk som tidigare (se 1,0-1,4), placera fisken under ett dissekera mikroskop utrustat med en kamera (vi använder en Nikon SMZ-1500 utrustad med en Q-imaging kamera) och samla in alla fin bilder med 1X förstoring med NIS Elements . Fenan bör spridas för avbildning så att den är helt utdragen utan sträckning eller skada vävnaden och bör vara fri från vattendroppar. För konsekvensens alltid placera den dorsala sidan till höger.
  6. Skriv ut bilder och mäta regenerativa growth området med Image J och användning av en ritblock. Rita runt hela området ny tillväxt och bestämma området. Varje mätning ska göras fem gånger och medelvärdet för att säkerställa riktigheten av spårning. Det är viktigt att de använda bilderna inte har skuggor eller vattendroppar som dessa bidrar till fel vid mätning av utväxt området.
  7. Mät längden på amputation platsen längs den dorsal-ventral axel och dela den areal som fastställts 3,6 av denna mätning. Detta möjliggör fiskar av olika storlekar kan jämföras direkt.

4. Generering av metabola minne (MM) Zebrafish

  1. Initiera en grupp av DM fisk och deras lämpliga kontroller som beskrivs i avsnitt 1.
  2. Vid 21 dagar bestämmer FBGL för en delmängd av gruppen och dela DM fisken i 2 undergrupper. Fortsätt veckovis STZ injektioner för en av grupperna som DM kontroller för experimentets varaktighet. Upphör STZ injektion för den andra gruppen och incubate fisken vid normal temperatur. Inom 14 dagar dessa zebrafisk återställer normalt blod insulin och glukos kontroll genom bukspottkörteln förnyelse. Dessa fiskar är numera MM (metabolisk minne fisk).
  3. Dag 30 efter drog bort amputera stjärtfenan av kontroll, DM och MM fisk via den metod som beskrivs i 3.2.
  4. Återgå fisk till normala vattenförhållanden för fin regenerering i 30 dagar. Detta gör att tillväxten av det vi kallar, metabolisk minne vävnad.
  5. Vid dag 60 utföra en andra amputation (som beskrivs i 3,2) i vävnaden som regenereras under perioden 30-60 dagar och utföra kaudala analysen fin regenerering (3,1-3,7) Figur 1.
  6. Isolera vävnad och utföra analys av intresse. Se tabell 1 för ett protokoll sammanfattning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typ I diabetes zebrafisk inte bara visar de kända sekundära komplikationer av retinopati och nefropati, men också uppvisar en ytterligare komplikation: försämrad stjärtfenan förnyelse. Denna senare komplikation kvarstår på grund av metabolisk minne i fisk som har återställt normal blodsockerkontroll efter en hyperglykemisk period. I figur 2A (kontroll) och figur 2B (metabolisk minne) representativa bilder av regenererande fenor som fångades vid 72 h efter amputation presenteras. Underskottet kan kvantifieras och som visas i figur 2C DM och MM zebrafisk uppvisar ett underskott på cirka 40% vid 72 timmar jämfört med kontroll fisk. Även om uppgifterna som ingår i figur 2C slutar på 90 dagar samma försämring har observerats så långt ut som 150 dagar.

Tabell 1. Protokoll Sammanfattning.

Figur 1
Figur 1. Karikatyr som skildrar amputation platser för metaboliska minne experiment. Den blå färgen står för vävnad som utsattes för det tidigare hyperglykemiska tillstånd. Den gröna färgen indikerar den vävnad som odlades från 30-60 dagar efter hyperglykemi. Den svarta streckade linjen visar det första amputation platsen utförs vid dag 30 och rött indikerar en potentiell amputation webbplats som skulle uppträda vid 60 dagar.

Figur 2
Figur 2. Stjärtfena Regenerering reduceras i diabetiska (DM) och metabola minne (MM) zebrafisk. A. En representativ stjärtfenan bild från en kontroll injicerade fisk som visar en normal mängd regenerative tillväxt 72 timmar efter amputation. Den vita prickade linjen representerar amputation plan och den rosa heldragna linjen demarks den regenerativa utväxt. Mängden regenerering bestäms genom att spåra det område som ingår i den rosa och vita linjer dividerat med längden av den vita linjen att normalisera skillnader fin storlek. Ett representativt stjärtfenan bild från antingen DM eller MM illustrerar en reducerad mängd regenerativ tillväxt B. 72 timmar efter amputation. Linjerna och mätningar område är desamma som för panel A. C. Grafisk presentation av den relativa förnyelse andelen DM och MM zebrafisk jämfört med kontroller. Den relativa andelen (kontroller fastställdes till 100%) av DM och MM zebrafisk regenerativ utväxt på 72 timmar visas. Tiden i avbildade dagar är relativt när STZ administrationen stoppades för den metaboliska minnesgrupp. Dessa data där genererar av flera forskare och införliva över 1.000 fiskar per grupp. <strong> Figur 2A och Figur 2B anpassades med tillstånd från Olsen et al 43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diabetes mellitus är en sjukdom av metabolisk dysreglering, ursprungligen diagnosen hyperglykemi, som slutligen resulterar i blodkärlsskada leder till många komplikationer som alla kvarstår även efter euglykemi uppnås dock farmaceutisk intervention. Denna ihållande komplikationer kallas metabolisk minne och flera färska studier har undersökt den roll som epigenetiska mekanismer spelar i detta fenomen. Här har vi detaljerad protokoll som gör det möjligt för generering av både akut diabetes och metabola minne (återställda blodsockerkontroll) zebrafisk. Vi beskrivs vidare den metod som kan användas för att separera epigenetiska bidrag från de potentiellt komplicerande komponenterna i den tidigare diabetiska tillståndet. Vi vill understryka att fisken kan undersökas när som helst med någon analys av intresse för den enskilda forskaren och därmed efterföljande led för framtida upptäckt är oändliga.

There är flera steg i protokollet som motiverar några ytterligare diskussion och betoning. I vår erfarenhet 0,3% STZ i lösning försämras och förlorar sin effektivitet efter ca 20 minuter. Därför föreslår vi att en timer användas och en ny lösning med 20 min intervall. Under våra första försök att generera diabetiker zebrafisk vi bara använda en injektion under den första veckan och var framgångsrik med cirka 40% av fisken. Som sådan, finns det inte ett absolut krav för tre injektioner, emellertid, när tre utförs graden av framgång överstiger 95%. Andra, vid injektion STZ i zebrafisk är det viktigt att nålen sätts så att avfasningen av nålen är helt inne i fisken för att möjliggöra korrekt dosering av lösningen måste dock försiktighet iakttas att den tränger för långt för att förhindra inre skador. När STZ eller kontroll lösning administreras fisken inkuberas vid en lägre temperatur (22 ° C - 24 & dt.ex., C). Vi kan inte över betona vikten av den reducerade temperaturen som utan den zebrafisk kommer att regenerera sina betaceller (STZ injiceras) och hyperglykemi inte effektivt kan induceras. Slutligen, i våra händer zebrafisk blodproppar mycket snabbt vilket förhindrar den nödvändiga kapillärverkan krävs för effektiv glukometer användning och därför har vi inte förespråkar användningen. Vi har funnit att den QuantiChrome analysen beskriven är inte bara den mest tillförlitliga men det enklaste att utföra och att undervisa laboratoriepersonal. Kollektivt tekniker som beskrivs i protokollet är inte svårt och om de lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas med de ovan beskrivna stegen generering av diabetes zebrafisk är allt annat än säker.

Det finns mycket få begränsningar i det förfarande som beskrivs i detta manuskript, men alla läkemedel inducerade modeller av sjukdomen alltid har kritiken av från målet effekter riktas mot dem. Vi hänvisar läsaren till vår första manuskript detailing denna modell som vi förutsatt 5 oberoende bevislinjer (inklusive direkta STZ injektion i fenor) som dokumenterar att det inte finns några från målet effekter av STZ 43. En annan potentiell begränsning kommer inte från själva förfarandet utan från det faktum att reagens för zebrafisk forskningen ännu inte i nivå med andra modellorganismer såsom möss. Lyckligtvis, eftersom zebrafisk alltmer används som en modell organism för mänsklig sjukdom denna brist håller snabbt avhjälpas.

Sammanfattningsvis, såsom beskrivs i inledningen, har zebrafisk modellen av diabetes mellitus beskrivs här flera fördelar jämfört med andra modellorganismer. Viktigt, gör det för undersökning av de rent epigenetiska komponenter som stödjer den metaboliska minne fenomen. Eftersom det beräknas att 400 miljoner människor kommer att drabbas av denna sjukdom känner vi att bidraget från studier som använder denna modell skulle kunna ha en betydande påverkan på människors hälsa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett forskningsanslag från Iacocca Family Foundation, Rosalind Franklin University nystartade fonder och National Institutes of Health Grant DK092721 (till RVI). Författarna vill tacka Nikki Intine stöd i manuskript beredning.

Materials

DAG FÖRFARANDE
1
3 DM = STZ injektion (350 mg / dl), Control = koksaltlösning injektion
5 DM = STZ injektion (350 mg / dl), Control = koksaltlösning injektion
12 DM = STZ injektion (350 mg / dl), Control = koksaltlösning injektion
19 DM = STZ injektion (350 mg / dl), Control = koksaltlösning injektion
21 Antingen utför analys av intresse för DM fisk eller fortsätta att göra MM grupper genom borttagande av STZ tryck.
51 Amputera Fenor 30 dagar efter den sista STZ injektion av kontroller, DM och STZ grupper i syfte att generera MM vävnad.
81 Re-amputera fenor alla grupper i vävnaden som växt mellan dag 51 och 81 för att utföra regenerering studie. Alternativt behandla fisk / vävnad med analysen av intresse.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. , (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. , (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. , (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. , (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).

Tags

Medicin Genetik genomik fysiologi anatomi medicinsk teknik metabolomik zebrafisk diabetes metabola minne vävnadsregenerering streptozocin epigenetik, Djurmodell diabetes mellitus diabetes läkemedelsutveckling hyperglykemi
En Zebrafish modell av diabetes mellitus och metabola Memory
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras… More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter