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Medicine

मधुमेह और मेटाबोलिक मेमोरी का एक zebrafish मॉडल

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

मेटाबोलिक स्मृति घटना है जिसके द्वारा मधुमेह जटिलताओं जारी रहती है और बाद भी बेरोक euglycemia pharmaceutically हासिल की है प्रगति है. यहाँ हम एक मधुमेह हो सकता zebrafish मॉडल जो अद्वितीय है कि यह चयापचय स्मृति के mitotically संक्रामक epigenetic घटकों के परीक्षा के लिए अनुमति देता है वर्णन

Abstract

मधुमेह mellitus वर्तमान में 346 मिलियन व्यक्तियों को प्रभावित करता है और यह करने के लिए 2030 तक 400 मिलियन वृद्धि का अनुमान है. दोनों प्रयोगशाला और बड़े पैमाने पर नैदानिक ​​परीक्षणों के साक्ष्य से पता चला है कि मधुमेह जटिलताओं प्रगति चयापचय स्मृति जब भी glycemic नियंत्रण pharmaceutically हासिल की है की घटना के माध्यम से बेरोक. जीन अभिव्यक्ति stably epigenetic परिवर्तन है जो न केवल कोशिकाओं और जीवों जल्दी पर्यावरण उत्तेजनाओं को बदलने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देने के माध्यम से बदल किया जा सकता है, लेकिन यह भी सेल की क्षमता मन्त्रणा करना "याद" एक बार इन मुठभेड़ों प्रोत्साहन निकाल दिया जाता है. जैसे, भूमिकाओं वर्तमान में जांच कर रहे हैं कि इन तंत्रों चयापचय स्मृति घटना में खेलने जा रहा है.

हम हाल ही में प्रकार मैं मधुमेह के एक zebrafish मॉडल के विकास की सूचना दी है और इस मॉडल की विशेषता है कि मधुमेह zebrafish दिखाने के लिए न केवल जुड़े परिवर्तन सहित ज्ञात माध्यमिक जटिलताओं प्रदर्शितमधुमेह रेटिनोपैथी, मधुमेह अपवृक्कता और बिगड़ा घाव भरने के साथ, लेकिन यह भी बिगड़ा दुम फिन उत्थान प्रदर्शन. इस मॉडल कि zebrafish करने के लिए अपने क्षतिग्रस्त अग्न्याशय पुनर्जीवित और एक euglycemic क्या प्रत्यारोपण के बाद मानव रोगियों में उम्मीद की जा करने के लिए इसी तरह राज्य को बहाल करने में सक्षम है में अद्वितीय है. इसके अलावा, दुम फिन विच्छेदन के कई दौर जुदाई और शुद्ध epigenetic प्रभाव के अध्ययन में पिछले मधुमेह राज्य से संभावित उलझी कारकों के बिना vivo प्रणाली में के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि euglycemia अग्नाशय के उत्थान के बाद हासिल की है, पंख उत्थान है और त्वचा के घाव भरने के मधुमेह माध्यमिक जटिलता अनिश्चित बनी हुई है. बिगड़ा फिन उत्थान के मामले में, इस विकृति बेटी पंख ऊतकों में पंख उत्थान के कई दौर के बाद भी बनाए रखा है. इन टिप्पणियों के एक अंतर्निहित epigenetic चयापचय स्मृति राज्य में मौजूदा प्रक्रिया को इंगित. यहाँ हम सफलतापूर्वक जनरल आवश्यक तरीके मौजूदमधुमेह और चयापचय मछली की स्मृति समूहों erate और इस मॉडल के लाभों पर चर्चा.

Introduction

मधुमेह (डीएम) एक गंभीर और बढ़ती स्वास्थ्य समस्या है कि कम जीवन प्रत्याशा में रोग विशिष्ट microvascular (रेटिनोपैथी, अपवृक्कता, न्युरोपटी, बिगड़ा हुआ घाव भरने) और (हृदय रोग और स्ट्रोक) macrovascular जटिलताओं 1 के कारण परिणाम है. एक बार शुरू की, मधुमेह जटिलताओं के लिए निर्बाध भी जब glycemic नियंत्रण 2,3 हासिल की है प्रगति जारी है और इस घटना चयापचय स्मृति या विरासत प्रभाव करार दिया गया है. इस घटना की उपस्थिति चिकित्सकीय "मधुमेह नियंत्रण और जटिलताओं परीक्षण (DCCT) से प्रगति की है और के बाद से कई अतिरिक्त नैदानिक ​​परीक्षणों 4,5,6,7,8,9,10 द्वारा समर्थित किया गया के रूप में 1990 के दशक के दौरान मान्यता प्राप्त किया गया था, 11,12,13,14. डीएम के पशु मॉडल मधुमेह जटिलताओं और चयापचय स्मृति के फिजियोलॉजी Patho संबंधित खोजों के लिए आलोचना की गई है. वास्तव में, मधुमेह की जटिलताओं के हठ 1 मधुमेह के एक कुत्ते मॉडल में लिखा गया थाजो रेटिनोपैथी के बाद से इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों और पशु मॉडल 15,16,17,18,19,20,21 में एक किस्म का उपयोग कर प्रयोगात्मक सबूत के कई लाइनों के द्वारा समर्थन किया गया है. इन अध्ययनों से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि लक्ष्य अंगों / कोशिकाओं के स्थायी असामान्यताओं (न्यायपालिका जीन अभिव्यक्ति सहित) में और mechanistically एक प्रारंभिक hyperglycemic अवधि परिणाम epigenome की भागीदारी से पता चलता है.

Epigenomes एक दिया सेल प्रकार के लिए सभी chromatin संशोधनों से मिलकर बनता है और एक सेल अद्वितीय जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए जिम्मेदार हैं. गुणसूत्र संशोधनों विकास, समर्थन सेल भेदभाव के दौरान गतिशील हैं, बाहरी उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी हैं, mitotically stably रहे हैं 22,23 विरासत में मिला है और 24,25,26 रोग में बदला जा सकता है. इन epigenetic तंत्र में शामिल हैं: translational histone संशोधनों, गैर विहित octomers में histone variant शामिल किए जाने, chromatin डीएनए मेथिलिकरण के माध्यम से उपयोग परिवर्तन, और जीन पोस्टसूक्ष्म RNAs 27,28,29,30 गैर - कोडिंग के माध्यम से अभिव्यक्ति नियंत्रण. कुल मिलाकर, epigenetic प्रक्रियाओं कोशिकाओं / जीवों जल्दी पर्यावरण उत्तेजनाओं 31,32,33 को बदलने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं, वे भी सेल के लिए क्षमता के लिए "याद" एक बार इन मुठभेड़ों प्रोत्साहन 23,22 निकाल दिया जाता है प्रदान करते हैं. इसलिए, के रूप में बदल जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल epigenetic प्रक्रियाओं से उत्पन्न संकेत के अभाव (s) है कि उन्हें शुरू की में स्थिर कर रहे हैं और कोशिका विभाजन के माध्यम से पैतृक, वे अंतर्निहित चयापचय स्मृति सहित मानव विकृतियों के आणविक तंत्र के रूप में महान ब्याज अर्जित किया है. परिणाम है कि डीएम और अन्य रोगों epigenetic hyperglycemia द्वारा प्रेरित परिवर्तन की एक बहुतायत है कि कोशिकाओं के transcriptional नेटवर्क में उल्लेखनीय लगातार परिवर्तन (34,35,36,37,38 में समीक्षा) के कारण में समानांतर प्रगति epigenetics के संदर्भ में उभर रहे हैं.

zebrafish लंबे समय से एक प्रमुख मॉडल छात्रों के जीव किया गया हैवि हड्डीवाला विकास लेकिन पिछले 15 वर्षों के मानव रोग के अध्ययन के लिए इस जीव के उपयोग में एक घातीय वृद्धि 39. देखा गया है. मानव रोग के Zebrafish मॉडल आनुवंशिक विकारों और अधिग्रहीत रोग 40,41,42 सहित मानव विकृतियों की एक विस्तृत श्रृंखला फैले स्थापित किया गया है. अन्य हड्डीवाला मॉडल जीवों पर zebrafish के कई फायदे उच्च उपजाऊपन, लघु पीढ़ी समय, जल्दी वयस्कता के माध्यम से पारदर्शिता, कम आवास की लागत और जीन हेरफेर के लिए उपकरणों की एक सरणी शामिल हैं. इसके अलावा, रीढ़ और उच्च throughput दवा चोकर प्रदर्शन करने की क्षमता के बीच आनुवंशिक और सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान के रास्ते में से एक व्यापक संरक्षण के कारण, zebrafish सफलतापूर्वक किया गया है दवा की खोज के लिए इस्तेमाल किया.

हम प्रकार मैं मधुमेह मधुमेहजनक दवा, streptozocin का उपयोग हो सकता है की एक वयस्क zebrafish मॉडल विकसित किया है. हम इस मॉडल की विशेषता है कि मधुमेह zebrafish नहीं दिखाने केटी केवल ज्ञात मानव माध्यमिक जटिलताओं को प्रदर्शित करते हैं, लेकिन इसके अलावा में, hyperglycemic वातावरण का एक परिणाम के रूप में प्रदर्शन बिगड़ा अंग उत्थान (दुम फिन पुनर्जनन). इसके अतिरिक्त, हम सूचित किया है कि hyperglycemic zebrafish सामान्य glycemia वापस दवा अंतर्जात अग्नाशय बीटा एक physiologically सामान्य glycemic राज्य में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के उत्थान के कारण हटाने के 2 हफ्तों के भीतर वापस. हालांकि, इसके विपरीत में, इन मछलियों में अंग उत्थान उसी हद तक बिगड़ा रहता तीव्र मधुमेह का संकेत राज्य के रूप में इस समस्या बनी रहती है और चयापचय स्मृति की संभावना है. इस मॉडल के उत्पादन के लिए मुख्य प्रेरणा कि पिछले hyperglycemic पर्यावरण की पृष्ठभूमि शोर के अभाव में चयापचय स्मृति घटना का समर्थन mitotically स्थिर epigenetic घटकों का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करने के लिए गया था. प्रोटोकॉल के समापन पर यहाँ प्रदान zebrafish और या चुनिंदा ऊतकों किसी भी resea के लिए उपयुक्त परख द्वारा संसाधित किया जा सकता हैrchers की जरूरत है. हम सफलतापूर्वक इस प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है डीएनए मेथिलिकरण में जीनोम चौड़ा लगातार परिवर्तन hyperglycemia द्वारा प्रेरित है कि चयापचय स्मृति 21 राज्य में रखा जाता है की पहचान.

हमें लगता है कि मैं प्रकार मधुमेह के इस zebrafish मॉडल चयापचय स्मृति की जांच के लिए कई अभिनव अन्य मॉडल प्रणाली से अधिक लाभ है. 1) हमारे अध्ययन के सभी vivo में आयोजित किया जा सकता है और के रूप में पिछले hyperglycemic मछली अंतर्जात इंसुलिन के उत्पादन के उत्थान माध्यम से euglycemia के लिए वापस, वे exogenous इंसुलिन इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है. इसलिए, इस उलझी spikes और glycemic नियंत्रण में घाटियों कि exogenous इंसुलिन की आवश्यकता पशुओं में हो सकता है से बचा जाता है. 2) के रूप में ऊपर वर्णित है, पिछले मधुमेह राज्य (यानी उन्नत glycation अंत उत्पादों और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों मार्करों की निरंतर उपस्थिति) से पृष्ठभूमि उत्तेजना का सफाया कर रहे हैं और इसलिए एक विशुद्ध रूप से epig की जांच कर सकते हैंचयापचय स्मृति के enetic कारकों. 3) प्रयोगों तेजी से किया जा सकता है के रूप में यह चयापचय स्मृति परीक्षा तक मधुमेह प्रेरण से लगभग 80 दिन लगते हैं. ) 4 दुम फिन उत्थान प्रयोगात्मक बहुत approachable और आसान आनुवंशिक और प्रयोगात्मक हेरफेर है जो वहाँ के लिए उपकरणों का एक विशाल सरणी के लिए अनुमति देता है. ) 5 दुम फिन उत्थान के लिए एक बहुत ही सरल और quantifiable चयापचय स्मृति का आकलन और इसलिए भविष्य दवाओं की खोज के लिए अनुमति देगा विधि प्रदान करता है.

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं में "प्रयोगशाला पशु की देखभाल के सिद्धांतों" के रूप में वर्णित दिशा निर्देशों (स्वास्थ्य प्रकाशन के राष्ट्रीय संस्थानों 85-23 नहीं, 1985 संशोधित) और अनुमोदित Rosalind फ्रेंकलिन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं और समिति पशु 08-19 प्रोटोकॉल का उपयोग करें.

वहाँ 2 महत्वपूर्ण कोड है कि इस पांडुलिपि में उपयोग किया जाता है. 1) डीएम: मछली को संदर्भित करता है कि एक तीव्र (300 मिलीग्राम / डेसीलीटर) hyperglycemic राज्य में कर रहे हैं और कम से कम 3 सप्ताह के लिए किया गया है. 2) एम.एम.: मछली है कि 21 दिन थे (देखें प्रोटोकॉल) डीएम मछली और अग्नाशय के उत्थान के माध्यम से glycemic नियंत्रण बहाल करने की अनुमति के लिए संदर्भित करता है. इस दवा को हटाने के (14) दिनों के भीतर हासिल की है. मछली इस बिंदु से आगे एम.एम. मछली माना जाता है. यह भी महत्वपूर्ण है कि नियंत्रण के रूप में जाना जाता हैं कि मछली नोट हूबहू या इंजेक्शन की संख्या के मामले में डीएम एम.एम. मछली (केवल खारा), विभिन्न तापमान पर ऊष्मायन समय और संख्या और समय के रूप में इलाज कर रहे हैंदुम फिन amputations की.

1. Zebrafish की मधुमेह, डीएम मछली के साथ पीढ़ी

  1. दोनों वसूली और चतनाशून्य करनेवाली औषधि पानी के टैंक तैयार. रिकवरी पानी सामान्य मछली पानी है. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के पानी के लिए पर्याप्त जोड़ने के 2-phenoxyethanol तो कि सामान्य मछली पानी में एक 1:1,000 कमजोर पड़ने हासिल की है.
  2. 0.09% सोडियम क्लोराइड के 2 मिलीलीटर STZ के 6 मिलीग्राम जोड़ने और तुरंत बर्फ पर समाधान जगह streptozocin (STZ) के 0.3% समाधान (एक धूआं हुड में) तैयार. यह लगभग 20 मिनट में 20 मछली के इंजेक्शन के लिए पर्याप्त इंजेक्शन समाधान प्रदान करेगा. अगर आप 20 मिनट के निशान से अधिक है, बंद करो, और आगे बढ़ने से पहले एक ताजा STZ समाधान. नियंत्रण मछली के लिए एक अलग ट्यूब अशेष भाजक पर्याप्त नमकीन घोल. एक बार STZ solubilized बाद के सभी चरणों का धूआं हुड उपयोग की आवश्यकता नहीं है.
  3. एक आधा सीसी STZ या नियंत्रण सुनिश्चित करना है कि कोई हवाई बुलबुले फंस रहे हैं समाधान के साथ एक 27 1/2 गेज सुई के साथ सुसज्जित सिरिंज भरें.
  4. AnestheTize को प्रत्येक मछली व्यक्तिगत चतनाशून्य करनेवाली औषधि पानी में मछली डाल द्वारा और जब तक उनके तैराकी गति इंतजार रहता है (1-2 मिनट).
  5. एक बार anesthetized संक्षिप्त एक कागज तौलिया पर मछली की जगह किसी भी अतिरिक्त पानी को अवशोषित करने के लिए जगह है, नाव वजन में मछली और मछली के द्रव्यमान के उपाय.
  6. इंजेक्शन के लिए एक फर्म की सतह (पेट्री डिश ढक्कन) पर मछली रखें.
  7. मछली के peritoneal गुहा में बेवल अतीत ventral peritoneum के पीछे पहलू में सुई डालने से STZ या नियंत्रण समाधान इंजेक्षन.
  8. 0.35 मिलीग्राम / छ (350 मिलीग्राम / किग्रा) STZ की प्रत्येक मछली और 0.3% निम्नलिखित तरीके से गणना की जा सकती आवश्यक समाधान की मात्रा के लिए दिया जाना चाहिए.
    1. 0.35 द्वारा मछली के बड़े पैमाने पर (छ) गुणा मिलीग्राम में STZ की राशि की आवश्यकता उपज.
    2. 3 से ऊपर उत्पन्न करने के लिए 0.3% μl में इंजेक्शन के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा उपज उत्पाद विभाजित.
      नमूना: एक 0.5 ग्राम मछली के लिए: एक) 0.5 x 0.35 = 0.175 ख) ०.०१७५ / 3 = 0.058 मिलीग्राम= 58 μl.
      STZ बिना ही मात्रा एक नियंत्रण मछली के लिए इंजेक्शन किया जाएगा. मछली प्रति जन इंजेक्षन के संस्करणों के लिए एक चादर और त्वरित संदर्भ के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  9. निम्न इंजेक्शन वसूली पानी की टंकी में मछली की जगह है और उन्हें सामान्य तैराकी गतिविधि के लिए निगरानी. एक बार यह मछली हासिल किया गया है कि 22 के कम तापमान रेंज पर बनाए रखा है एक सामान्य रहने टैंक को हस्तांतरित कर रहे डिग्री सेल्सियस - 24 डिग्री सेल्सियस यह कम तापमान hyperglycemia के कुशल प्रेरण (मधुमेह, डीएम) के लिए महत्वपूर्ण है.
  10. Zebrafish हालांकि hyperglycemia पहले इंजेक्शन के 24 घंटे के भीतर पता चला है, बहुत ही उच्च hyperglycemia के क्रम में एक लंबे समय तक राज्य को उत्पन्न करने के लिए आवश्यकता होती है एक लगातार इंजेक्शन शामिल चरण साप्ताहिक रखरखाव इंजेक्शन द्वारा पीछा के रूप में नीचे दिखाया गया है.

1 सप्ताह: 3 (1 दिन, 3, 5) इंजेक्शन, 2 सप्ताह: 1 (12 दिन) इंजेक्शन, 3 सप्ताह: 1 इंजेक्शन (19 दिन),
सप्ताह 4: (21 दिन) प्रदर्शनब्याज की परख.

इस बिंदु पर zebrafish hyperglycemia के एक लंबे समय तक राज्य में किया गया है माना जाता है और मधुमेह जटिलताओं प्रदर्शन रेटिनोपैथी अपवृक्कता, और भी बिगड़ा फिन उत्थान के. डीएम मछली के रूप में करने के लिए भेजा जाता है. इसके अतिरिक्त अगर वांछित मछली साप्ताहिक रखरखाव इंजेक्शन के साथ hyperglycemic राज्य में बनाए रखा जा सकता है. इस प्रक्रिया के दौरान लगभग 5% की मौत की उम्मीद की जानी चाहिए.

2. रक्त संग्रह और उपवास रक्त ग्लूकोज (FBGL) स्तर निर्धारण

  1. डीएम और नियंत्रण मछली के प्रत्येक समूह के लिए पर्याप्त सही समूह की औसत FBGL निर्धारित इस परख के रूप में इन मछलियों का बलिदान करने की आवश्यकता है मछली को शामिल करना चाहिए.
  2. प्रत्येक बाँझ सामान्य नमक के 5 μl युक्त रक्त नमूने के लिए तैयार एक लेबल पीसीआर ट्यूब.
  3. रक्त संग्रह के लिए, इसके बाद के संस्करण के रूप में मछली anesthetize, सब पानी को निकालने के लिए, एक खुर्दबीन स्लाइड पर मछली जगह और एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए, मछली के सिर को हटानेoperculum के आधार पर.
  4. (2 μl) रक्त कि स्लाइड पर मछली से जारी है और जल्दी से इसे बाँझ सामान्य नमक के 5 μl pipetting और नीचे यकीन है कि रक्त रोकना नहीं करता बनाना जोड़ लीजिए. तुरंत बर्फ पर नमूना जगह है.
  5. तरल की कुल मात्रा को मापने के द्वारा खून का नमूना मात्रा (खारा + रक्त) का निर्धारण और फिर बाहर खारा के 5 μl subtracting.
  6. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब से एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में पतला खून की 5 μl और हस्तांतरण रक्त ग्लूकोज एकाग्रता का निर्धारण QuantiChrome ग्लूकोज परख किट का उपयोग कर. यह बिना किसी अपवाद के निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करके किया जाता है. सामान्य नियंत्रण / 60 मछली mg / dl और डीएम मछली 310 mg / dl: परिणाम की उम्मीद है.

3. दुम फिन उत्थान अध्ययन

  1. मछली anesthetize 1.0-1.4 में वर्णित है.
  2. एक पेट्री डिश ढक्कन पर प्लेस मछली और एक सीधी रेखा में दुम फिन काटना एक बाँझ आकार का उपयोग10 स्केलपेल 1 lepidotrichia शाखाओं बिंदु जबकि एक विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से पंख देख समीपस्थ.
  3. मछली 1.10 के रूप में ठीक करने के लिए, लेकिन परख के पुनर्योजी विकास के चरण के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर मछली जगह की अनुमति दें. यह त्वरित फिन उत्थान के विश्लेषण के लिए एक स्थापित तापमान है.
  4. पंख के बाद किसी भी समय विच्छेदन पर imaged किया जा सकता है लेकिन हम नियमित रूप से 28, 24, और 72 घंटे में पार अनुभाग के बाद पुनर्योजी विकास की जांच.
  5. पहले के रूप में मछली anesthetize (1.0-1.4 देखें), एक कैमरा (हम एक SMZ-1500 Nikon एक कैमरा क्यू इमेजिंग के साथ सुसज्जित) के साथ सुसज्जित एक विदारक खुर्दबीन के नीचे मछली की जगह है और एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर के साथ 1X बढ़ाई सभी पंख छवियों को इकट्ठा . पंख के लिए इमेजिंग प्रसार किया जाना चाहिए इतना है कि यह पूरी तरह से खींच या हानिकारक ऊतक के बिना बढ़ाया है और किसी भी पानी की बूंदों से मुक्त किया जाना चाहिए. स्थिरता के लिए हमेशा सही पृष्ठीय पक्ष जगह.
  6. छवियों प्रिंट और पुनर्योजी gro को मापने के लिएwth क्षेत्र छवि जम्मू सॉफ्टवेयर और एक ड्राइंग पैड का उपयोग का उपयोग कर. नए विकास के पूरे क्षेत्र के आसपास का पता लगाने और क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए. प्रत्येक माप पांच बार किया जाना चाहिए और अनुरेखण की सटीकता को सुनिश्चित करने के लिए औसत. यह महत्वपूर्ण है कि इस्तेमाल किया छवियों छाया या पानी की बूंदों के रूप में इन परिणाम क्षेत्र को मापने में त्रुटियों के लिए योगदान करते हैं.
  7. अक्ष पृष्ठीय उदर साथ विच्छेदन साइट की लंबाई मापने के लिए और इस माप से 3.6 में निर्धारित क्षेत्र विभाजित. यह विभिन्न आकारों की मछली सीधे की तुलना करने के लिए अनुमति देता है.

4. मेटाबोलिक मेमोरी Zebrafish (एम एम) का सृजन

  1. डीएम मछली और उनके उचित नियंत्रण के रूप में खंड 1 में वर्णित के एक समूह आरंभ.
  2. समूह के एक सबसेट के लिए 21 दिनों में FBGL निर्धारित किया गया है और 2 उपसमूहों में डीएम मछली विभाजित. एक प्रयोग की अवधि के लिए डीएम के नियंत्रण के रूप में समूहों के लिए जारी साप्ताहिक STZ इंजेक्शन. STZ इंजेक्शन 2 समूह और incubat के लिए संघर्षई सामान्य तापमान पर मछली. 14 दिनों के भीतर इन zebrafish सामान्य रक्त इंसुलिन और ग्लूकोज अग्न्याशय उत्थान के माध्यम से नियंत्रण को बहाल करेंगे. ये मछली अब एम.एम. (चयापचय स्मृति मछली) कहा जाता है.
  3. दिन में 30 पोस्ट दवा हटाने नियंत्रण की दुम का पंख, 3.2 में वर्णित विधि के माध्यम से डीएम और एम.एम. मछली काटना.
  4. पानी की स्थिति सामान्य करने के लिए 30 दिनों के लिए फिन उत्थान के लिए मछली लौटें. यह क्या हम शब्द, चयापचय स्मृति ऊतक के विकास की अनुमति देता है.
  5. 60 दिन में ऊतक है कि इस अवधि में 30-60 दिनों से पुनर्जीवित किया गया था के भीतर एक दूसरा विच्छेदन (के रूप में 3.2 में वर्णित) प्रदर्शन और दुम फिन उत्थान (3.1-3.7) परख प्रदर्शन चित्रा 1.
  6. ऊतक अलग और ब्याज की परख करते हैं. एक प्रोटोकॉल सारांश के लिए 1 टेबल देखें.

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Representative Results

भ्रष्ट दुम फिन उत्थान: मैं न केवल मधुमेह zebrafish रेटिनोपैथी और अपवृक्कता के ज्ञात माध्यमिक जटिलताओं को प्रदर्शित करने के लिए, लेकिन यह भी एक अतिरिक्त जटिलता एक्ज़िबिट लिखें. यह बाद और मछली में चयापचय स्मृति है कि एक hyperglycemic अवधि के बाद सामान्य ग्लूकोज नियंत्रण बहाल कर दिया है की वजह से जटिलता बनी हुई है. 2A चित्रा (नियंत्रण) और चित्रा 2B (चयापचय स्मृति) regenerating पंख है कि 72 घंटे के बाद विच्छेदन पर कब्जा कर लिया गया के प्रतिनिधि छवियों में प्रस्तुत कर रहे हैं. घाटा और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है के रूप में चित्रा 2C डीएम और एम.एम. zebrafish में 72 घंटे में लगभग 40% की एक कमी प्रदर्शन जब मछली नियंत्रण की तुलना दिखाया. हालांकि चित्रा 2C में शामिल डेटा 90 दिनों में समाप्त होता है इस एक ही हानि 150 दिनों के रूप में बाहर कर दिया गया है के रूप में दूर से मनाया.

तालिका 1. प्रोटोकॉल सारांश.

चित्रा 1
चित्रा 1. कार्टून चयापचय स्मृति प्रयोगों के लिए विच्छेदन साइटों चित्रण नीले रंग ऊतक कि पिछले hyperglycemic राज्य को उजागर किया गया था का प्रतिनिधित्व करता है. हरे रंग ऊतक इंगित करता है कि 30-60 दिनों के बाद से hyperglycemia हो गया था. काले बिंदीदार रेखा इंगित करता है 1 विच्छेदन 30 दिन और लाल में प्रदर्शन साइट एक संभावित विच्छेदन साइट इंगित करता है कि 60 दिनों में हो जाएगा.

चित्रा 2
चित्रा 2. दुम फिन पुनर्जनन मधुमेह (डीएम) और मेटाबोलिक मेमोरी (एम एम) Zebrafish में कम है. एक प्रतिनिधि एक नियंत्रण से दुम फिन छवि ए मछली इंजेक्शन reg की एक सामान्य राशि दिखाenerative विकास 72 घंटा पोस्ट विच्छेदन. सफेद बिंदीदार रेखा विच्छेदन विमान का प्रतिनिधित्व करता है और गुलाबी ठोस लाइन पुनर्योजी परिणाम demarks. उत्थान की राशि गुलाबी और सफेद सफेद पंख आकार मतभेद मानक के अनुसार लाइन की लंबाई से विभाजित लाइनों के भीतर निहित क्षेत्र का पता लगाने के द्वारा निर्धारित किया जाता है बी एक प्रतिनिधि या तो डीएम या एम.एम. से दुम फिन छवि पुनर्योजी विकास की एक कम राशि illustrating 72 घंटा पोस्ट विच्छेदन. लाइनों और क्षेत्र मापन पैनल डीएम और एम.एम. zebrafish के रिश्तेदार उत्थान दर के रूप में नियंत्रण की तुलना में ए सी. ग्राफिक प्रस्तुति के लिए के रूप में एक ही कर रहे हैं. 72 घंटा डीएम और एम.एम. zebrafish पुनर्योजी परिणाम के रिश्तेदार प्रतिशत (100% पर निर्धारित नियंत्रण करने के लिए) दिखाया गया है. दर्शाया दिनों में समय के सापेक्ष है जब STZ प्रशासन चयापचय स्मृति समूह के लिए रोका गया था. कई शोधकर्ताओं ने इन आंकड़ों उत्पन्न करने के लिए और अधिक समूह प्रति 1,000 मछली शामिल. <strong> चित्रा 2A और चित्रा 2B ऑलसेन एट अल 43 से अनुमति के साथ रूपांतरित किया गया.

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Discussion

मधुमेह mellitus चयापचय dysregulation का एक रोग, शुरू hyperglycemia, कि अंततः रक्त वाहिका जो सभी के बाद भी जारी रहती है euglycemia दवा हस्तक्षेप हासिल की है हालांकि कई जटिलताओं के लिए अग्रणी नुकसान में परिणाम के रूप में निदान है. जटिलताओं के इस हठ चयापचय स्मृति और कई हाल ही के अध्ययन के रूप में भूमिका की जांच की है है कि epigenetic तंत्र इस घटना में खेलने के लिए जाना जाता है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि दोनों तीव्र मधुमेह और चयापचय (बहाल ग्लूकोज नियंत्रण) स्मृति zebrafish की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है विस्तृत है. हम आगे वर्णित पद्धति है कि पिछले मधुमेह राज्य की संभावित उलझी घटकों से epigenetic योगदान को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता. हम जोर मछली हित के किसी भी विशेष शोधकर्ता और इसलिए भविष्य में खोज के लिए नीचे की ओर आवेदन अंतहीन हैं परख के साथ किसी भी बिंदु पर जांच की जा सकती है कि कामना करते हैं.

वहाँई प्रोटोकॉल में कई कदम है कि कुछ आगे की चर्चा और जोर वारंट हैं. हमारे अनुभव में समाधान में 0.3% STZ कमजोर होती है और लगभग 20 मिनट के बाद अपने प्रभाव खो देता है. इसलिए हमारा सुझाव है कि एक टाइमर का इस्तेमाल किया और एक ताजा समाधान 20 मिनट के अंतराल पर किया जा. हमारी प्रारंभिक मधुमेह zebrafish उत्पन्न करने के प्रयास के दौरान हम केवल पहले सप्ताह के दौरान एक इंजेक्शन का उपयोग कर और मछली का लगभग 40% के साथ सफल रहे थे. जैसे, वहाँ तीन इंजेक्शन के लिए एक सख्त आवश्यकता नहीं है, लेकिन, जब तीन प्रदर्शन कर रहे हैं सफलता की दर 95% से अधिक है. दूसरे, जब zebrafish में इंजेक्शन लगाने STZ यह महत्वपूर्ण है कि सुई डाला जाता है जैसे कि सुई के बेवल मछली समाधान के समुचित वितरण के लिए अनुमति देने के अंदर पूरी तरह से है, लेकिन, सावधानी लिया जा सकता है कि यह भी दूर करता घुसना चाहिए आंतरिक नुकसान को रोकने के लिए. एक बार STZ या नियंत्रण समाधान मछली प्रशासित है एक कम तापमान (22 पर incubated डिग्री सेल्सियस - 24 और घजैसे, सी). हम पर कम तापमान के महत्व पर जोर नहीं इसके बिना zebrafish पुनर्जीवित करेंगे अपने बीटा कोशिकाओं (STZ इंजेक्शन) और hyperglycemia कुशलता से नहीं प्रेरित कर सकते हैं कर सकते हैं. अन्त में, हमारे हाथ zebrafish रक्त में बहुत जल्दी थक्के जो आवश्यक केशिका कुशल glucometer उपयोग के लिए आवश्यक कार्रवाई रोकता है और इसलिए हम उनके उपयोग की वकालत नहीं करते. हमने पाया है है कि वर्णित QuantiChrome परख केवल सबसे विश्वसनीय नहीं है, लेकिन सबसे आसान करने के लिए और प्रयोगशाला कर्मियों को पढ़ाने. सामूहिक रूप से प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकों मुश्किल नहीं हैं और अगर उचित सावधानियों मधुमेह zebrafish की पीढ़ी के ऊपर वर्णित चरणों के साथ लिया जाता है सभी लेकिन आश्वासन दिया है.

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रिया के भीतर बहुत कुछ सीमाएँ हैं, लेकिन बीमारी के सभी दवा प्रेरित मॉडल हमेशा से लक्ष्य उन पर लगाए गए प्रभाव की आलोचना कर रहे हैं. हम हमारे प्रारंभिक पांडुलिपि Detailin पाठक का उल्लेखछ इस मॉडल के रूप में हम सबूत के 5 स्वतंत्र लाइनों (पंख में प्रत्यक्ष STZ इंजेक्शन सहित) का दस्तावेजीकरण है कि वहाँ 43 STZ का कोई बंद लक्ष्य प्रभाव प्रदान की है. एक अन्य संभावित सीमा प्रक्रिया से ही है, लेकिन तथ्य यह है कि अभी तक zebrafish अनुसंधान के लिए अभिकर्मकों चूहों के रूप में अन्य मॉडल जीवों के स्तर पर नहीं कर रहे हैं से नहीं आया है. सौभाग्य से, के रूप में zebrafish तेजी से मानव रोग के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है इस कमी को जल्दी से किया जा रहा है remedied है.

सारांश में, के रूप में परिचय में विस्तृत, मधुमेह के zebrafish मॉडल यहाँ वर्णित अन्य मॉडल जीवों पर कई फायदे हैं. महत्वपूर्ण बात है, यह विशुद्ध रूप से epigenetic घटकों है है कि चयापचय स्मृति घटना का समर्थन की परीक्षा के लिए अनुमति देता है. के रूप में यह अनुमान है कि 400 मिलियन लोगों को इस विकार के साथ पीड़ित हो जाएगा हमें लगता है कि इस मॉडल का उपयोग अध्ययन से योगदान मानव स्वास्थ्य पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम Iacocca परिवार फाउंडेशन, Rosalind फ्रेंकलिन विश्वविद्यालय धन शुरू हुआ, और स्वास्थ्य अनुदान DK092721 के राष्ट्रीय संस्थान (RVI) से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों के लिए पांडुलिपि तैयार करने में सहायता के लिए निकी Intine धन्यवाद करना चाहते हैं.

Materials

दिवस प्रक्रिया
1
3 डीएम = STZ इंजेक्शन (350 मिलीग्राम / डेसीलीटर), नियंत्रण = खारा इंजेक्शन
5 डीएम = STZ इंजेक्शन (350 मिलीग्राम / डेसीलीटर), नियंत्रण = खारा इंजेक्शन
12 डीएम = STZ इंजेक्शन (350 मिलीग्राम / डेसीलीटर), नियंत्रण = खारा इंजेक्शन
19 डीएम = STZ इंजेक्शन (350 मिलीग्राम / डेसीलीटर), नियंत्रण = खारा इंजेक्शन
21 या तो डीएम मछली के लिए ब्याज की परख करते हैं या STZ दबाव को हटाने के द्वारा एम.एम. समूह बनाने के लिए आगे बढ़ना है.
51 नियंत्रण के अंतिम STZ इंजेक्शन के बाद 30 दिन, डीएम और STZ समूहों के क्रम में एम.एम. ऊतक उत्पन्न पंख काटना.
81 ऊतक में सभी समूहों है कि 51 और 81 दिन के बीच हो गया था उत्थान अध्ययन करने के पुन काटना पंख. वैकल्पिक रूप से ब्याज की परख के साथ मछली / ऊतक का इलाज.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

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References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. , (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. , (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. , (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. , (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).

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Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

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