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Medicine

당뇨병과 신진 대사 메모리의 Zebrafish 모델

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

신진 대사 메모리는 당뇨병 합병증이 지속하고 euglycemia이 약물 달성 후에도 unimpeded 진행되는이 현상이다. 여기 우리는 신진 대사 메모리의 mitotically 보낼 수있는 epigenetic 구성 요소의 시험을 할 수 있다는 점에서 고유 한 당뇨병 zebrafish 모델을 설명

Abstract

당뇨병은 현재 346,000,000 개인에 영향을 미치는이는 2030 년까지 400,000,000로 증가 할 것으로 예상된다. 실험실과 대규모 임상 시험 모두에서 증거가 당뇨병 합병증이 진행이 글루 세믹 컨트롤이 약물 달성에도 신진 대사 메모리의 현상을 통해 unimpeded 것을 밝혔다. 유전자 발현이 안정적으로 세포와 생물 신속하게 환경 자극 변화에 대응하는 것을 허용하지 만 epigenetic 변화를 통해 변경뿐만 아니라 이러한 자극이 제거 한 번 발생 "기억"할 수있는 세포의 기능을 부여 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 메커니즘은 신진 대사 메모리 현상에서 재생하는 역할은 현재 검토되고있다.

우리는 최근 유형 I 당뇨병의 zebrafish 모델의 개발을보고와 관련 변경 사항을 포함 알려진 보조 합병증을 표시하지 해당 당뇨병 zebrafish를 표시하려면이 모델을 특징으로 한당뇨병 성 망막증, 당뇨병 nephropathy 및 장애자 상처 치유와뿐만 아니라 장애인 꼬리 지느러미 재생을 나타냅니다. 이 모델은 zebrafish가 손상된 췌장을 다시 생성 및 사후 이식 인간 환자에 예상되어지는 것과 유사한 euglycemic 상태를 복원 할 수 있다는 특징이다. 또한, 꼬리 지느러미 절단의 여러 라운드는 이전의 당뇨병 상태에서 잠재적 복잡한 요인이없는 생체 시스템에서의 순수한 epigenetic 효과의 분리 및 유학 수 있습니다. euglycemia은 췌장 재생에 따라 달성 있지만, 지느러미 재생 및 피부 상처 치유의 당뇨병 차 합병증이 무한정 지속된다. 장애인 지느러미 재생의 경우,이 병리학도 딸의 지느러미 조직의 지느러미 재생의 여러 라운드 후 유지됩니다. 이러한 관찰은 신진 대사 메모리 상태에서 기존의 기본 epigenetic 프로세스를 가리 킵니다. 여기 성공적으로 세대에게 필요한 방법을 제시생선의 당뇨병과 신진 대사 메모리 그룹을 제거했다이 모델의 장점에 대해 설명합니다.

Introduction

당뇨병 (DM)은 심각한 성장하는 건강 문제입니다 질병 특정 microvascular (성 망막증, nephropathy, 신경 장해, 장애 상처 치유)와 macrovascular (심장 질환과 뇌졸중) 합병증이 1 인해 감소 수명 결과입니다. 일단 시작, 당뇨 합병증은 글루 세믹 컨트롤이 2,3를 달성 경우에도 중단 발전을 계속하고 이러한 현상은 신진 대사 메모리 또는 기존 효과를 칭했다되었습니다. 이러한 현상의 존재는, "당뇨병 관리 및 합병증 시험 (DCCT)"진행하고 있기 때문에 여러 추가 임상 시험 4,5,6,7,8,9,10에 의해 지원 된과 1990 년대 초반 동안 임상 적으로 인정 받았습니다 11,12,13,14. DM의 동물 모델은 당뇨병 합병증 및 신진 대사 메모리의 patho - 생리학에 관한 발견에 중요했습니다. 사실, 당뇨병 합병증의 지속성 먼저 당뇨병의 개 모델에 문서화 된어떤 성 망막증은 이후 체외 문화 시스템 및 동물 모델 15,16,17,18,19,20,21에서 다양한을 사용하여 실험 증거의 여러 라인에 의해 지원되었습니다. 이러한 연구는 명확 대상 기관 / 세포의 영구적 인 이상 (비정상 유전자 발현 포함)과 mechanistically 초기 hyperglycemic 기간 결과가 epigenome의 참여를 제안하는 보여줍니다.

Epigenomes는 특정 세포 유형에 대한 모든 염색질 수정으로 구성되어 있으며 세포의 독특한 유전자 발현 프로파일에 대한 책임을 져야합니다. 염색체 개조, 개발, 지원 세포 분화 동안 동적 외부 자극에 민감하게 반응, mitotically 안정적으로 22,23을 계승하고 질병 24,25,26에서 변경 될 수 있습니다. 이러한 epigenetic 메커니즘은 다음과 같습니다 : 병진 히스톤 수정, octomers의 비표준 히스톤 변형 포함, DNA의 methylation을 통해 염색질 액세스 변경, 유전자를 게시마이크로 RNAs에게 27,28,29,30을 비 코딩을 통해 표현 제어 할 수 있습니다. 개의 epigenetic 프로세스가 세포 / 유기체를 신속하게 환경 자극 할 31,32,33 변화에 대응 할 수 있도록, 그들은 또한 이러한 자극은 23,22을 제거 한 번 발생 "기억"할 수있는 셀에 대한 능력을 부여. epigenetic 과정에서 발생하는 변경된 유전자 발현 프로필을 시작한 신호의 부재 (들)에 안정되어 있으며 세포 분열을 통해 물려 전할 수있는 아르 그러므로, 그들은 신진 대사 메모리를 포함한 인간 pathologies의 분자 메커니즘을 근간으로 큰 관심을 받고있다. DM 및 epigenetics 고혈당증에 의해 유도 epigenetic 변화의 과다는 세포의 전사 네트워크에서 놀라운 영구적 인 변경 사항 (34,35,36,37,38에서 검토)의 원인이 다른 질병에서 병렬 발전의 맥락에서 등장하고 결과를 표시합니다.

zebrafish은 오래 스튜에 최고의 모델 생물되었습니다마구 척추 개발하지만 지난 15 년은 인간의 질병 연구를 위해이 유전자를 활용의 기하 급수적 성장. 39 보여줬습니다. 인간의 질병의 Zebrafish 모델은 유전 적 장애와 획득 질병 40,41,42 등의 인간 pathologies의 다양한 걸쳐 설립되었습니다. 다른 척추 동물 모델 생물을 통해 zebrafish의 많은 장점은 높은 생산력, 짧은 세대 시간, 초기 성인기를 통해 투명성, 감소 주택 비용과 유전자 조작 도구의 배열이 포함되어 있습니다. 또한, vertebrates 높은 처리량 약물 검사를 수행 할 수있는 능력 간의 유전 적 경로 및 세포 생리학의 광범위한 보존으로 인해, zebrafish이 성공적으로 제약 검색에 사용되었습니다.

우리는 diabetogenic 약물, streptozocin을 사용하여 유형 I 당뇨병의 성인 zebrafish 모델을 개발했습니다. 우리는 당뇨병 zebrafish 께를 표시하려면이 모델을 특징 없습니다t는 알려진 인간의 보조 합병증을 표시하지만,뿐만 아니라, hyperglycemic 환경의 결과로 장애인 사지 재생 (꼬리 지느러미 재생)을 나타냅니다. 또한, 우리는 hyperglycemic의 zebrafish는 생리 학적으로 정상 글루 세믹 상태의 결과로 내생 췌장 베타 세포의 재생으로 인해 약물 제거의 2 주 이내에 정상으로 glycemia으로 되돌아 것으로보고있다. 이 합병증은 계속하고 신진 대사 메모리에 민감합니다 나타내는 급성 당뇨병 상태에서 그러나 반면,이 물고기의 사지 재생은 동일한 범위에 장애인 남아있다. 이 모델을 생성하기위한 주요 원동력은 이전 hyperglycemic 환경의 배경 소음이없는 상태에서 신진 대사 메모리 현상을 지원하는 mitotically 안정적인 epigenetic 구성 요소를 연구하는 시스템을 제공하는 것이 었습니다. 프로토콜의 결론에서 zebrafish 혹은 선택적 조직이 resea에 적합한 모든 분석에 의해 처리 될 수 있습니다 여기에 제공된rchers이 필요합니다. 우리는 성공적으로 신진 대사 메모리 상태 21 유지 고혈당증에 의해 유도 DNA의 methylation의 게놈 전체의 영구적 인 변경 사항을 확인하려면이 절차를 사용했습니다.

우리는 유형 I 당뇨병이 zebrafish 모델은 신진 대사 메모리를 검사에 대한 다른 모델 시스템을 통해 여러 가지 혁신적인 장점을 가지고 있다는 느낌이 듭니다. 1) 우리의 연구는 모두 생체 실시 할 수 있으며, 이전 hyperglycemic 물고기는 내생 인슐린 생산의 재생을 통해 euglycemia로 돌아갑니다으로, 그들은 외인성 인슐린 주사를 필요로하지 않습니다. 따라서이 외인성 인슐린을 필요로하는 동물에서 발생할 수있는 글루 세믹 컨트롤에서 복잡 스파이크와 계곡을 방지합니다. 2) 위의 설명에 따라 이전 당뇨병 상태 (즉, 고급 glycation 최종 제품과 반응성 산소 종 마커의 지속적인 존재)에서 배경 자극이 제거되며 따라서 하나는 순수 epig을 검사 할 수 있습니다으로신진 대사의 메모리 enetic 요인. 이 대사 메모리 검사까지 당뇨병 유도에서 약 80 일이 소요으로 3) 실험은 빠르게 수행 할 수 있습니다. 4) 꼬리 지느러미 재생이 실험적으로 매우 가까이 있으며, 도구의 광대 한 배열이되는 쉬운 유전 및 실험 조작 할 수 있습니다. 5) 꼬리 지느러미 재생는 신진 대사가 기억을 평가하고 따라서 미래의 약물 발견을위한 수있는 매우 간단하고 객관적 방법을 제공합니다.

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Protocol

모든 절차는 "실험실 동물 관리의 원칙"에 설명 된 지침 (보건 간행물의 국립 연구소 안돼. 85-23, 1985 개정) 및 승인 로잘린 프랭클린 대학 기관 동물 케어에 따라 수행하고위원회 동물에게 프로토콜 08-19을 사용하고 있습니다.

이 원고에 사용되는이 중요한 약어가 있습니다. 1) DM은 : 급성 (300 MG / DL) hyperglycemic 상태에 있고 적어도 3 주되었습니다 물고기를 의미합니다. 2) MM은 : (참조 프로토콜) DM 생선 21일 있었고, 췌장 재생을 통해 글루 세믹 제어를 복원 할 수 물고기를 의미합니다. 이것은 약물 제거의 (14) 일 이내에 이루어집니다. 생선이 시점 이후의 MM 물고기로 간주됩니다. 제어라고합니다 그 물고기에 유의하는 것도 중요 것은 DM 또는 MM 주사의 수 측면에서 물고기 (단 염분), 다양한 온도에서 배양 시간 및 번호와 타이밍으로 동일하게 처리됩니다꼬리 지느러미 절단의.

1. 당뇨병, DM 생선과 Zebrafish의 생성

  1. 복구 및 마취 물 탱크를 모두 준비합니다. 복구 물은 일반 생선 물입니다. 2 phenoxyethanol 너무 평범 물고기 물에 1:1,000 희석이 달성되는 충분한 추가 마취 물하십시오.
  2. 0.09 %의 나트륨 염화물의 2 ML에 STZ 6 MG를 추가하고 즉시 얼음에 솔루션을 배치하여 streptozocin (STZ)의 0.3 % 솔루션을 (퓸 배출 후드에서) 준비합니다. 이 20 분에서 약 20 생선의 분사에 대한 충분한 주입 솔루션을 제공 할 것입니다. 당신이 20 분 마르크를 초과하는 경우, 중지, 그리고하기 전에 새로운 STZ 솔루션을합니다. 제어 물고기에 대한 별도의 관 나누어지는만큼 생리 식염수합니다. STZ이 solubilized되면​​ 이후의 모든 단계는 연기 후드 사용을 요구하지 않습니다.
  3. 기포가 갇힌되지 않습니다 보장 STZ 또는 제어 솔루션과 27 2분의 1 게이지 바늘을 갖추고 ½의 CC의 주사기를 채우십시오.
  4. Anesthe마취 물에 물고기를 배치하여 개별적으로 물고기를 tize, 그들의 수영장 움직임이 (1-2 분) 중단 될 때까지 기다리십시오.
  5. 일단 anesthetized 간략하게 어떤 초과 물을 흡수하기 위해 종이 타월에 고기를 놓고, 보트의 무게에 생선을 넣고 생선의 질량을 측정합니다.
  6. 분사에 대한 확고한 표면 (페트리 접시 뚜껑)에 생선을 놓으십시오.
  7. 복부 복막의 뒤쪽 측면에 베벨 통과 바늘을 삽입하여 생선의 복막 캐비티에 STZ 또는 제어 솔루션을 주사.
  8. 0.35 MG / g는 STZ의 (350 밀리그램 / kg)은 각 생선 다음과 같은 방식으로 계산 될 수있다 필요한 0.3 % 솔루션의 볼륨으로 전달해야합니다.
    1. 필요 MG에서 STZ의 양을 산출하기 위해 0.35에 의해 물고기의 대량 (g)를 곱합니다.
    2. μl의 분사에 필요한 0.3 % 솔루션의 볼륨을 얻을 수 있도록 (3)에 의해 위에 생성 된 제품을 나눕니다.
      샘플 : 0.5 g 물고기를 들면 다음과 같습니다) 0.5 X 0.35 = 0.175 B) 0.0175 / 3 = 0.058 ML= 58 μl.
      STZ없이 동일한 볼륨 컨트롤 물고기 주입 될 것입니다. 생선 질량 당 삽입 할 볼륨에 대한 시트가 생성 및 빠른 참조를 사용해야합니다.
  9. 다음 주입은 복구 물 탱크에 물고기를 넣고 일반 수영장 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 일단이는 물고기를 달성 한 22의 감소 온도 범위에서 관리하고 있습니다 정상적인 생활 탱크에 전송됩니다 ° C - 24 ° C. 이 감소 온도는 고혈당증의 효율적인 유도 (당뇨병, DM)에 대한 중요합니다.
  10. 고혈당증은 매우 높은 고혈당증의 연장 상태를 유도하기 위해, 첫 번째 주사 후 24 시간 이내에 감지되지만 zebrafish는 아래 그림과 같이 자주 주입 유도 단계는 매주 유지 보수 주사 다음이 필요합니다.

주 1 : 3 주사 (일 1, 3, 5), 주 2 : 1 분사 (일 12), 주 3 : 1 분사 (일 19),
주 4 : (21 일째)가 수행관심 검정.

이 시점에서 zebrafish는 고혈당증의 연장 상태에 빠진 것으로 간주하고 성 망막증, nephropathy 있으며, 장애인 지느러미 중생의 당뇨 합병증을 전시하고 있습니다. 이러한 DM 물고기라고합니다. 원하는 경우 또한 생선은 매주 유지 보수 주사로 hyperglycemic 상태에서 유지 될 수 있습니다. 이 과정에서 약 5 %의 사망이 예상됩니다.

2. 혈액 수집 및 금식 혈당 수준 (FBGL) 결정

  1. DM 및 제어 물고기의 각 그룹이 분석이 물고기가 희생 될 필요로 정확하게 그룹의 평균 FBGL을 결정하기에 충분한 물고기를 포함해야합니다.
  2. 멸균 정상적인 생리의 5 μl를 포함하는 각 혈액 샘플에 대한 표시 PCR 튜브를 준비합니다.
  3. 혈액 수집를 들어, 위와 같이 물고기를 마취, 모든 물을 제거 현미경 슬라이드에 물고기를 넣고 메스를 사용하여 생선의 머리를 제거operculum의 기초에서.
  4. 슬라이드로 생선 출시 신속하게 혈액이 방해하지 않도록하고를 아래로 pipetting 멸균 정상적인 생리의 5 μl에 추가되어있는 피를 (최대 2 μl)를 수집합니다. 즉시 얼음에 샘플을 배치합니다.
  5. 액체의 총 양을 측정하여 혈액 샘플 량 (생리 + 피를) 결정하고 염분의 5 μl를 빼는.
  6. 1.5 ML의 microfuge 튜브에 각 PCR 튜브로부터 희석 혈액의 5 μl를 전송하고 QuantiChrome 혈당 분석 키트를 사용하여 혈당 농도를 결정한다. 이것은 예외없이 제조업체의 프로토콜에 따라 수행됩니다. 예상 결과 : 일반 / 제어 물고기 60 MG / DL 및 DM 물고기 310 MG / DL.

3. 꼬리 핀 재생 연구

  1. 1.0-1.4에 설명 된대로 물고기를 마취.
  2. 살균 크기를 사용 장소 페트리 접시 뚜껑에 생선과 직선의 꼬리 지느러미를 절단10 해부 현미경을 통해 지느러미를 보는 동안 첫 번째 lepidotrichia 브랜칭 지점에 인접 메스.
  3. 물고기는 1.10에서와 같이 복구하지만 분석의 재생 성장 단계에 대해 33 ° C에서 물고기를 게재 할 수 있습니다. 이 가속 지느러미 재생 분석을위한 설립 온도입니다.
  4. 핀은 그러나 우리가 일상적으로 횡단 섹션에 따라 24, 28, 72 시간에서 재생 성장을 검토하는 시간 후 절단에 이미징 할 수 있습니다.
  5. (1.0-1.4 참조) 이전처럼 생선을 마취, 카메라 (우리는 Q-이미징 카메라가 장착 된 니콘 SMZ-1500 사용)가 장착 된 해부 현미경으로 물고기를 넣고 NIS 요소 소프트웨어 1X 배율의 모든 지느러미 이미지를 수집 . 지느러미가 완전히 조직을 스트레칭하거나 손상시키지 않고 확장하고 물방울이 무료로해야합니다 있도록 이미지에 보급해야합니다. 일관성 항상 오른쪽에있는 등쪽면을 넣습니다.
  6. 이미지를 인쇄하여 재생 촉진제를 측정wth 지역 이미지 J 소프트웨어 및 그리기 패드의 사용을 사용합니다. 새로운 성장의 전체 주변 추적 및 지역을 결정합니다. 각 측정은 다섯 번 만들어 추적의 정확성을 보장하기 위해 평균해야합니다. 그것은 이러한 가지 영역을 측정 오류에 기여로 사용 이미지가 그림자 나 물방울이없는 것이 중요합니다.
  7. 등쪽 - 복부 축을 따라 절단 사이트의 길이를 측정하고이 측정에 의해 3.6에서 결정된 지역을 나눕니다. 이 다양한 크기의 물고기를 직접 비교 할 수 있습니다.

4. 신진 대사 메모리 (MM) Zebrafish의 생성

  1. DM 물고기와 제 1 절에 설명 된대로의 적절한 컨트롤의 그룹을 시작합니다.
  2. 21일에서 그룹의 하위 집합에 대한 FBGL를 결정하는 2 하위 그룹에 DM 물고기를 나눕니다. 실험 기간 동안 DM 컨트롤 같은 그룹 중 하나에 매주 STZ 주사를 계속합니다. 두 번째 그룹과 incubat에 대한 STZ 주입을 중지전자 정상 온도에서 생선. 14 일 이내에 다음과 zebrafish는 정상적인 혈액 인슐린과 포도당 췌장 재생을 통해 제어를 복원합니다. 이 물고기는 현재 MM (대사 메모리 물고기)라고합니다.
  3. 일 30 후 약물 제거 3.2에 설명 된 방법을 통해 물고기 DM 및 MM 관리의 꼬리 지느러미를 절단.
  4. 30 일 동안 지느러미 재생을위한 정상적인 물 조건에 생선을 반환합니다. 이 우리 용어, 대사 메모리 조직의 성장을 할 수 있습니다.
  5. 하루에 60 30~60일에서 시대에 생성 된 조직 내에서 두 번째 절단합니다 (3.2에서 설명)을 수행하고 꼬리 지느러미 재생 분석 (3.1-3.7) 그림 1을 수행합니다.
  6. 조직을 분리하고 관심 검정을 수행합니다. 프로토콜 요약에 대한 표 1을 참조하십시오.

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Representative Results

장애인 꼬리 지느러미 재생 : I 당뇨병 zebrafish뿐만 아니라 성 망막증과 nephropathy의 알려진 보조 합병증을 표시뿐만 아니라, 추가 합병증을 전시를 입력합니다. 이 후 합병증은 hyperglycemic 기간에 따라 정상적인 포도당 통제를 복원 한 물고기의 신진 대사 메모리로 인해 지속된다. 그림 2A (제어) 및 그림 2B (신진 대사 메모리) 72 시간의 포스트 절단에 캡처 된 재생 핀들의 대표 이미지에 표시됩니다. 적자는 계량 등 생선을 제어 할 수와 비교했을 때 72 시간에 약 40 %의 적자를 전시 그림 2C DM과 MM zebrafish에 표시 할 수 있습니다. 그림 2C에 포함 된 데이터를 90 일에 종료하지만이 같은 손상은 150 일간 아웃까지 관찰되었습니다.

표 1. 프로토콜 요약.

그림 1
1 그림. 만화는 신진 대사가 기억 실험에 대한 절단 사이트를 묘사. 푸른 색은 이전 hyperglycemic 상태로 노출 된 조직을 나타냅니다. 녹색 색상은 30~60일 게시물 고혈당증에서 재배 된 조직을 나타냅니다. 검은 점선은 하루 30 빨간색에서 수행 첫 번째 절단 사이트 60 일에 발생하는 잠재적 인 절단 사이트를 나타냅니다 나타냅니다.

그림 2
그림 2. 꼬리 지느러미 재생이 당뇨 (DM) 및 신진 대사 메모리 (MM) Zebrafish에서 감소된다. A. 제어의 대표 꼬리 지느러미 이미지는 등록의 정상적인 양을 보여주는 물고기를 주입enerative 성장 72 시간 포스트 절단. 흰색 점선은 절단 평면을 나타내며 분홍색 실선은 재생 가지를 demarks. 중생의 금액은 지느러미 크기 차이를 정상화 할 수있는 흰색 줄의 길이로 나누어 분홍색과 흰색 라인에 포함 된 영역을 추적에 의해 결정됩니다. B.는 재생 성장의 감소 금액을 도시 DM 또는 MM 중의 대표 꼬리 지느러미 이미지 72 시간 포스트 절단. 라인과 지역 측정 컨트롤에 비해 DM 및 MM zebrafish의 상대적 재생 속도 패널 A. C. 그래픽 프리젠 테이션에 대한 동일합니다. 72 시간의 DM과 MM zebrafish 재생 가지의 상대적 비율 (100 %로 설정 컨트롤) 표시됩니다. STZ 관리는 신진 대사 메모리 그룹에 중단되었을 때 묘사 일 시간은를 기준으로합니다. 이 데이터는 어디에서 여러 연구자들에 의해 생성하고 그룹의 1000 물고기를 통해 통합한다. <STRONG> 그림 2A와 그림 2B는 올슨 외 43에서 허가를 적응했다.

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Discussion

당뇨병은 처음 궁극적으로 euglycemia이 제약 개입 불구하고 달성 한 후 모든에도 계속 많은 합병증으로 이어지는 혈관 손상에 결과 고혈당증로 진단 신진 대사 dysregulation의 질병입니다. 합병증의 지속성은 신진 대사 메모리와 여러 가지 최근의 연구 epigenetic 메커니즘이 현상에서 재생하는 역할을 검토 한라고도합니다. 여기 급성 당뇨병과 신진 대사 메모리 (복원 포도당 제어) zebrafish 모두의 세대를 위해 할 수있는 프로토콜을 설명하고 있습니다. 우리는 더 이상 이전의 당뇨병 상태의 잠재적 복잡한 구성 요소에서 epigenetic 기부금을 분리하는 고용 할 수있는 방법을 설명했다. 우리는 물고기는 특정 연구원, 따라서 미래의 발견에 대한 다운 스트림 응용 프로그램이 무한 관심의 분석과 아무런 시점에서 검토 할 수 있습니다 강조하고 싶습니다.

군터e는 몇 가지 더 토론과 중점을 보증 프로토콜의 몇 가지 단계입니다. 우리의 경험에서 솔루션의 0.3 % STZ이 악화하고 약 20 분 후에 그 효과를 잃는다. 따라서 우리는 타이머가 사용하고 신선한 솔루션을 20 분 간격으로 변경하는 것이 좋습니다. 당뇨병 zebrafish를 생성하기위한 초기 시도하는 동안 우리는 첫 주 동안 한 주사를 사용하고 물고기의 약 40 %를 성공했다. 따라서 세 주사에 대한 엄격한 요구 사항이 없습니다하지만, 세 수행 할 때 성공의 속도는 95 %를 초과합니다. 둘째, zebrafish에 STZ를 주입 때 바늘이 바늘의 베벨 완전히 솔루션의 적절한 분배 할 수 있도록하는 물고기 안에있는 것과 같은 삽입하는 것이 중요합니다, 그러나,주의는 너무 멀리에 침투 않는 이동해야합니다 내부 손상을 방지한다. 일단 STZ 또는 제어 솔루션은 물고기를 관리하는 감소 된 온도 (22에서 incubated 아르 ° C - 24 & D예를 들어, C). zebrafish가 베타 세포 (STZ이 주입)과 고혈당증을 효율적으로 유도 할 수 재생성됩니다 그것 없이는 우리는 이상 감소 된 온도의 중요성을 강조 할 수 없습니다. 마지막으로, 우리 손 zebrafish의 혈액에 효율적으로 glucometer 사용에 필요한 필요한 모세관 현상을 방지하기 때문에 우리가 그들의 사용을 옹호되지 않는 매우 빨리 혈전. 우리는 설명 QuantiChrome 분석은 가장 신뢰할가 아닌 쉬운 수행하고 실험실 직원을 가르치는 것으로 나타났습니다. 이하 프로토콜에 설명 된 기법은 어렵지 있으며 적절한 예방 조치가 당뇨병 zebrafish의 생성 위에서 설명한 단계를 촬영하는 경우를 제외한 모든 보장합니다.

그러나 질병의 약물 유도 모델은 항상 그들을 파괴 오프 대상 효과의 비판이이 논문에서 설명하는 절차 내에서 매우 몇 가지 제한이 있습니다. 우리는 우리의 초기 원고 detailin로 독자를 참조우리는 STZ (43)의 더 오프 대상 효과가 없다는 것을 문서화 증거의 5 독립적 인 행 (핀에 직접 STZ 주입 포함)를 제공 g이 모델로. 또 다른 잠재적 인 제한은 절차 자체에서하지만, zebrafish 연구를위한 시약 이런 마우스와 같은 다른 모델 생물의 수준에서 아직 없습니다 사실에서 온하지 않습니다. zebrafish는 점점 인간의 질환 모델 생물로 사용되고 있기 때문입니다 다행히도,이 부족은 신속하게 해결하고 있습니다.

요약 등 도입에 설명, 여기에 설명 된 당뇨병의 zebrafish 모델은 다른 모델 생물 이상의 몇 가지 장점이 있습니다. 중요한 것은 신진 대사 메모리 현상을 지원하는 순수 epigenetic 구성 요소의 검사를 할 수 있습니다. 이 4 억 명의 사용자가 장애 시달리다 것으로 예상된다로서 우리는이 모델을 활용 연구의 기여는 인간의 건강에 큰 영향을 미칠 수 있다는 느낌이 듭니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 Iacocca 가족 재단, 로잘린 프랭클린 대학 시동 기금 및 건강 그랜트 DK092721 국립 연구소 (RVI까지)에서 연구 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 원고 준비에 도움을 니키 Intine 감사하고 싶습니다.

Materials

DAY 절차
1
3 DM = STZ 주입 (350 MG / DL), 제어 = 염분 주입
5 DM = STZ 주입 (350 MG / DL), 제어 = 염분 주입
12 DM = STZ 주입 (350 MG / DL), 제어 = 염분 주입
19 DM = STZ 주입 (350 MG / DL), 제어 = 염분 주입
21 어느 DM 물고기 관심 검정을 수행하거나 STZ 압력을 제거하여 MM 그룹을 만들기 위해 진행합니다.
51 컨트롤의 마지막 STZ 주입 후 30 일, DM 및 STZ 그룹 핀 MM 조직을 생성하기 위해을 절단.
81 재생 연구를 수행 할 일 51 81 사이에 재배 된 조직의 모든 그룹의 재 절단의 핀. 또는 관심의 분석과 함께 생선 / 조직을 취급합니다.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
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Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

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