Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Sebrafisk modell av diabetes mellitus og metabolsk Memory

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

Metabolsk minne er fenomenet der diabetiske komplikasjoner vedvarer og fremgang uhindret selv etter euglycemia oppnås farmasøytisk. Her beskriver vi en diabetes mellitus sebrafisk modell som er unikt ved at det gir mulighet for undersøkelse av mitotisk overførbare epigenetic komponenter av metabolsk minne

Abstract

Diabetes mellitus påvirker tiden 346 millioner individer, og dette er anslått å øke til 400 millioner innen 2030. Bevis fra både laboratoriet og storskala kliniske studier har avdekket at diabetiker komplikasjoner fremgang uhindret via fenomenet metabolsk minnet selv når glykemisk kontroll er farmasøytisk oppnådd. Genekspresjon kan stabilt endres gjennom epigenetic endringer som ikke bare tillater celler og organismer til å reagere raskt skiftende miljømessige stimuli men også gi muligheten av cellen å "huske" disse møter når stimulans er fjernet. Som sådan, er rollene som disse mekanismene spiller i den metabolske minne fenomenet nå undersøkt.

Vi har nylig rapportert utvikling av en sebrafisk modell av type I diabetes mellitus, og karakterisert denne modell for å vise at diabetisk sebrafisk ikke bare vise de kjente sekundære komplikasjoner inkludert endringer forbundetmed diabetisk retinopati, diabetisk nefropati, og nedsatt sårtilheling men også oppviser svekket halefinnen regenerering. Denne modellen er unik i at sebrafisk er i stand til å regenerere sin skadede bukspyttkjertelen og gjenopprette en euglycemic tilstand som ligner på hva som ville bli forventet etter transplantasjon menneskelige pasienter. Videre flere runder med halefinnen amputasjon tillate separasjon og studiet av rene epigenetic effekter i et in vivo-system uten potensielle kompliserende faktorer fra forrige diabetisk tilstand. Selv euglycemia oppnås etter bukspyttkjertelen regenerering, vedvarer diabetiker videregående komplikasjon fin regenerering og hud sårtilheling på ubestemt tid. I tilfelle av nedsatt fin regenerering, er denne patologi beholdes selv etter flere runder av fin regenerering i dattercellene fin vev. Disse observasjonene peker på en underliggende epigenetic prosess som eksisterer i den metabolske minnet staten. Her presenterer vi de metodene som trengs for å lykkes gennyttiggjøre de diabetiker og metabolske minne grupper av fisk og diskutere fordelene med denne modellen.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) er en alvorlig og økende helseproblem som resulterer i redusert levetid på grunn av sykdom spesifikk mikrovaskulær (retinopati, nefropati, nevropati, nedsatt sårheling) og makrovaskulære (hjertesykdom og hjerneslag) komplikasjoner en. Gang startet, diabetiske komplikasjoner fortsette å utvikle seg uavbrutt selv når glykemisk kontroll oppnås 2,3 og dette fenomenet har blitt kalt metabolsk minne eller arven effekt. Tilstedeværelsen av dette fenomenet ble anerkjent klinisk løpet av tidlig 1990-tallet som "The Diabetes Control og Komplikasjoner Trial (DCCT)" kommet, og siden har blitt støttet av flere ytterligere kliniske studier 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Dyremodeller av DM har vært avgjørende for funn knyttet til patho-fysiologi av diabetiske komplikasjoner og metabolsk minne. Faktisk var den utholdenhet av diabetiske komplikasjoner først dokumentert i en hjørnetann modell av diabetikerretinopati som siden er blitt støttet av flere linjer med eksperimentelle bevis ved hjelp av en rekke in vitro kultur systemer og dyremodeller 15,16,17,18,19,20,21. Disse studiene viser tydelig at en første hyperglykemiske periode resulterer i permanente forandringer (inkludert avvikende genuttrykk) av målorganer / celler og mekanistisk antyder involvering av epigenome.

Epigenomes består av alle de kromatin modifikasjoner for en gitt celle type og er ansvarlig for en celle unike genuttrykk profil. Kromosomet modifikasjoner er dynamiske under utvikling, support celledifferensiering, er lydhør overfor ytre stimuli, er mitotisk stabilt arvet 22,23 og kan bli forandret på sykdom 24,25,26. Disse epigenetiske mekanismer inkluderer: poste translasjonelle histonmodifikasjonene, ikke-kanoniske histone variant inkludering i octomers, kromatin tilgang endringer gjennom DNA metylering, og genetuttrykk kontroll gjennom ikke-kodende mikro RNA 27,28,29,30. Helt, epigenetiske prosesser tillate celler / organismer til å reagere raskt på endrede miljømessige stimuli 31,32,33, de også gi muligheten for cellen å "huske" disse møter når stimulus er fjernet 23,22. Derfor, som endrede genuttrykk profiler følge epigenetic prosesser er stabile i fravær av signalet (e) som startet dem og arvelig gjennom celledeling, har de fått stor interesse som underliggende molekylære mekanismene menneskelige patologier inkludert metabolsk minne. Resultatene som dukker opp i forbindelse med DM og epigenetikk parallelle fremskritt i andre sykdommer ved at en mengde epigenetic endringer indusert av hyperglykemi forårsaker bemerkelsesverdige vedvarende endringer i transcriptional nettverk av celler (anmeldt i 34,35,36,37,38).

Sebrafisk har lenge vært en ledende modell organisme til study vertebrate utvikling men de siste 15 årene har sett en eksponentiell vekst i bruk denne organismen for studier av sykdom hos mennesker. 39. Sebrafisk modeller av menneskelig sykdom har blitt etablert som dekker et bredt spekter av humane patologier inkludert genetiske sykdommer og ervervet sykdom 40,41,42. De mange fordelene av sebrafisk over andre virveldyr modellorganismer inkluderer høy fruktbarhet, kort generasjonstid, åpenhet gjennom tidlig voksen alder, reduserte bokostnader og en rekke verktøy for genmanipulering. Videre, på grunn av den omfattende bevaring av genetiske trasé og cellulær fysiologi blant virveldyr og kapasitet til å utføre høy gjennomstrømning bedøve screenings har sebrafisk blitt brukt for farmasøytisk oppdagelse.

Vi har utviklet en voksen sebrafisk modell av type I diabetes mellitus ved hjelp diabetogenic stoffet, streptozocin. Vi har karakterisert denne modellen for å vise at diabetiker sebrafisk ingent bare vise den kjente humane sekundære komplikasjoner, men i tillegg, utviser nedsatt lem regenerering (halefinnen regenerering) som en konsekvens av den hyperglykemiske miljøet. I tillegg har vi rapportert at hyperglykemiske sebrafisk gå tilbake til normal glykemi innen 2 uker av narkotika fjerning skyldes regenerering av endogene pancreatic beta celler som resulterer i en fysiologisk normal glykemisk tilstand. Imidlertid, i kontrast, forblir lem regenerering i disse fiskene svekket i samme grad som i akutte diabetisk tilstand indikerer denne komplikasjonen vedvarer og er utsatt for metabolsk minne. Den viktigste drivkraften for generere denne modellen var å tilveiebringe et system for å studere mitotisk stabile epigenetic komponenter som støtter metabolske minnet fenomenet i fravær av bakgrunnsstøyen av forrige hyperglykemiske miljøet. Ved avslutningen av protokollen gitt her sebrafisk og eller selektive vev kan bli behandlet av en analyse egnet til researchers trenger. Vi har med hell brukt denne fremgangsmåten for å identifisere genom-wide vedvarende endringer i DNA metylering indusert av hyperglykemi som blir vedlikeholdt i den metabolske minnet staten 21.

Vi føler at dette sebrafisk modell av type I diabetes mellitus har flere innovative fordeler fremfor andre modellsystemer for å undersøke metabolske minne. 1) Alle våre studier kan gjennomføres in vivo, og som den forrige hyperglykemiske fisken tilbake til euglycemia gjennom regenerering av endogen insulin produksjon, de krever ikke eksogene insulininjeksjoner. Derfor unngår dette de kompliserende toppene og dalene i glykemisk kontroll som kan oppstå hos dyr som krever eksogene insulin. 2) Som beskrevet ovenfor, er bakgrunnen stimulering fra forrige diabetiker tilstand (dvs. den fortsatte tilstedeværelsen av avansert glycation sluttprodukter og reaktive oksygen arter markører) eliminert og derfor kan man undersøke rent epigenetic faktorer av metabolsk minne. 3) Eksperimentene kan utføres raskt som det tar ca 80 dager fra diabetes induksjon inntil metabolsk minne undersøkelse. 4) halefinnen gjenfødelse er eksperimentelt svært approachable og gjør det lett å genetisk og eksperimentell manipulasjon som det er et stort utvalg av verktøy. 5) halefinnen regenerering gir en svært enkel og kvantifiserbare metode for å vurdere metabolsk minnet, og derfor vil tillate for fremtidig medisiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer er utført i henhold til retningslinjene beskrevet i "Prinsipper for Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikasjon no. 85-23, revidert 1985) og den godkjente Rosalind Franklin Institutional Animal Care og bruk komité dyr protokoll 08-19.

Det er to viktige forkortelser som brukes i dette manuskriptet. 1) DM: refererer til fisk som er i en akutt (300 mg / dl) hyperglycemic staten og har vært i minst tre uker. 2) MM: refererer til fisk som var 21 dag (se protokoll) DM fisk og lov til å gjenopprette glykemisk kontroll gjennom bukspyttkjertelen gjenfødelse. Dette oppnås i løpet (14) dager med medikament fjerning. Fisken regnes MM fisk fra dette punktet og fremover. Det er også viktig å merke seg at fisk som er referert til som kontroll behandles identisk som DM eller MM fisk i form av antall injeksjoner (saltvann bare), inkuberingen tider ved de ulike temperaturer samt antall og timingav halefinnen amputasjoner.

1. Generasjon av Sebrafisk med Diabetes mellitus, DM Fish

  1. Forbered både utvinning og anestesi vanntanker. Recovery vann er vanlig fisk vann. For bedøvelse vann legge tilstrekkelig 2-fenoksyetanol, slik at en 1:1.000 fortynning i normal fisk vann er oppnådd.
  2. Forberede en 0,3% oppløsning (i et avtrekksskap) av streptozocin (STZ) ved tilsetning av 6 mg STZ til 2 ml 0,09% natriumklorid og umiddelbart plassere løsningen på is. Dette vil gi nok injeksjonsoppløsning for injeksjon av ca 20 fisk i 20 min. Hvis du overskrider 20 minutters mark, stoppe og ta en frisk STZ løsning før du fortsetter. I en separat rør delmengde nok saltvannsoppløsning i kontrollfisken. Når STZ er oppløst alle etterfølgende trinnene ikke krever avtrekksskap bruk.
  3. Fyll en ½ cc sprøyte utstyrt med en 27 1/2 gauge kanyle med STZ eller kontroll løsninger som sikrer at ingen luftbobler er fanget.
  4. Anesthetize hver fisk enkeltvis ved å plassere fisken i anestesi vann, og vente til deres svømming bevegelse opphører (1-2 min).
  5. Når bedøvet kort legg fisken på et papirhåndkle til å absorbere overflødig vann, legg fisken i veier båt og måle massen av fisken.
  6. Legg fisken på et fast underlag (petriskål lokk) for injeksjon.
  7. Injiser STZ eller kontrolløsning i bukhulen av fisken ved å sette nålen forbi skråkanten inn den bakre del av ventrale peritoneum.
  8. 0,35 mg / g (350 mg / kg) av STZ bør leveres til hver fisk og volumet av 0,3% løsning som kreves, kan beregnes på følgende måte.
    1. Multipliser massen av fisk (g) ved 0,35 til gi mengden STZ i mg kreves.
    2. dele produktet genererte ovenfor med 3 for å gi det volumet av 0,3% oppløsning som kreves for injeksjon i pl.
      Eksempel: For en 0,5 g fisk: a) 0,5 x 0,35 = 0.175 b) 0,0175 / 3 = 0.058 ml= 58 pl.
      Samme volum uten STZ ville bli injisert for en kontroll fisk. Et ark for volumer å injisere per fisk massen skal genereres og brukes for rask referanse.
  9. Etter injeksjon plassere fisken i utvinningen vanntanken og overvåke dem for vanlig svømmeaktivitet. Når dette har blitt oppnådd blir fisken overført til en vanlig levende tank som holdes ved den reduserte temperaturområde på 22 ° C - 24 ° C. Dette reduserte temperatur er kritisk for effektiv induksjon av hyperglykemi (diabetes mellitus, DM).
  10. Selv hyperglykemi registreres innenfor 24 timer etter den første injeksjonen, for å indusere en langvarig tilstand av svært høy hyperglykemi sebrafisk krever en hyppig injeksjon induksjon fase etterfulgt av ukentlige vedlikehold injeksjoner som vist nedenfor.

Uke 1: 3 injeksjoner (dag 1, 3, 5), uke 2: 1 injeksjon (Dag 12), Uke 3: 1 injeksjon (Dag 19),
Uke 4: (Dag 21) Utføranalysen av interesse.

På dette punktet sebrafisk anses for å ha vært i en langvarig tilstand av hyperglykemi og vise de diabetiske komplikasjoner av retinopati, nefropati og også svekket fin gjenfødelse. Disse refereres til som DM fisk. I tillegg hvis ønskelig kan fisken opprettholdes i hyperglykemiske tilstand med ukentlige vedlikehold injeksjoner. Omtrent 5% død i løpet av denne prosessen bør forventes.

2. Blodprøvetaking og fastende blodsukker nivå (FBGL) Bestemmelse

  1. Hver gruppe av DM og kontroll fisk må inneholde nok fisk til å nøyaktig fastslå den gjennomsnittlige FBGL av gruppen som denne analysen krever disse fiskene å bli ofret.
  2. Forbered en merket PCR-rør for hver blodprøve inneholdende 5 ul sterilt fysiologisk saltvann.
  3. For blodprøvetaking, bedøve fisk som ovenfor, fjerner alt vann, legg fisken på et objektglass og bruke en skalpell, fjerne hodet av fiskenved foten av operculum.
  4. Samle blodet (opp til 2 pl) som frigjøres fra fisken på lysbildet og raskt legge den til 5 pl sterilt fysiologisk saltvann pipettering opp og ned for å være sikker på at blodet ikke tette. Umiddelbart plasser prøven på is.
  5. Bestem blodprøven volumet ved å måle det totale volum av væske (saltvann + blod) og deretter trekke ut den 5 pl av saltvann.
  6. Overfør 5 pl av den fortynnede blod fra hvert PCR rør inn et 1,5 ml mikrosentrifuge tube og bestemme blodglukosekonsentrasjon bruker QuantiChrome Glucose Assay Kit. Dette utføres ved å følge produsentens protokoll uten unntak. Forventede resultater: normal / kontroll fisk 60 mg / dl og DM fisk 310 mg / dl.

3. Halefinnen Regeneration Studies

  1. Anesthetize fisk som er beskrevet i 1.0 til 1.4.
  2. Legg fisken på en petriskål lokk og amputere halefinnen i en rett linje ved hjelp av en steril størrelse10 skalpell proksimalt for første lepidotrichia forgreningspunktet mens du ser finnen gjennom et disseksjonsmikroskop.
  3. La fisken gjenopprette så i 1,10 men plasserer fisken ved 33 ° C for den regenerative vekstfasen til analysen. Dette er en etablert temperatur for akselerert fin regenerering analyse.
  4. Finnene kan avbildes på noe tidspunkt etter amputasjon men vi rutinemessig undersøke regenerativ veksten ved 24, 28 og 72 timer etter trans-delen.
  5. Anesthetize fisk som før (se 1.0 til 1.4), legg fisken under et disseksjonsmikroskop utstyrt med et kamera (vi bruker en Nikon SMZ-1500 utstyrt med en Q-kamera) og samle alle finnestråler bilder ved 1X forstørrelse med NIS elementer programvare . Finnen bør spres for avbildning, slik at det er fullt forlenget uten å strekke eller skade vevet og bør være fri for vanndråper. For konsistens alltid plassere ryggsiden mot høyre.
  6. Skrive ut bilder og måle regenerative Growth område ved hjelp av Image J programvare og bruk av en tegneflaten. Spore rundt hele området av ny vekst og finne arealet. Hver måling bør gjøres fem ganger og i gjennomsnitt for å sikre nøyaktigheten av sporing. Det er viktig at bildene brukes ikke har skygger eller vanndråper så disse bidrar til feil i måle utvekst området.
  7. Måle lengden av amputasjonen området sammen dorsal-ventrale akse og dele området bestemmes i 3,6 ved denne målingen. Dette tillater fisk av forskjellige størrelser for å bli sammenlignet direkte.

4. Generasjon av metabolsk minne (MM) Sebrafisk

  1. Initiere en gruppe av DM fisk og sine respektive kontroller som beskrevet i punkt 1.
  2. På 21 dager bestemme FBGL for en undergruppe av gruppen og dele DM fisk i 2 undergrupper. Fortsett ukentlig STZ injeksjoner for en av gruppene som DM kontroller for varigheten av eksperimentet. Slutt STZ injeksjon for den andre gruppen og incubate fisken ved normal temperatur. Innen 14 dager disse sebrafisk vil gjenopprette normal blod insulin og glukose kontroll gjennom bukspyttkjertelen gjenfødelse. Disse fiskene er nå kalt MM (metabolsk minne fisk).
  3. På dag 30 etter stoffet fjerning amputere caudal finnene kontroll, DM og MM fisk via metoden beskrevet i 3.2.
  4. Returnere fisk til normale vannforhold for fin foryngelse i 30 dager. Dette tillater veksten av hva vi kaller, metabolsk minne vev.
  5. På dag 60 utføre en andre amputasjon (som beskrevet i 3.2) i vevet som ble regenerert i perioden 30-60 dager og utføre halefinnen regenerering assay (3.1 til 3.7) Figur 1.
  6. Isoler vev og utføre analyse av interesse. Se tabell 1 for en protokoll sammendrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Type I diabetisk sebrafisk ikke bare vise de kjente sekundære komplikasjoner av retinopati og nefropati, men også vise en ekstra komplikasjon: nedsatt halefinnen gjenfødelse. Dette senere komplikasjon vedvarer på grunn av metabolsk minne i fisk som har restaurert normal glukose kontroll etter en hyperglycemic periode. I figur 2A (kontroll) og figur 2B (metabolsk minne) representative bilder av regenererende finnene som ble tatt ved 72 timer etter amputasjon presenteres. Underskuddet kan kvantifiseres og som vist i figur 2C DM og MM sebrafisk oppviser et underskudd på ca 40% ved 72 timer i forhold til styre fisk. Selv om dataene som inngår i figur 2C ender på 90 dager denne samme nyrefunksjon har blitt observert så langt ut som 150 dager.

Tabell 1. Protokoll Oppsummering.

Figur 1
Figur 1. Cartoon viser amputasjon nettsteder for metabolske minne eksperimenter. Den blå fargen representerer vev som ble utsatt for forrige hyperglycemic staten. Den grønne fargen viser vevet som ble dyrket 30-60 dager etter hyperglykemi. Den svarte stiplede linjen viser den første amputasjon området utført på dag 30 og rød indikerer en potensiell amputasjon nettsted som ville oppstå ved 60 dager.

Figur 2
Figur 2. Halefinnen Regeneration er redusert i Diabetic (DM) og metabolsk minne (MM) Sebrafisk. A. En representant halefinnen bilde fra en kontroll injisert fisk viser en normal mengde regenerative vekst 72 timer etter amputasjon. Den hvite stiplede linjen representerer amputasjon flyet og rosa heltrukken linje demarks den regenerative utvekst. Mengden av regenerering bestemmes ved tracing areal som ligger innenfor de rosa og hvite linjer delt på lengden av den hvite linje å normalisere fin størrelse forskjeller. B. Et representativt halefinnen bilde fra enten DM eller MM illustrerer en redusert mengde av regenerativ vekst 72 timer etter amputasjon. Linjene og området målinger er de samme som for panel A. C. Grafisk presentasjon av den relative regenererings raten av DM og MM sebrafisk sammenlignet med kontroller. Den relative prosentandel (til kontroller satt ved 100%) av DM og MM sebrafisk regenerativ utvekst på 72 timer er vist. Tiden i dager som er avbildet er relativ til da STZ administrering ble stoppet for metabolske memory group. Disse dataene der generere av flere forskere og innlemme over 1000 fisk per gruppe. <strong> 2A og figur 2B ble tilpasset med tillatelse fra Olsen et al 43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diabetes mellitus er en sykdom av metabolsk dysregulering, først diagnostisert som hyperglykemi, som til slutt resulterer i blodkarskader fører til mange komplikasjoner som alle vedvarer selv etter euglycemia oppnås om farmasøytisk intervensjon. Denne vedvarende komplikasjoner kalles metabolsk minne og flere nyere studier har undersøkt rollen epigenetic mekanismene spiller i dette fenomenet. Her har vi detaljert en protokoll som gjør det mulig for generering av både akutt diabetiker og metabolsk minne (restaurert glukose kontroll) sebrafisk. Vi nærmere beskrevet den metodikk som kan anvendes for å skille epigenetic bidrag fra de potensielt kompliserende komponenter av forrige diabetisk tilstand. Vi ønsker å understreke at fisk kan undersøkes på noe punkt med noen analyse av interesse for den aktuelle forskeren og derfor nedstrøms applikasjoner for fremtidig funn er uendelige.

There er flere trinn i protokollen som garanterer noen videre diskusjon og vekt. I vår erfaring med 0,3% STZ i løsning forverres og mister sin effektivitet etter ca 20 minutter. Derfor foreslår vi at en tidtaker brukes og en fersk løsning gjøres ved 20 minutters intervaller. Under vår første forsøk på å generere diabetiker sebrafisk ble vi bare bruker én injeksjon i løpet av den første uken, og var vellykket med ca 40% av fisken. Som sådan, er det ikke en streng kravet om tre injeksjoner, men når tre utføres på frekvensen av suksess overstiger 95%. Dernest, ved injisering STZ inn sebrafisk er det viktig at nålen er satt slik at skråkanten av nålen er fullt inne i fisken for å tillate riktig dispensering av løsningen, må imidlertid forsiktighet tas at det ikke trenge for langt til unngå skade. Gang STZ eller kontrolløsning administreres fisken inkuberes ved en redusert temperatur (22 ° C - 24 & df.eks, C). Vi kan ikke over understreke viktigheten av den reduserte temperaturen som uten det sebrafisk vil regenerere deres betacellene (STZ injisert) og hyperglykemi ikke kan effektivt indusert. Til slutt, i vår hender sebrafisk blodpropp svært raskt som hindrer den nødvendige kapillærkraft kreves for effektiv glukosemåler bruk og derfor har vi ikke argumentere bruken. Vi har funnet at den QuantiChrome analysen beskrevet er ikke bare den mest pålitelige, men den enkleste å utføre og å lære laboratoriepersonell. Kollektivt teknikkene som er beskrevet i protokollen er ikke vanskelig, og hvis de riktige forholdsregler er tatt med trinnene beskrevet ovenfor generasjon av diabetisk sebrafisk er alt, men forsikret.

Det er svært få begrensninger i prosedyren som er beskrevet i dette manuskriptet, men alle legemiddelindusert modeller av sykdom alltid har kritikken av utenfor mål effekter kastet mot dem. Vi henviser leseren til vår første manuskript detailing denne modellen som vi gitt fem uavhengige linjer av bevis (inkludert direkte STZ injeksjon i finnene) dokumenterer at det ikke er noen utenfor mål effekter av STZ 43. En annen potensiell begrensning kommer ikke fra selve inngrepet men fra det faktum at de reagenser for zebrafisk forskning er ennå ikke på nivået av andre modell organismer som mus. Heldigvis, som sebrafisk blir stadig mer brukt som en modell organisme for menneskelig sykdom denne mangelen blir raskt utbedret.

Oppsummert, som beskrevet i innledningen, har sebrafisk modellen av diabetes mellitus er beskrevet her flere fordeler fremfor andre modellorganismer. Viktigst av alt gir det for undersøkelse av de rent epigenetic komponenter som støtter den metabolske minne fenomen. Som det er anslått at 400 millioner mennesker vil bli plaget med denne lidelsen vi føler at bidraget fra studier utnytte denne modellen kan ha betydelig innvirkning på menneskers helse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend fra Iacocca Family Foundation, Rosalind Franklin oppstart midler, og National Institutes of Health Grant DK092721 (til RVI). Forfatterne ønsker å takke Nikki Intine for hjelp i manuskript forberedelse.

Materials

DAY PROSEDYRE
1
3 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvann injeksjon
5 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvann injeksjon
12 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvann injeksjon
19 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvann injeksjon
21 Enten utføre analysen av interesse for DM fisk eller fortsette å gjøre MM grupper ved fjerning av STZ press.
51 Amputere Fins 30 dager etter siste STZ injeksjon av kontroller, DM og STZ grupper for å generere MM vev.
81 Re-amputere finnene alle grupper i vevet som ble dyrket mellom dag 51 og 81 for å utføre regenerering studium. Alternativt behandler fisken / vev med analysen av interesse.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. , (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. , (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. , (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. , (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).

Tags

Medisin genetikk Genomics fysiologi anatomi Biomedical Engineering metabolomics sebrafisk diabetes metabolsk minne vev gjenfødelse streptozocin epigenetikk, Dyremodell diabetes mellitus diabetes drug discovery hyperglykemi
En Sebrafisk modell av diabetes mellitus og metabolsk Memory
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras… More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter