בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca Published: July 3, 2013 doi: 10.3791/50235

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Niels Voigt*^1,2, Xiao-Bo Zhou*², Dobromir Dobrev^1,2

¹Institute of Pharmacology, University of Duisburg-Essen, ²Division of Experimental Cardiology, University of Heidelberg

* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים Ca

Abstract

המחקר של מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק וחקר הלב הסלולרי Ca ^{2 +} מומים טיפול דורש cardiomyocytes מבודד. בנוסף, האפשרות לחקור myocytes מחולים תוך שימוש בטכניקות אלה היא דרישה לא יסולא בפז על מנת להבהיר את הבסיס המולקולרי של מחלות לב כגון פרפור פרוזדורים (AF). ¹ כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם אשר מתאימות לשניהם מחקרי תיקון-מהדק ומדידות בו זמניות של ^{2 +} ריכוזי Ca תאיים. ראשית, נספחים פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח מבותרים לחתיכות קטנות של רקמה ("נתח שיטה") ורחצו בCa ^{2 +} ללא פתרון. ואז את נתחי הרקמות מתעכלים בcollagenase ופרוטאז המכילים פתרונות עם 20 מיקרומטר Ca ^{2 +.} לאחר מכן, myocytes המבודדים הוא הארוויsted על ידי סינון וצנטריפוגה של ההשעיה הרקמות. לבסוף, Ca ^{2 +} הריכוז בפתרון אחסון התא מותאם לשלבי 0.2 מ"מ. אנו דנים בקצרה את המשמעות של Ca ^{2 +} וCa ^{2 +} החציצה במהלך תהליך הבידוד וגם מספקים הקלטות מייצגות של פוטנציאל פעולה וזרמים בממברנה, שניהם בו זמנית יחד עם Ca ^{2 +} ארעיות מדידות, שבוצע בmyocytes המבודדים אלה.

Introduction

לימוד מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק והחקירה של הסלולר Ca ^{2 +} מומים טיפול דורשים cardiomyocytes מבודד. אלה הם בדרך כלל מתקבלים בעקבות החשיפה במבחנה של דגימות רקמת לב לאנזימי עיכול (collagenase, hyaluronidase, peptidase וכו '). מאז הדו"ח הראשון של בידוד של myocytes לב קיימא בשנת 1955 ² כמות גדולה של פרוטוקולים פותחה במטרה לקצור cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים בודדים ממינים שונים, כולל עכבר, חולדה, ארנב, כלב, חזיר ואדם. בסקירה זו אנו מתמקדים בבידוד של myocytes פרוזדורי אדם. בנוגע לנהלים לבידודה של myocytes ממינים אחרים שאנחנו מתייחסים לאוכלוסיית "וורטינגטון רקמות דיסוציאציה המדריך" המסופק על ידי וורטינגטון יוכימית קורפ, ארה"ב (www.tissuedissociation.com).

= "Jove_content"> פרוטוקולי בידוד myocyte פרוזדורי אדם בדרך כלל נגזרים מהשיטה שתוארה על ידי בוסטמנטה, et al. ³ כאן אנו מספקים תיאור צעד אחר צעד של טכניקה, אשר מותאם משיטה שפורסמה בעבר, על מנת להשיג myocytes פרוזדורים מתאים לא רק לניסויי תיקון-מהדק אלא גם עבור Ca ^{2 +} מדידות תאיות בו זמנית. ^4-11

Protocol

פרוטוקולי ניסוי צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית וכל החולים צריכים לתת הסכמה מדעת בכתב. המחקר שלנו אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במנהיים, אוניברסיטת היידלברג (# 2011-216N-MA) ובוצע בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומית ובינלאומיות לרווחת אדם. כל החולים נתנו הסכמה מדעת בכתב.

0. קבלת רקמות אנושי פרוזדורים

במהלך הליכי cannulation שגרתי בחולים שעברו ניתוח לב פתוח להשתלת המעקפים cardiopulmonary, קצה תוספת פרוזדורי ימין בדרך כלל להסיר ויכול לשמש לבידוד של cardiomyocytes פרוזדורים. לאחר כריתת דגימת הרקמה מועברת מייד לתוך צינור פלקון 50 מ"ל עם סטרילי Ca ^{2 +} ללא פתרון תחבורה המכיל 2,3-butanedione monoxime (טבלת I; BDM, מעכב התכווצות, מניעת ג myocyteontracture). עם זמני הובלה בין דקות 30 ו -45, שלא זיהו את יתרון ברור של קירור או חמצון ביחס לשניהם מספר והאיכות של cardiomyocytes פרוזדורים מבודד. בתחבורה בכלל למעבדה צריכה להיות מהיר ככל האפשר. עם זאת, אם לא ניתן להימנע מתחבורה זמן ארוכה יותר, תחבורה על 4 מעלות צלזיוס בפתרון חומץ עשויה להיות יתרון.

1. Prearrangements

1. הפעל את thermocirculator, אשר שולט על הטמפרטורה של כוס המעייל (לוח ב '). ודא שהטמפרטורה בתוך הכוס שווה 37 ° C. לכסות את הכוס עם מכסה זכוכית כדי לשמור על טמפרטורה קבועה בתוך הכוס לאורך כל תהליך הבידוד.
2. שוקל אני collagenase ופרוטאז XXIV לשלוש כוסות זכוכית ולאחסן אותו בטמפרטורת חדר. האנזימים ידוללו רק לפני שימוש.
3. חנות 20 מ"ל של Ca ^{2 +} פתרון חופשי בצלחת פטרי ב 4 ° C.
4. חנות 250 מ"ל של Ca ^{2 +} פתרון חופשי באמבט מים ב 37 ° C.

2. ניקוי של הרקמה

1. להעביר את דגימת הרקמה יחד עם פתרון התחבורה לתוך צלחת פטרי (~ קוטר 10 ס"מ) ולהסיר רקמת שומן בערך באמצעות מספריים.
2. לשקול את דגימת הרקמה. בין 200 ל 600 מ"ג משמש לבידוד בתא. הרקמה שנותרה ניתן להקפיא בחנקן נוזלי לצורך הניתוח מאוחר יותר ביוכימי.
3. להעביר את דגימת הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה 20 מ"ל Ca ^{2 +} פתרון חופשי על 4 מעלות צלזיוס (ראה שלב 1.3) וקוצץ את דגימת הרקמה לחתיכות קטנות של כ 1 מ"מ ³ בגודל.
4. השלבים הבאים צריכים להיות מוצאים להורג על 37 מעלות צלזיוס ותחת המתה בגז רציפה עם 100% O _2. קצה פיפטה ניתן להציב על צינור החמצן כדי למנוע בעבוע חזק וליצור זרימת אוויר רציפה.
5. מעבירים את נתחי הרקמות יחד עם פתרון Ca ^{2 +} ללא בלכוס ומערבבים בזהירות מעייל לכ -3 דקות עם בר בחישה מגנטי.
6. תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכמה שניות. מסנן את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב '). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס באמצעות מלקחיים.
7. למלא את הכוס עם Ca ^{2 +} פתרון חופשי ולחזור על שלב הכביסה 2.4 ו -2.5 פעמיים.

3. עיכול אנזימתי ראשון

1. Re-להשעות את נתחי רקמות עם 20 מיליליטר אנזים הפתרון E1 (טבלת I) המכיל collagenase ופרוטאז ומערבבים היטב במשך 10 דקות.
2. הוסף 40 μl של 10 מ"מ CaCl ₂ פתרון להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca ^{2 +.}
3. לאחר 35 דקות מסננות את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב ') באופן שרוב גושי הרקמה יישאר בכוס. תשואת יתרירד גשם גושי רקמה מהרשת לתוך הכוס.

4. עיכול אנזימתי שני

1. Resuspend את נתחי רקמות שוב עם collagenase 20 מיליליטר אנזים פתרון E2 המכיל רק אני (טבלת I). הוסף 40 μl של 10 מ"מ CaCl ₂ פתרון באופן מיידי כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca ^{2 +.}
2. במהלך שימוש במספרי העיכול השני לקצוץ נוסף קרישי רקמות מדי פעם.
3. לאחר 5 דקות לקחת דגימה באמצעות פיפטה פסטר כדי לבדוק את הניתוק של תאים. חזור על כל 2-3 דקות עד שזה cardiomyocytes בצורת המוט, מפוספס יופיע.
4. תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכ 20-30 שניות.
5. מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח השני) לתוך 50 מ"ל פלקון צינור (Tube). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס.
6. Re-להשעות את נתחי רקמות בכוס עם 20 מ"ל StoraGE הפתרון (טבלת I) ¹⁰ ועוד יותר לנתק את התאים על ידי טחינה דקה מכאנית עדינה בעזרת פיפטה סרולוגיות 20 מ"ל עם מתקן. נסו להימנע מהיווצרות בועה מאז בועות משפיעות לרעה על הישרדות תא ואיכות.
7. מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, טבלה השנייה) לתוך 50 מ"ל פלקון Tube (צינור B).

5. הכנה סופית והתאמה הסופית Ca ^{2 +} ריכוז

1. צנטריפוגה הן פלקון צינורות A ו-B (ראה שלב 4.5 ו -4.7) בשעה 95 XG במשך 10 דקות.
2. הסר את supernatant משני הצינורות בזהירות על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. בטל supernatant.
3. Re-להשעות את שני כדורים בפתרון 1.5 מיליליטר אחסון (טבלת I) כל אחד (בטמפרטורת חדר).
4. הוסף שתי פעמים μl 7.5 מ"מ של פתרון ₂ 10 CaCl לכל פלקון ומערבבים בזהירות. דגירה של 10 דקות לאחר כל שלב.
5. הוסף 15 μl של פתרון 10 מ"מ CaCl ₂ להשיג ^{2 +} ריכוז Ca סופי של 0.2 מ"מ.

6. טעינה של myocytes עם פלורסנט Ca ^{2 +} מחוון Fluo-03:00 (איור 1)

1. העבר 1.5 מ"ל של השעיה תא (צינור ו / או צינור B) לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל (צינור Eppendorf).
2. יש לבצע את הפעולות הבאות בחשבון של הרגישות לאור של ניאון Ca ^{2 +} מחוון Fluo-3.
3. ממיסים 50 מיקרוגרם של נגזר הקרום החדיר acetoxymethyl אסתר של Fluo-3 (Fluo-3 בבוקר, טבלת III) ב44 μl של Pluronic פתרון מניות ה-F-127 (טבלת III) (20% w / v בDMSO נטול מים) כדי לקבל 1 מ"מ Fluo-03:00 פתרון מניות, שניתן לאחסן ב -20 ° C למשך שבוע לכל היותר 1.
4. הוסף 15 μl של Fluo-03:00 מניות פתרון לצינור microcentrifuge המכיל 1.5 מ"ל של השעיה תא (ראה שלב 6.1) ולהתסיסבזהירות.
5. דגירה ההשעיה התא למשך 10 דקות בקופסה אטומה אופטי.
6. בקצרה צנטריפוגות בכ -6,000 סל"ד.
7. בטל supernatant מחדש להשעות את גלולה בפתרון אמבטיה 1.5 מ"ל (לוח ד).
8. השאר את ההשעיה התא לכ -30 דקות לדה esterification לפני תחילת עם ניסויים.

7. תיקון-מהדק וepifluorescent Ca ^{2 +} מדידות בו זמנית

מאז מדידות תיקון-הידוק לא הנושא המרכזי של סקירה זו, אנו מתייחסים לקורא מעוניין לפרסומים אחרים המספקים יותר בתיאור מעמיק של טכניקה זו. ^11-14 למען השלמות אנו מספקים סיכום קצר של פרוטוקול למדידה פוטנציאל פעולה או L-type Ca ^{2 +} שני זרמים, ביחד עם ² הקלטות בו זמנית חולפות ^+-CA.

במהלך ניסויי myocytes הם superfused על 37 מעלות צלזיוס עם האמבטיה solutiעל לוח (IV) באמצעות מערכת טפטוף מהירה (Octaflow IITM, ALA מכשירים מדעיים, ניו יורק). עבור ניסויי מתח מהדק, K ⁺ זרמים חסומים על ידי הוספת 4-aminopyridine (5 mmol / L) וBaCl ₂ (0.1 mmol / L) לפתרון האמבטיה. microelectrodes זכוכית ורוסיליקט משמש וצריך להטות התנגדויות של 2-5 MΩ כאשר התמלא פיפטה פתרון (לוח ה). בנוסף לFluo-03:00 טעינה של myocytes (ראה שלב 6), Fluo-3 כלולים גם בפתרון פיפטה (לוח ה). הקרינה היא נרגשת ב488 ננומטר ואור נפלט (<520 ננומטר) יומר ל[ Ca ^{2 +]} _אני מניח

כאשר k = _ד ניתוק מתמיד של Fluo-3 (864 Nז), F = Fluo-3 הקרינה;. F _max = Ca ^{2 +} רווי הקרינה המתקבלת בסופו של כל ניסוי ¹² שני אותות חשמליים וCa ^{2 +} אותות epifluorescent נרשמים בו זמנית. פוטנציאל פעולה הוא גירוי ברמה של 0.5 הרץ במצב נוכחי מהדק באמצעות פולסים 1 msec הנוכחיים של כוח סף 1.2x. L-סוג Ca ^{2 +} זרמים נמדדים במצב מתח מהדק באמצעות פוטנציאל החזקת -80 mV ורמפת דופק של 100 אלפית שנייה ל-40 mV להשבית Na המהיר ⁺ שוטף, ואחרי 100 אלפיות שנייה בדיקת דופק ל+10 mV ברמה של 0.5 הרץ.

Representative Results

איור 2 א מציג שלוש דוגמאות מייצגות מmyocytes פרוזדורי זכויות אדם מבודד. כדי לכמת את תשואת התא אנו פיפטה μl 10 של השעיה תא (שלב 5.5) בשקופית מיקרוסקופ CellFinder (http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html). תשואות ממוצעות של תא באיור 2 עולה בבירור כי קיימת נטייה לתשואות נמוכות יותר בתא הכרוני AF (CAF) דגימות חולים (שפופרת A: 16.5 ± 3.1 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.1 ± 2.3 cells/10 μl (N = 10) בSR וקפה, בהתאמה, p <0.05; צינור B: 17.9 ± 3.9 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.9 ± 2.0 cells/10 μl (n = 9) בSR וקפה, בהתאמה, p = 0.107).

דוגמאות מייצגות של מדידות פעולה פוטנציאליות והקלטות בו זמניות של Ca ^{2 +} ארעיים cytosolic ניתנות באיור 3. בכ -90% מהתאים שנחקרו, tהוא פעולה ופוטנציאל, מופעל Ca ^{2 +} שחרור גורם להתכווצויות תא ברורות וקבועות. כפי שדווח בעבר, פוטנציאל הממברנה במנוחה, אשר מהווה אינדיקטור מקובל לשלמות תא, בממוצע כ -73.9 ± 2.7 mV (n = / חולים 23/10 myocytes) ו-77.7 / חולי ± 1.8 (n = 19/8 myocytes mV ) בSR וCAF בהתאמה (p <0.05). ¹⁵ איור 4 מראה הקלטות בו זמנית יציגים של מתח מגודרת סוג L-Ca ^{2 +} הזרמים וCytosolic Ca ^{2 +} ארעיים. יישום של isoprenaline אגוניסט β-adrenoceptor לא סלקטיבי (1 מיקרומטר) מגדיל אמפליטודות של שניהם אני _{Ca, L} ו cytosolic Ca ^{2 +} ארעיים, המצביע על מפל הולכים אותות β-adrenergic ללא פגע.

F1 igure. תרשים זרימה של myocytes Fluo-03:00 טעינת פרוטוקול (ראה שלב 6.1-6.5). M / V, מסה / נפח.

איור 2. A, myocytes מבודד אדם נכון פרוזדורים לאחר שעה אחת בפתרון אחסון. B, ממוצע ± SEM של תשואת התא נספרת ב10 μl של תאים בפתרון אחסון (ראה שלב 5.5). N מתייחס למספר של הכנות בתוך כל קבוצה. * P <0.05.

הקלטות נציג איור 3. של פעולה ופוטנציאל אצבע קל על הדק Ca ^{2 +} ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס וChrחולה פרפור פרוזדורי onic. למעלה: הזריק קרום נוכחי (אני _מ ') המשמש לגירוי (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של פוטנציאל הממברנה (V _ז), וחתול מופעל (תחתון). (Replotted באישור וויגט et al. 2012) ¹⁵

הקלטות נציג איור 4. של האפקט (1 מיקרומטר) isoprenaline על סוג L-Ca ^{2 +} נוכחי אצבע קל על ההדק Ca ^{2 +} ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס ומטופל פרפור פרוזדורים כרוני. למעלה: מתח מהדק פרוטוקול (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של קרום נטו נוכחי (אני _מ '), המשקף בעיקר סוג L-Ca ^{2 +} חתול נוכחי (באמצע) והפעיל (תחתון). (Replotted באישור וויגט,et al. 2012) ¹⁵

פתרונות I. טבלה.

טבלה השנייה. ציוד ספציפי.

לוח ג. חומרים לטעינה של myocytes עם Fluo-3 PM.

לוח ד. פתרון אמבט לתיקון מהדק.

טבלת פתרון V. פיפטה לתיקון מהדק *.

Discussion

כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם מנספחי פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח. על מנת להשתמש בmyocytes אלה למדידות של cytosolic Ca ^{2 +} מתאמנים שיטה שתוארה בעבר על ידי השמטת EGTA ^4-11 מפתרון האחסון.

כבר בשנת 1970 זה היה ציין כי למרות שmyocytes לנתק בנוכחות של Ca ^{2 +} במהלך עיכול, כולם היו בהתכווצות ואינו בת קיימא. ^16,17 לכן, בידוד תא מתבצע בCa ^{2 +} ללא פתרון. עם זאת, מחדש המבוא של ריכוזים פיסיולוגיים של Ca ^{2 +} הביא המהיר Ca ^{2 +} זרם ומוות של תאים. זו תוארה ^{כ2 +} תופעת פרדוקס Ca אשר נצפתה במקור בלבבות perfused ידי צימרמן וHulsman. ¹⁸ שינויים של תקשורת הבידוד כולל הפחתה של ה-pH 7.0, <sup> 19 תוספת של ²⁰ taurin או של כמויות קטנות של ^{2 +} (ראה שלב 3.2 ו -4.1) Ca, ²¹ כמו גם אחסון של myocytes מבודד בEGTA המכיל אחסון פתרון ²² כבר הציע על מנת למנוע את Ca ^{2 +} פרדוקס. ¹⁷ עם זאת, זה ידוע היטב כי Ca ^{2 +} חציצה באמצעות EGTA מקטין את המשרעת של L-סוג Ca ^{2 +-Induced} Ca ^{2 +} נוכחי אמפליטודות ותוצאות בריקבון biphasic של Ca ^{2 +} הארעיים חולפות. ²³ לכן, אנו הושמטו EGTA לאורך כל תהליך הבידוד על מנת לקבל Ca ^{2 +} ארעיים עם מאפיינים טיפוסיים והתפרקויות monophasic. כדי להגן על התאים מCa ^{2 +} פרדוקס הגדלנו ^{2 +} ריכוז Ca הסופי של פתרון האחסון באופן הדרגתי עד 0.2 מ"מ.

הבחירה של collagenase היא כנראה השלב הקריטי ביותר לבידוד myocyte מוצלח. קול קונבנציונליagenases הם הכנות גולמי המתקבלות מקלוסטרידיום histolyticum ומכיל collagenase בנוסף למספר proteinases, polysaccharidases וlipases האחרים. בהתבסס על collagenases ההרכב הכללי שלהם מחולקים לסוגים שונים. ^-24 סוגי collagenase ורטינגטון I ו-II היו בשימוש בהצלחה לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. ^{4-10,15,25-30} בפרוטוקול המתואר כיום אנו ממליצים על השימוש בcollagenase הקלד, למרות שהיינו גם יכול להשיג כמויות מקובלות של תאי קיימא באמצעות collagenase סוג II. עם זאת, אפילו בתוך סוג collagenase אחת יש וריאציה אצווה כדי אצווה משמעותית ביחס לפעילות האנזים. וריאציות אלו דורשות בחירה אצווה זהירה ובדיקה של קבוצות שונות כדי לייעל את הליך בידוד. הכלי אצווה בחירה זמינה באינטרנט ומורטינגטון קורפ (ביוכימית http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) ניתן להשתמש כדי למצוא קבוצות זמינות עם הרכב שהוכח להיות מתאים לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. כיום אנחנו משתמשים בcollagenase הקלד עם פעילות 250 U / מ"ג collagenase, פעילות 345 U / מ"ג caseinase, פעילות 2.16 U / מ"ג clostripain ופעילות 0.48 U / מ"ג tryptic (הרבה 49H11338 #).

את התאים המתקבלים באמצעות ההליך המתואר בכתב היד הזה יכולים לשמש בתוך 8 שעות ללימודי תיקון-קלאמפ, Ca ^{2 +} מדידות חולפות, ושילוב של שניהם. ¹⁵ בנוסף, תאים אלה מאפשרים מדידות של התכווצות סלולרית בתגובה לגירוי שדה החשמלי או גירוי חשמלי באמצעות פיפטה את תיקון המהדק (תצפיות שלא פורסמו).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Transport solution
Albumin	Sigma-Aldrich	A3059	Storage solution: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	Transport solution: 30
DL-b-Hydroxy-butyric acid	Sigma-Aldrich	H6501	Storage solution: 10
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251	Storage solution: 70
KCl	Merck	1049360250	Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100
Taurin	Sigma-Aldrich	86330	Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10
Collagenase I	Worthington	4196	Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*
pH			Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40
adjusted with			Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH
Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.
Table I. Solutions.
Nylon mesh (200 μm)	VWR-Germany	510-9527
Jacketed reaction beaker	VWR	KT317000-0050
Table II. Specific equipment.
Dimethyl-sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM (special packaging)	Invitrogen	F-1242
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.
4-aminopyridine*	Sigma-Aldrich	A78403	Bath solution: 5
BaCl2*	Sigma-Aldrich	342920	Bath solution: 0.1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	Bath solution: 2
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Bath solution: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Bath solution: 10
KCl	Merck	1049360250	Bath solution: 4
MgCl × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	Bath solution: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Bath solution: 140
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761	Bath solution: 2
pH			Bath solution: 7.35
adjusted with			Bath solution: 1 M HCl
Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.
DL-aspartat K+-salt	Sigma-Aldrich	A2025	Pipette solution: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Pipette solution: 0.02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	Pipette solution: 0.1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Pipette solution: 10
KCl	Merck	1049360250	Pipette solution: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Pipette solution: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Pipette solution: 4
Fluo-3**	Invitrogen	F3715	Pipette solution: 0.1
pH			7.20
adjusted with			1 M KOH
Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.