Summary
हम intracellular सीए के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो मानव आलिंद myocytes के अलगाव का वर्णन
Abstract
पैच दबाना तकनीक और हृदय सेलुलर 2 सीए के अन्वेषण के साथ हृदय आयन चैनल के electrophysiological गुणों का अध्ययन + निपटने असामान्यताएं अलग cardiomyocytes की आवश्यकता है. इसके अलावा, इन तकनीकों का उपयोग कर रोगियों से myocytes की जांच करने की संभावना ऐसे अलिंद (वायुसेना) के रूप में हृदय रोगों की आणविक आधार को स्पष्ट करने के लिए एक अमूल्य आवश्यकता है. यहाँ 1 हम दोनों के लिए उपयुक्त हैं जो मानव आलिंद myocytes के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन पैच दबाना पढ़ाई और intracellular सीए 2 + सांद्रता का एक साथ माप. सबसे पहले, ओपन हार्ट सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त सही आलिंद उपांग छोटे ऊतक हिस्सा ("हिस्सा विधि") में कटा और + मुक्त समाधान 2 सीए में धो रहे हैं. तब ऊतक मात्रा 20 माइक्रोन सीए 2 + के साथ समाधान युक्त collagenase और प्रोटीज में पचा रहे हैं. इसके बाद अलग myocytes harve हैंऊतक निलंबन की निस्पंदन और centrifugation द्वारा sted. अंत में, सेल भंडारण समाधान में सीए 2 + एकाग्रता 0.2 मिमी तक चरणबद्ध निकाला जाता है. हम संक्षेप + और सीए 2 + अलगाव की प्रक्रिया के दौरान बफरिंग और भी कार्रवाई क्षमता और झिल्ली धाराओं के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग प्रदान करते हैं, दोनों एक साथ एक साथ सीए 2 + क्षणिक माप, इन अलग myocytes में प्रदर्शन के साथ 2 सीए के अर्थ पर चर्चा की.
Introduction
पैच दबाना तकनीक और + हैंडलिंग असामान्यताएं अलग cardiomyocytes की आवश्यकता सेलुलर 2 सीए के अन्वेषण के साथ हृदय आयन चैनल के electrophysiological गुणों का अध्ययन. ये आमतौर पर पाचन एंजाइमों को हृदय के ऊतकों के नमूनों की इन विट्रो जोखिम (collagenase, hyaluronidase, पेप्टिडेज़ आदि) के बाद प्राप्त कर रहे हैं. 1955 2 में व्यवहार्य हृदय myocytes के अलगाव की पहली रिपोर्ट के बाद से प्रोटोकॉल की एक बड़ी मात्रा माउस, चूहे, खरगोश, कुत्ता, गिनी पिग और मानव सहित विभिन्न प्रजातियों में से एक आलिंद और निलय cardiomyocytes की फसल के लिए आदेश में विकसित किया गया है. इस समीक्षा में हम मानव आलिंद myocytes के अलगाव पर ध्यान देते हैं. हम वर्थिंगटन बायोकेमिकल कार्पोरेशन, संयुक्त राज्य अमेरिका (द्वारा प्रदान "वर्थिंगटन ऊतक हदबंदी गाइड 'का उल्लेख करने के अन्य प्रजातियों से myocytes के अलगाव के लिए प्रक्रियाओं के बारे में www.tissuedissociation.com ).
एट अल. 3 से वर्णित विधि से प्राप्त कर रहे हैं पैच दबाना प्रयोगों के लिए, लेकिन यह भी एक साथ intracellular सीए 2 + मापन के लिए न केवल उपयुक्त आलिंद myocytes प्राप्त करते हैं. 4-11
Protocol
प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्थानीय आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और सभी मरीजों को लिखित सूचित सहमति देने की जरूरत की जरूरत है. हमारे शोध मेडिकल संकाय मैनहेम की आचार समिति, हीडलबर्ग विश्वविद्यालय (# 2011-216N-एमए) द्वारा अनुमोदित किया गया था और मानव कल्याण के लिए सभी, संस्थागत राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया था. सभी रोगियों को लिखित सूचित सहमति दे दी है.
0. मानव आलिंदी ऊतक प्राप्त
ग्राफ्टिंग कार्डियोपल्मोनरी बाईपास के लिए ओपन हार्ट सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों में नियमित केन्युलेशन प्रक्रिया के दौरान, सही आलिंद उपांग की नोक आमतौर पर हटा दिया जाता है और आलिंद cardiomyocytes के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. BDM, सिकुड़ा अवरोध, myocyte ग रोकने, छांटना के बाद ऊतक नमूना 2,3 butanedione monoxime (टेबल मैं युक्त + मुक्त परिवहन समाधान बाँझ 2 सीए के साथ एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में तुरंत स्थानांतरित कर रहा है) ontracture. 30 और 45 मिनट के बीच परिवहन समय के साथ, हम अलग आलिंद cardiomyocytes की संख्या और गुणवत्ता दोनों के लिए सम्मान के साथ ठंडा या ऑक्सीजन का एक स्पष्ट लाभ नहीं पहचाना. प्रयोगशाला में सामान्य परिवहन में संभव के रूप में जल्दी होना चाहिए. अब परिवहन समय बचा नहीं जा सकता हालांकि, अगर 4 में परिवहन डिग्री सेल्सियस ऑक्सीजन समाधान में फायदेमंद हो सकता है.
1. Prearrangements
- तख्ताबंदीवाला बीकर (टेबल द्वितीय) के तापमान को नियंत्रित करता है जो thermocirculator, पर स्विच करें. बीकर के भीतर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के बराबर होती है सुनिश्चित करें पूरे अलगाव प्रक्रिया के दौरान बीकर के भीतर एक निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए एक ग्लास ढक्कन के साथ बीकर कवर.
- तीन गिलास बीकर में Collagenase मैं और Protease XXIV वजन और कमरे के तापमान पर दुकान. एंजाइमों बस का उपयोग करने से पहले पतला हो जाएगा.
- 2 सीए के स्टोर 20 मिलीलीटर 4 बजे एक पेट्री डिश में + मुक्त समाधान डिग्री सेल्सियस
- 2 सीए के स्टोर 250 मिलीलीटर 37 पर एक पानी के स्नान में + मुक्त समाधान डिग्री सेल्सियस
2. ऊतक की सफाई
- एक पेट्री डिश (~ 10 सेमी व्यास) में परिवहन समाधान के साथ एक साथ ऊतक नमूना स्थानांतरण और मोटे तौर पर कैंची का उपयोग वसा ऊतकों को हटा दें.
- ऊतक नमूना वजन. 200 के बीच और 600 मिलीग्राम सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है. शेष ऊतक बाद में जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है.
- 20 मिलीलीटर सीए 2 युक्त पेट्री डिश में ऊतक नमूना स्थानांतरण 4 बजे + मुक्त समाधान डिग्री सेल्सियस (1.3 चरण देखें) और आकार में लगभग 1 मिमी 3 की छोटी मात्रा में ऊतक नमूना काट लें.
- निम्नलिखित कदम 100% 2 हे के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर और निरंतर बक के तहत निष्पादित किया जाना चाहिए. एक विंदुक टिप मजबूत बुदबुदाती से बचने और सतत वायु प्रवाह उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीजन ट्यूब पर रखा जा सकता है.
- में सीए 2 + मुक्त समाधान के साथ एक साथ ऊतक हिस्सा स्थानांतरणतख्ताबंदीवाला बीकर और एक चुंबकीय सरगर्मी पट्टी के साथ के बारे में 3 मिनट के लिए ध्यान से हलचल.
- सरगर्मी बंद करो और ऊतक हिस्सा कुछ सेकंड के लिए बसने के लिए अनुमति देते हैं. एक नायलॉन जाल (200 माइक्रोन, टेबल द्वितीय) के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला ध्यान से तनाव. संदंश का उपयोग बीकर में जाल से रोका ऊतक हिस्सा लौटें.
- 2 सीए के साथ फिर से भरना बीकर + मुक्त समाधान और धोने कदम 2.4 और 2.5 दो बार दोहराएँ.
3. पहले enzymatic पाचन
- Collagenase और प्रोटीज युक्त 20 मिलीलीटर एनजाइम समाधान ई 1 (टेबल मैं) के साथ ऊतक हिस्सा पुनः निलंबित और 10 मिनट के लिए ध्यान से हलचल.
- 20 माइक्रोन सीए 2 + की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 मिमी 2 CaCl समाधान के 40 μl जोड़ें.
- 35 मिनट ऊतक मात्रा का सबसे बीकर में रहते हैं कि एक तरह से एक नायलॉन जाल (200 माइक्रोन, टेबल द्वितीय) के माध्यम से ध्यान से सतह पर तैरनेवाला तनाव के बाद. बाकी लौटेंजाल से बीकर में ऊतक हिस्सा बारिश.
4. दूसरा enzymatic पाचन
- मैं केवल 20 मिलीग्राम एंजाइम समाधान E2 युक्त collagenase (टेबल मैं) के साथ फिर से ऊतक हिस्सा Resuspend. तुरंत 20 माइक्रोन 2 सीए के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 मिमी 2 CaCl समाधान के 40 μl जोड़ें +.
- दूसरी पाचन उपयोग कैंची के दौरान आगे कभी कभी ऊतक के थक्के काटना.
- 5 मिनट के बाद कोशिकाओं की हदबंदी की जांच के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक नमूना ले. छड़ी के आकार का, धारीदार cardiomyocytes दिखाई देते हैं जब तक यह 2-3 मिनट के हर दोहराएँ.
- सरगर्मी बंद करो और ऊतक मात्रा के बारे में 20-30 सेकंड के लिए बसने के लिए अनुमति देते हैं.
- एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब (ट्यूब ए) में एक नायलॉन जाल (200 माइक्रोन, टेबल द्वितीय) के माध्यम से ध्यान से सतह पर तैरनेवाला तनाव. बीकर में जाल से रोका ऊतक हिस्सा लौटें.
- 20 मिलीलीटर स्टोरा साथ बीकर में ऊतक हिस्सा पुनः निलंबितजीई समाधान (टेबल मैं) 10 और आगे निकालने की मशीन के साथ एक 20 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कोमल यांत्रिक विचूर्णन द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना. बुलबुले सेल अस्तित्व और गुणवत्ता के लिए हानिकारक हैं क्योंकि बुलबुला गठन से बचने की कोशिश करें.
- एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब (ट्यूब बी) में एक नायलॉन जाल (200 माइक्रोन, टेबल द्वितीय) के माध्यम से ध्यान से सतह पर तैरनेवाला तनाव.
5. अंतिम 2 सीए की अंतिम तैयारी और समायोजन + एकाग्रता
- 10 मिनट के लिए 95 XG पर फाल्कन ट्यूबों ए और बी (4.5 कदम और 4.7 देखें) दोनों अपकेंद्रित्र.
- आकांक्षा से ध्यान से दोनों ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें. गोली परेशान नहीं सुनिश्चित करें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 1.5 मिलीलीटर भंडारण समाधान (टेबल मैं) प्रत्येक (कमरे के तापमान) में दोनों छर्रों पुनः निलंबित.
- दो बार प्रत्येक फाल्कन से 10 मिमी 2 CaCl समाधान के 7.5 μl जोड़ें और ध्यान से हलचल. प्रत्येक चरण के बाद 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- 0.2 मिमी की एक अंतिम सीए 2 + एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 मिमी 2 CaCl समाधान के 15 μl जोड़ें.
6. फ्लोरिसेंट सीए 2 + सूचक Fluo-3 बजे (चित्रा 1) के साथ myocytes की लोडिंग
- एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (Eppendorf ट्यूब) में सेल निलंबन के 1.5 मिलीलीटर (ट्यूब एक और / या ट्यूब बी) स्थानांतरण.
- निम्नलिखित कदम फ्लोरोसेंट सीए 2 + संकेतक Fluo-3 के प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता के विचाराधीन निष्पादित किया जाना चाहिए.
- Pluronic एफ 127 (तालिका तृतीय) शेयर समाधान (20% निर्जल DMSO में w / वी) प्राप्त करने के 44 μl में Fluo-3 की झिल्ली पारगम्य acetoxymethyl एस्टर व्युत्पन्न (Fluo-3 बजे, टेबल तृतीय) की 50 ग्राम भंग एक 1 मिमी Fluo-3 सबसे कम 1 सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, जो शेयर समाधान, AM.
- के 15 μl जोड़ें Fluo-3 1.5 सेल निलंबन के मिलीलीटर (कदम 6.1 देखें) और आंदोलन युक्त microcentrifuge ट्यूब शेयर समाधान AMध्यान से.
- एक ऑप्टिकली अपारदर्शी बॉक्स में 10 मिनट के लिए सेल निलंबन सेते हैं.
- संक्षेप में लगभग 6,000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1.5 मिलीग्राम स्नान समाधान (तालिका चतुर्थ) में गोली फिर से निलंबित.
- प्रयोगों के साथ शुरुआत से पहले डे एस्टरीफिकेशन के बारे में 30 मिनट के लिए सेल निलंबन छोड़ दें.
7. एक साथ पैच दबाना और epifluorescent सीए 2 + माप
पैच दबाना माप इस समीक्षा का प्रमुख विषय नहीं हैं, हम इस तकनीक की गहराई विवरण में एक अधिक उपलब्ध कराने के अन्य प्रकाशनों के लिए दिलचस्पी पाठक देखें. 11-14 पूर्णता की खातिर हम को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त सारांश प्रदान कार्रवाई क्षमता या एल प्रकार सीए 2 + धाराओं, एक साथ सीए 2 + क्षणिक रिकॉर्डिंग के साथ एक साथ दोनों.
प्रयोगों के दौरान myocytes स्नान soluti के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर superfused रहे हैंएक तेजी से छिड़काव प्रणाली (Octaflow आईआईटीएम, ALA वैज्ञानिक उपकरण, हिन्दी अनुवाद) का उपयोग (तालिका चतुर्थ) पर. वोल्टेज दबाना प्रयोगों के लिए, + K धाराओं स्नान समाधान करने के लिए 4-aminopyridine (5 mmol / एल) और BaCl 2 (0.1 mmol / एल) जोड़कर अवरुद्ध कर रहे हैं. Borosilicate कांच microelectrodes इस्तेमाल कर रहे हैं और विंदुक समाधान (तालिका V) से भरा जब MΩ 2-5 की प्रतिरोधों टिप देना चाहिए था. Fluo-3 के अलावा (6 कदम देखें) myocytes की लोड कर रहा हूँ, Fluo-3 भी विंदुक समाधान (तालिका V) में शामिल किया गया है. प्रतिदीप्ति 488 एनएम पर उत्साहित और प्रकाश उत्सर्जित (<520 एनएम) [सीए 2 +] मैं संभालने में बदल जाती है
जहां कश्मीर घ Fluo-3 के निरंतर = हदबंदी (864 मीएम), एफ = Fluo-3 प्रतिदीप्ति;. एफ अधिकतम = 2 सीए प्रत्येक प्रयोग के अंत में प्राप्त + संतृप्त प्रतिदीप्ति 12 विद्युत संकेतों और epifluorescent सीए 2 + संकेत दोनों एक साथ दर्ज हैं. कार्रवाई क्षमता 1.2x सीमा ताकत का 1 मिसे वर्तमान दालों का उपयोग वर्तमान दबाना मोड में 0.5 हर्ट्ज पर प्रेरित कर रहे हैं. एल प्रकार सीए 2 + धाराओं 100 मिसे से तेजी से ना + वर्तमान, पीछा निष्क्रिय -80 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता और -40 एम वी के लिए एक 100 मिसे रैंप नाड़ी का उपयोग वोल्टेज दबाना मोड में मापा जाता है 0.5 हर्ट्ज पर 10 एमवी के लिए परीक्षण पल्स.
Representative Results
चित्रा 2A पृथक मानव अधिकार आलिंद myocytes से तीन प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है. हम एक CellFinder खुर्दबीन स्लाइड (पर सेल निलंबन (कदम 5.5) का 10 μl विंदुक सेल उपज यों http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). 16.5 ± 3.1 cells/10 μl (एन 29 =) बनाम 5.1 ± 2.3 cells/10 μl: चित्रा 2B में औसतन सेल पैदावार स्पष्ट रूप से पुरानी वायुसेना (सीएएफ) में कम सेल पैदावार की प्रवृत्ति रोगी के नमूने (ट्यूब एक संकेत मिलता है कि (एन = 10) क्रमश: एसआर और सीएएफ में, पी <0.05, ट्यूब बी: 17.9 ± 3.9 cells/10 μl (एन 29 =) बनाम 5.9 ± एसआर और सीएएफ में 2.0 cells/10 μl (एन = 9), क्रमशः, पी = 0.107).
एक्शन से संभावित माप और साइटोसोलिक सीए 2 + यात्रियों के एक साथ रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 3 में दिए गए हैं. जांच की कोशिकाओं, टी के 90% के बारे मेंवह एक्शन से संभावित ट्रिगर सीए 2 + रिहाई स्पष्ट और नियमित रूप से सेल संकुचन का कारण बनता है. जैसा कि पहले बताया, सेल अखंडता के लिए एक स्वीकृत सूचक है जो आराम झिल्ली क्षमता, -73.9 बारे में औसतन ± 2.7 एम वी (एन = 23/10 myocytes / रोगियों) और -77.7 ± 1.8 एम वी (एन = 19/8 myocytes / रोगियों ) क्रमश एसआर और सीएएफ (पी> 0.05) में. 15 चित्रा 4 वोल्टेज gated एल प्रकार सीए 2 + धाराओं और साइटोसोलिक सीए 2 + यात्रियों के प्रतिनिधि एक साथ रिकॉर्डिंग से पता चलता है. गैर चयनात्मक β-adrenoceptor एगोनिस्ट isoprenaline (1 माइक्रोन) के आवेदन बरकरार β-एड्रीनर्जिक संकेत पारगमन झरना, सुझाव है कि मैं सीए, एल और साइटोसोलिक सीए 2 + यात्रियों दोनों के आयाम बढ़ जाती है.
एफigure 1. myocytes Fluo-3 का फ्लो चार्ट (कदम 6.1-6.5 देखें) प्रोटोकॉल लोड हो रहा हूँ. एम / वी, जन / मात्रा.
चित्रा 2. भंडारण समाधान में एक घंटे के बाद एक, पृथक मानव अधिकार आलिंद myocytes. बी, भंडारण समाधान में कोशिकाओं के 10 μl में गिना सेल उपज का ± SEM (कदम 5.5 देखें) मतलब. एन प्रत्येक समूह के भीतर तैयारियों की संख्या दर्शाता है. * पी <0.05.
एक्शन से संभावित ट्रिगर 2 सीए एक साइनस लय से एक आलिंद myocyte में + यात्रियों (कैट) और एक chr की चित्रा 3. प्रतिनिधि रिकॉर्डिंगonic अलिंद रोगी. ऊपर: इंजेक्शन उत्तेजना (0.5 हर्ट्ज) के लिए इस्तेमाल वर्तमान झिल्ली (मैं एम). नीचे: झिल्ली क्षमता (वी एम), और चालू होने वाले कैट (नीचे) की एक साथ रिकॉर्डिंग. (वोइट एट अल से अनुमति के साथ Replotted. 2012) 15
एल प्रकार 2 सीए पर isoprenaline (1 माइक्रोन) प्रभाव का आंकड़ा 4. प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग + वर्तमान ट्रिगर 2 सीए एक साइनस लय और एक पुरानी अलिंद रोगी से एक आलिंद myocyte में + यात्रियों (कैट). टॉप: वोल्ट दबाना प्रोटोकॉल (0.5 हर्ट्ज). नीचे: वर्तमान कुल शुद्ध झिल्ली की एक साथ रिकॉर्डिंग (मैं एम), मुख्य रूप से एल प्रकार सीए 2 + वर्तमान (मध्य) और ट्रिगर कैट (नीचे) को दर्शाती है. (वोइट से अनुमति के साथ Replotted,एट अल. 2012) 15
टेबल मैं समाधान.
तालिका II. विशिष्ट उपकरण.
टेबल तृतीय. Fluo-3 के साथ myocytes की लोडिंग के लिए पदार्थ AM.
टेबल चतुर्थ. पैच दबाना के लिए स्नान समाधान.
पैच दबाना * के लिए टेबल वी. पिपेट समाधान.
Discussion
यहाँ हम खुले दिल की सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त सही आलिंद उपांग से मानव आलिंद myocytes के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन है. साइटोसोलिक सीए 2 की माप के लिए इन myocytes उपयोग करने के लिए + हम भंडारण समाधान से EGTA omitting द्वारा एक पहले से वर्णित विधि 4-11 रूपांतरित किया.
पहले से ही 1970 में यह myocytes + पाचन के दौरान 2 सीए की उपस्थिति में अलग कर देना है, हालांकि उनमें से सब इसलिए contracture और अलाभकारी. 16,17 में थे कि मनाया गया, सेल अलगाव सीए 2 + मुक्त समाधान में किया जाता है. हालांकि, 2 सीए के शारीरिक सांद्रता की फिर से शुरूआत + तेजी सीए 2 + में बाढ़ और कोशिका मृत्यु हुई. यह मूल रूप से Zimmerman और Hulsman द्वारा perfused दिलों में मनाया गया, जिसमें सीए 2 + विरोधाभास घटना के रूप में वर्णित किया गया है. 7.0 पीएच की कमी, सहित अलगाव मीडिया के 18 संशोधनों <taurin 20 का या सीए 2 + (3.2 कदम और 4.1 देखें), 21 के साथ ही भंडारण समाधान 22 युक्त EGTA में पृथक myocytes के भंडारण की थोड़ी मात्रा के> 19 अतिरिक्त समर्थन सीए 2 + विरोधाभास. 17 को रोकने के लिए सुझाव दिया गया है हालांकि, यह अच्छी तरह से सीए 2 + EGTA माध्यम बफरिंग एल प्रकार 2 सीए के आयाम + वर्तमान प्रेरित सीए 2 + क्षणिक आयाम और सीए 2 + यात्रियों की एक Biphasic क्षय में परिणाम कम कर देता है कि जाना जाता है. 23 इसलिए, हम EGTA लोप विशिष्ट गुण और monophasic decays के साथ सीए 2 + यात्रियों को प्राप्त करने के क्रम में पूरे अलगाव प्रक्रिया के दौरान. सीए 2 से कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए + विरोधाभास हम 0.2 मिमी तक एक चरणबद्ध तरीके से भंडारण समाधान के अंतिम सीए 2 + एकाग्रता में वृद्धि हुई.
collagenase के चुनाव शायद सफल myocyte अलगाव के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है. पारंपरिक महाagenases क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से प्राप्त कच्चे तेल की तैयारी कर रहे हैं और अन्य proteinases, polysaccharidases और lipases के एक नंबर के अलावा collagenase होते हैं. उनके सामान्य संरचना collagenases के आधार पर विभिन्न प्रकार में विभाजित किया जाता है. 24 वर्थिंगटन collagenase प्रकार मैं और द्वितीय सफलतापूर्वक हमारे वर्तमान में वर्णित प्रोटोकॉल में मानव आलिंद myocytes से अलगाव. 4-10,15,25-30 के लिए इस्तेमाल किया गया है हम collagenase के इस्तेमाल की सिफारिश हम भी collagenase प्रकार द्वितीय का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की स्वीकार्य मात्रा में प्राप्त करने में सक्षम थे, हालांकि मैं टाइप करें. हालांकि, एक भी collagenase प्रकार के भीतर एंजाइम की गतिविधियों के बारे में एक महत्वपूर्ण बैच को बैच भिन्नता है. इन बदलावों सावधान बैच चयन और अलगाव की प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए विभिन्न बैचों के परीक्षण की आवश्यकता होती है. वर्थिंगटन बायोकेमिकल कार्पोरेशन (से ऑनलाइन उपलब्ध बैच चयन उपकरण http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) मानव आलिंद myocytes के अलगाव के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया है कि एक रचना के साथ उपलब्ध बैचों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान में हम collagenase 250 यू / मिलीग्राम collagenase गतिविधि, 345 यू / मिलीग्राम caseinase गतिविधि, 2.16 यू / मिलीग्राम clostripain गतिविधि और 0.48 यू / मिलीग्राम tryptic गतिविधि (बहुत # 49H11338) के साथ मैं प्रकार का उपयोग करें.
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त कोशिकाओं पैच दबाना पढ़ाई, सीए 2 + क्षणिक माप और इसके अलावा दोनों. 15 का एक संयोजन के लिए 8 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है, इन कोशिकाओं को बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के जवाब में सेलुलर संकुचन की माप की अनुमति या बिजली उत्तेजना पैच दबाना पिपेट (अप्रकाशित टिप्पणियों) का उपयोग कर.
Disclosures
वर्थिंगटन बायोकेमिकल कार्पोरेशन वीडियो फ़ाइल के उत्पादन की लागत को कवर द्वारा इस प्रकाशन का समर्थन किया. funders कोई अध्ययन डिजाइन में भूमिका, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी की थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
References
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