Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Isolering av humant Atrial myocytes for samtidige målinger av Ca Published: July 3, 2013 doi: 10.3791/50235
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver isolering av humane atrielle myocytter som kan brukes for intracellulær Ca

Abstract

Studiet av elektrofysiologiske egenskaper av kardiale ionekanaler med patch-clamp teknikken og utforskningen av hjerte mobilnettet Ca 2 + håndterer avvik krever isolerte cardiomyocytes. I tillegg er det mulig å undersøke myocytter fra pasienter ved hjelp av disse teknikker en uvurderlig kravet til å belyse den molekylære basis av kardiale sykdommer som atrial fibrillering (AF). Ett Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering av humane atrielle myocytter som er egnet for både patch-clamp studier og samtidige målinger av intracellulær Ca 2 + konsentrasjoner. Først er riktige auriklene innhentet fra pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi hakket i små vev biter ("blings metoden") og vasket i Ca 2 +-free løsning. Deretter vevet biter blir fordøyd i collagenase og protease inneholder løsninger med 20 mikrometer Ca 2 +. Deretter, de isolerte myocytes er harveSTED ved filtrering og sentrifugering av vev-suspensjon. Endelig er Ca 2 +-konsentrasjonen i cellen lagringsløsning justeres trinnvis til 0,2 mM. Vi kort diskutere betydningen av Ca 2 + og Ca 2 + bufring under isolasjon prosessen og også gi representative innspillinger av aksjonspotensialer og membran strømmer, både sammen med samtidig Ca 2 + forbigående målinger, utført i disse isolerte myocytes.

Introduction

Studerer elektrofysiologiske egenskapene til kardiale ionekanaler med patch-clamp teknikken og utforskningen av mobilnettet Ca 2 + håndtering unormalt krever isolerte cardiomyocytes. Disse er vanligvis oppnådd ved å følge den in vitro-eksponering av kardiale vevsprøver til fordøyelsesenzymer (kollagenase, hyaluronidase, peptidase etc.). Siden den første rapport av isolering av levedyktige hjertemuskelceller i 1955 2 en stor mengde protokoller er utviklet for å høste enkelt-atriale og ventrikulære kardiomyocytter fra forskjellige arter, inkludert mus, rotte, kanin, hund, marsvin og menneske. I denne gjennomgangen har vi fokus på isolering av humane atrie myocytes. Angående prosedyrer for isolering av myocytes fra andre arter vi refererer til "Worthington Tissue Dissosiasjon guide" levert av Worthington Biokjemisk Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).

et al. 3. Her har vi gi en trinn-for-trinn beskrivelse av en teknikk som er tilpasset fra en tidligere publisert metode, for å kunne skaffe atrielle myocytter egnet ikke bare for patch-clamp eksperimenter, men også for samtidig intracellulære Ca 2 + målinger. 4-11

Protocol

Eksperimentelle protokoller må godkjennes av den lokale etiske komité og alle pasienter må gi skriftlig informert samtykke. Vår forskning ble godkjent av etisk komité for medisinsk fakultet Mannheim, Universitetet i Heidelberg (# 2011-216N-MA) og ble utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke.

0. Innhenting Menneskelig atrievev

Under rutinemessig kanylering prosedyrene i pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi for hjerte-bypass grafting, er spissen av den høyre atriale vedheng fjernes vanligvis og kan brukes for isolering av atriale kardiomyocytter. Etter eksisjon vevsprøve overføres umiddelbart til en 50 ml Falcon rør med sterilt Ca 2 +-fri transport-oppløsning inneholdende 2,3-butandion monoxime (tabell I; BDM kontraktile hemmer, forhindrer myocyte contracture). Med transport ganger mellom 30 og 45 min, hadde vi ikke gjenkjenne en klar fordel av kjøling eller oksygentilførsel med hensyn til både antallet og kvaliteten på isolerte atrial cardiomyocytes. Generelt transport til laboratoriet bør være så rask som mulig. Imidlertid, hvis lengre transporttid ikke kan unngås, transport ved 4 ° C i oksygenert løsning kan være fordelaktig.

En. Prearrangements

  1. Slå på thermocirculator, som styrer temperaturen av den mantlede begerglasset (tabell II). Sørge for at temperaturen inne i begeret er lik 37 ° C. Dekk til begerglasset med et glasslokk å opprettholde en konstant temperatur i begerglasset gjennom hele isolasjon prosessen.
  2. Vei Collagenase jeg og Protease XXIV i tre glass kanner og lagre det ved romtemperatur. Enzymene vil fortynnes umiddelbart før bruk.
  3. Lagre 20 ml av Ca 2 +-fri løsning i en petriskål ved 4 ° C.
  4. Lagre 250 ml av Ca 2 +-fri løsning i et vannbad ved 37 ° C.

2. Rengjøring av vevet

  1. Overfør vevsprøve sammen med transport-løsning inn i en petriskål (~ 10 cm diameter) og fjerne fettvev grovt med saks.
  2. Vei vevsprøve. Mellom 200 og 600 mg brukes for celle isolasjon. Den gjenværende vev kan bli frosset i flytende nitrogen for senere biokjemisk analyse.
  3. Overfør vevsprøve til petriskålen inneholdende 20 ml Ca 2 +-fri oppløsning ved 4 ° C (se trinn 1.3) og hakk vevsprøve i små biter på omtrent 1 mm 3 i størrelse.
  4. Følgende trinn skal utføres ved 37 ° C og under kontinuerlig gassing med 100% O 2. En pipette tips kan plasseres på oksygen tube for å unngå sterk boblende og generere kontinuerlig luftstrøm.
  5. Overfør vevet biter sammen med Ca2 +-fri løsning itil den mantlede begerglass og rør forsiktig for omtrent 3 minutter med en magnetisk rørestav.
  6. Stopp omrøring og la vev biter å slå seg ned i noen sekunder. Nøye press supernatanten gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, Tabell II). Returnere forankrede vev biter fra mesh i begeret med tang.
  7. Refill begeret med Ca 2 + gratis løsning og gjenta vasketrinnet 2,4 og 2,5 to ganger.

3. Først enzymatisk fordøyelse

  1. Re-suspendere vev biter med 20 ml enzym løsning E1 (tabell I) inneholder kollagenase og protease og rør forsiktig i 10 min.
  2. Tilsett 40 pl av 10 mM CaCl 2-løsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 uM Ca 2 +.
  3. Etter 35 min belastning supernatanten forsiktig gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, Tabell II) på en slik måte at det meste av vev biter forbli i begerglasset. Returnere restenregnet vev biter fra maskeveggen i begerglasset.

4. Second enzymatisk fordøyelse

  1. Resuspender vev biter igjen med 20 ml enzym løsning E2 inneholder collagenase jeg bare (Tabell I). Tilsett 40 pl av 10 mM CaCl 2-løsning umiddelbart for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 uM Ca 2 +.
  2. I løpet av andre fordøyelsen bruke saks til ytterligere hogge vev klumper innimellom.
  3. Etter 5 min ta en prøve ved anvendelse av en Pasteur-pipette for å kontrollere dissosiasjon av cellene. Gjenta dette hver 2-3 min før stavformede, tverrstripet cardiomyocytes vises.
  4. Stopp omrøring og la vev biter å slå seg ned i ca 20-30 sek.
  5. Sil supernatanten forsiktig gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, Tabell II) i et 50 ml Falcon-rør (strømpe A). Returner de fastholdte vevet biter fra maskeveggen i begerglasset.
  6. Re-suspendere vev biter i begeret med 20 ml storage-løsning (tabell I) 10 og ytterligere dissosiere cellene ved forsiktig mekanisk finfordeling ved hjelp av en 20 ml serologisk pipette med dispenseren. Prøv å unngå bobledannelse siden bobler er skadelig for celle overlevelse og kvalitet.
  7. Sil supernatanten forsiktig gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, tabell II) i et 50 ml Falcon rør (rør B).

5. Siste forberedelse og justering av Final Ca 2 + konsentrasjon

  1. Sentrifuger både Falcon rør A og B (se trinn 4,5 og 4,7) ved 95 x g i 10 min.
  2. Fjern supernatanten fra begge rørene nøye ved aspirasjon. Sørg for ikke å forstyrre pelleten. Kast supernatanten.
  3. Re-suspendere begge pellets i 1,5 ml lagringsløsning (tabell I) hver (romtemperatur).
  4. Legg til to ganger 7,5 mL av 10 mM CaCl 2 løsning til hver Falcon og rør forsiktig. Inkuber i 10 min etter hvert trinn.
  5. Tilsett 15 pl av 10 mM CaCl 2-løsning for å oppnå en endelig Ca 2 +-konsentrasjon på 0,2 mM.

6. Lasting av myocytes med fluoriserende Ca 2 +-indikator Fluo-3 AM (figur 1)

  1. Overfør 1,5 ml cellesuspensjon (rør A og / eller rør B) inn i et 2 ml mikrosentrifugerør (Eppendorf rør).
  2. Følgende trinn skal utføres under vurdering av lysfølsomheten av fluorescerende Ca 2 + Indikator Fluo-3.
  3. Oppløs 50 ug av membranen gjennomtrengelig acetoksymetyl esterderivat av Fluo-3 (Fluo-3 AM, tabell III) i 44 mL av Pluronic F-127 (tabell III) stamoppløsning (20% w / v i vannfri DMSO) for å komme en 1 mM Fluo-3 AM stamoppløsning, som kan lagres ved -20 ° C i maksimalt en uke.
  4. Tilsett 15 pl av den Fluo-3 AM stamoppløsning til mikrosentrifugerør inneholdende 1,5 ml cellesuspensjon (se trinn 6.1) og agiterenøye.
  5. Inkuber cellesuspensjon i 10 min i et optisk ugjennomsiktig boksen.
  6. Kort sentrifuger ved ca 6000 rpm.
  7. Kast supernatanten og resuspendere pelleten i 1,5 ml bad-oppløsning (tabell IV).
  8. Forlate cellen suspensjon i ca 30 min for de-esterifisering før du begynner med eksperimenter.

7. Samtidige Patch-klemme og Epifluorescent Ca 2 + Målinger

Siden patch-klemme målinger er ikke det store temaet for denne anmeldelsen, vi henviser den interesserte leseren til andre publikasjoner som gir en mer dyptgående beskrivelse av denne teknikken. 11-14 For helhetens skyld gir vi en kort oppsummering av en protokoll for å måle aksjonspotensialer eller L-type Ca 2 +-strømmer, både sammen med samtidige Ca 2 +-transient opptak.

Under eksperimenter myocytes er superfuseres ved 37 ° C med badekar solutipå (tabell IV) med en rask perfusjon system (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). For spennings-klemme eksperimenter, er K +-strømmer blokkert ved tilsetning av 4-aminopyridin (5 mmol / liter) og bacl 2 (0,1 mmol / L) til badet løsning. Borsilikatglass microelectrodes brukes og burde ha slege motstand på 2-5 MΩ når de er fylt med pipette løsning (Tabell V). I tillegg til Fluo-3 AM lasting av myocytter (se punkt 6), er Fluo-3 også inkludert i pipette-løsning (tabell V). Fluorescens er spent på 488 nm og lyset (<520 nm) omdannet til [Ca 2 +] i forutsatt

Ligning 1


hvor k = d dissosiasjonskonstanten Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescens;. F max = Ca 2 +-mettet fluorescens innhentet ved slutten av hvert forsøk 12 Både elektriske signaler og epifluorescent Ca 2 +-signaler registreres samtidig. Aksjonspotensialer blir stimulert ved 0,5 Hz i current-klemme modus ved hjelp av en msek gjeldende pulser av 1,2 x terskel styrke. L-type Ca2 +-strømmer er målt i spennings-klemme-modus ved hjelp av et holdepotensial på -80 mV, og en 100-msek rampe-puls til -40 mV for å inaktivere den raske Na +-strøm, etterfulgt av en 100-msek test-puls til 10 mV ved 0,5 Hz.

Representative Results

Figur 2A viser tre representative eksempler fra isolerte menneskerettighetsaktivister atrie myocytes. For å kvantifisere celle utbytte vi pipetteres 10 pl cellesuspensjon (trinn 5.5) på en CellFinder objektglass ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Gjennomsnittlig celleutbytte i figur 2B viser tydelig at det er en tendens til lavere celleutbytte i kronisk AF (CAF) pasientprøver (tube A: 16,5 ± 3,1 cells/10 mL (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 cells/10 ul (n = 10) i SR og Caf, henholdsvis p <0,05; tube B: 17,9 ± 3,9 cells/10 ul (n = 29) vs 5,9 ± 2,0 cells/10 ul (n = 9) i SR og Caf, henholdsvis, p = 0,107).

Representative eksempler på action-potensial målinger og samtidige opptak av cytosoliske Ca 2 + transienter er gitt i figur 3.. I ca 90% av de undersøkte celler, than action-potensial-utløst Ca 2 + utgivelsen fører til klare og vanlig celle sammentrekninger. Som rapportert tidligere, i gjennomsnitt hvile membran potensial, som er en akseptert indikator for celle integritet, ca -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocytes / pasienter) og -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocytes / pasienter ) i SR og CAF henholdsvis (p> 0,05). 15 Figur 4 viser representative samtidige opptak av spenning-gated L-type Ca 2 +-strømmer og cytosolic Ca 2 + transienter. Anvendelse av den ikke-selektive β-adrenoreseptoragonist isoprenalin (1 uM), øker amplituden på både I Ca, L og cytosoliske Ca 2 +-transienter, noe som tyder intakt β-adrenerg signaltransduksjon kaskaden.

Figur 1
Figur 1. Flow diagram av myocytes Fluo-3 AM lasting protokollen (se trinn 06.01 til 06.05). m / v, masse / volum.

Figur 2
Figur 2. A, Isolerte menneskerettighetsaktivister atriefrekvenser myocytes etter en time i lagringsløsning. B, Mean ± SEM av cellen avkastning regnet i 10 mL av celler i lagringsløsning (se trinn 5.5). n refererer til antallet av preparater innenfor hver gruppe. * P <0,05.

Figur 3
Figur 3. Representative opptak av action-potensial-utløst Ca 2 +-transienter (katt) i en atrial myocyte fra en sinusrytme og en chronic atrieflimmer pasienten. Topp: Injisert membran (I M) som brukes for stimulering (0,5 Hz). Under: Samtidig opptak av membranpotensialet (V M), og utløste CAT (nederst). (Plottes på nytt med tillatelse fra Voigt et al. 2012) 15

Figur 4
Figur 4. Representative innspillinger av isoprenalin (1 mikrometer) effekt på L-type Ca 2 + strøm-utløst Ca 2 +-transienter (katt) i en atrial myocyte fra en sinusrytme og en kronisk atrieflimmer pasienten. Topp: Spenning-klemme-protokollen (0,5 Hz). Under: Samtidig opptak av samlet netto membran (I M), hovedsakelig som følge av L-type Ca 2 + strøm (i midten) og utløste CAT (nederst). (Plottes på nytt med tillatelse fra Voigt,et al. 2012) 15

Tabell 1
Tabell I. Solutions.

Tabell 2
Tabell II. Spesifikke utstyret.

Tabell 3
Tabell III. Stoffer for lasting av myocytes med Fluo-3 AM.

Tabell 4 Tabell IV. Badekar løsning for patch-clamp.

Tabell 5
Tabell V. Pipette løsning for patch-clamp *.

Discussion

Her beskriver vi en metode for isolering av humane atriefrekvenser myocytes fra høyre auriklene innhentet fra pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi. For å kunne bruke disse myocytes for målinger av cytosolisk Ca 2 + vi tilpasset en tidligere beskrevet metode 4-11 ved å utelate EGTA fra lagringsløsning.

Allerede i 1970 ble det observert at selv om myocytes dissosierer i nærvær av Ca 2 + i løpet av fordøyelsen, alle var in kontraktur og ikke-levedyktige. 16,17 er derfor isolert celle utført i Ca2 +-fri løsning. Imidlertid re-innføring av fysiologiske konsentrasjoner av Ca2 + resulterte i hurtig Ca 2 + tilstrømning og celledød. Dette har blitt beskrevet som den Ca 2 + paradoksale fenomen som opprinnelig ble observert i perfused hjerter av Zimmerman og Hulsman. 18. Modifikasjoner av isoleringsventilen medier, inkludert reduksjon av pH til 7,0, <sup> 19 tilsetning av TAURIN 20 eller av små mengder av Ca 2 + (se trinn 3.2 og 4.1), 21 så vel som lagring av isolerte myocytter i EGTA inneholdende lagring-løsning 22 har vært foreslått for å hindre at Ca 2 + paradoks. 17. Imidlertid er det vel kjent at Ca 2 + bufring gjennom EGTA reduserer amplituden av L-type Ca2 + strøm-indusert Ca2 + transient amplituder og resulterer i en bifasisk nedbrytning av Ca 2 + transienter. 23. Derfor utelates vi EGTA gjennom hele prosessen isolasjon for å oppnå Ca 2 + transienter med typiske egenskaper og monofasisk henfall. For å beskytte cellene fra Ca 2 + paradoks vi økt den siste Ca 2 + konsentrasjon av lagringsløsning økes trinnvis inntil 0,2 mm.

Valget av collagenase er trolig den mest kritiske trinnet for vellykket myocyte isolasjon. Konvensjonell collagenases er råolje preparater hentet fra Clostridium histolyticum og inneholder kollagenase i tillegg til en rekke andre proteinaser, polysaccharidases og lipaser. Basert på deres generelle sammensetning collagenases er delt inn i ulike typer. 24. Worthington kollagenaseklassene type I og II har blitt brukt for isolering av humane atrie myocytes. 4-10,15,25-30 I vår dag beskrives protokollen vi anbefaler bruk av collagenase Type I, selv om vi var også i stand til å oppnå akseptable mengder av levedyktige celler ved hjelp av kollagenase type II. Men selv innenfor en eneste kollagenase typen er det en betydelig batch-til-batch variasjon angående enzymaktivitet. Disse variasjonene krever nøye batch valg og testing av ulike grupper for å optimalisere isolasjon prosedyre. Den elektroniske tilgjengelig batch-utvalget verktøyet fra Worthington Biokjemisk Corp ( http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) kan brukes for å finne ledige batcher med en sammensetning som har vist seg å være egnet for isolering av humane atrielle myocytter. Foreløpig bruker vi collagenase type I med 250 U / mg kollagenaseaktivitet, 345 U / mg caseinase aktivitet, 2,16 U / mg clostripain aktivitet og 0,48 U / mg tryptic aktivitet (vare # 49H11338).

Cellene oppnådd ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i dette manuskriptet kan brukes innenfor 8 timers for patch-clamp studier, Ca 2 + transiente målinger og en kombinasjon av begge. 15. I tillegg er disse celler tillater målinger av cellulær sammentrekning som reaksjon på elektriske feltet stimulering eller elektrisk stimulering ved hjelp av patch-clamp pipette (upubliserte observasjoner).

Disclosures

Worthington Biokjemisk Corp støttet denne publikasjonen ved å dekke produksjonskostnadene for videofil. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Acknowledgments

I tillegg vil vi takke de kardiale kirurger ved Universitetet i Heidelberg for levering av menneskelig atrial vev og Claudia Liebetrau, Katrin Kupser og Ramona Nagel for deres utmerkede teknisk støtte. Spesiell takk også til Andy W. Trafford for hans nyttige forslag og råd i etableringsfasen av Ca 2 + forbigående målinger. Forfatterne ønsker å uttrykke sin dypeste takknemlighet til medlemmer av Institutt for farmakologi og toksikologi (hode: Ursula Ravens) av Dresden teknologiske universitet for muligheten de tilbød oss ​​å lære grunnleggende teknikker og ferdigheter i mobilnettet elektrofysiologi og cardiomyocyte isolasjon.

Forfatternes forskning er støttet av den tyske Research Foundation (Do769/1-1-3), den tyske føderale Utdannings-og forskningsdepartementet gjennom atrieflimmer Competence Network (01Gi0204) og den tyske Senter for Cardiovascular Research, EU gjennom Europa, Nettverk for translasjonsforskning i atrieflimmer (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, i stor skala integrere prosjektet Proposal No 261 057) og den europeisk-nordamerikanske atrieflimmer Forskning Alliance (ENAFRA) tilskudd av Fondation Leducq (07CVD03).

Skjematisk oversikt vist i videoen filen ble produsert ved hjelp av Servier medisinsk art.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transport solution
Albumin Sigma-Aldrich A3059 Storage solution: 1%
BDM Sigma-Aldrich 31550 Transport solution: 30
DL-b-Hydroxy-butyric acid Sigma-Aldrich H6501 Storage solution: 10
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Transport solution: 20
Ca2+-free solution: 20
Enzyme solution E1 and E2: 20
Storage solution: 10
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G1251 Storage solution: 70
KCl Merck 1049360250 Transport solution: 10
Ca2+-free solution: 10
Enzyme solution E1 and E2: 10
Storage solution: 20
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655 Transport solution: 1.2
Ca2+-free solution: 1.2
Enzyme solution E1 and E2: 1.2
Storage solution: 10
MgSO4 Sigma-Aldrich M9397 Transport solution: 5
Ca2+-free solution: 5
Enzyme solution E1 and E2: 5
MOPS Sigma-Aldrich M1254 Transport solution: 5
Ca2+-free solution: 5
Enzyme solution E1 and E2: 5
NaCl Sigma-Aldrich S3014 Transport solution: 100
Ca2+-free solution: 100
Enzyme solution E1 and E2: 100
Taurin Sigma-Aldrich 86330 Transport solution: 50
Ca2+-free solution: 50
Enzyme solution E1 and E2: 50
Storage solution: 10
Collagenase I Worthington 4196 Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml
Protease XXIV Sigma-Aldrich P8038 Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*
pH Transport solution: 7.00
Ca2+-free solution: 7.00
Enzyme solution E1 and E2: 7.00
Storage solution: 7.40
adjusted with Transport solution: 1 M NaOH
Ca2+-free solution: 1 M NaOH
Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH
Storage solution: 1 M KOH
Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.
Table I. Solutions.
Nylon mesh (200 μm) VWR-Germany 510-9527
Jacketed reaction beaker VWR KT317000-0050
Table II. Specific equipment.
Dimethyl-sulphoxide Sigma-Aldrich D2650
Fluo-3 AM (special packaging) Invitrogen F-1242
Pluronic F-127 Invitrogen P6867
Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.
4-aminopyridine* Sigma-Aldrich A78403 Bath solution: 5
BaCl2* Sigma-Aldrich 342920 Bath solution: 0.1
CaCl2 × 2H2O Sigma-Aldrich C5080 Bath solution: 2
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Bath solution: 10
HEPES Sigma-Aldrich H9136 Bath solution: 10
KCl Merck 1049360250 Bath solution: 4
MgCl × 6H2O Sigma-Aldrich M0250 Bath solution: 1
NaCl Sigma-Aldrich S3014 Bath solution: 140
Probenecid Sigma-Aldrich P8761 Bath solution: 2
pH Bath solution: 7.35
adjusted with Bath solution: 1 M HCl
Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.
DL-aspartat K+-salt Sigma-Aldrich A2025 Pipette solution: 92
EGTA Sigma-Aldrich E4378 Pipette solution: 0.02
GTP-Tris Sigma-Aldrich G9002 Pipette solution: 0.1
HEPES Sigma-Aldrich H9136 Pipette solution: 10
KCl Merck 1049360250 Pipette solution: 48
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Pipette solution: 1
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383 Pipette solution: 4
Fluo-3** Invitrogen F3715 Pipette solution: 0.1
pH 7.20
adjusted with 1 M KOH
Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
  2. Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
  3. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
  4. Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
  5. Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
  6. Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
  7. Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
  8. Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
  9. Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
  10. Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
  11. Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
  12. Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
  13. Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
  14. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  15. Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
  16. Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
  17. Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
  18. Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  19. Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
  20. Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
  21. Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
  22. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
  23. Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
  24. Worthington, K., Worthington, V. Worthington Enzyme Manual. , (1993).
  25. Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
  26. Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
  27. Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
  28. Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
  29. Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
  30. Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).

Tags

Cellular Biology medisin molekylærbiologi fysiologi anatomi kardiologi farmakologi menneskelige atriefrekvenser myocytes celle isolasjon kollagenaseklassene kalsium forbigående kalsium strøm patch-klemme ion strøm isolasjon cellekultur myocytes cardiomyocytes elektrofysiologi patch clamp
Isolering av humant Atrial myocytes for samtidige målinger av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienter og Membran Currents
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D.More

Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents. J. Vis. Exp. (77), e50235, doi:10.3791/50235 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter