Summary
Se describe el aislamiento de miocitos auriculares humanos que pueden ser utilizados para el Ca intracelular
Abstract
El estudio de las propiedades electrofisiológicas de los canales iónicos cardíacos con la técnica de patch-clamp y la exploración de celular cardiaca Ca 2 + anomalías manejo requiere cardiomiocitos aislados. Además, la posibilidad de investigar los miocitos de los pacientes que utilizan estas técnicas es un requisito muy valiosa para dilucidar la base molecular de las enfermedades cardiacas tales como la fibrilación auricular (FA). 1 Aquí se describe un método para el aislamiento de miocitos auriculares humanos que son adecuados para ambos estudios de patch-clamp y mediciones simultáneas de 2 concentraciones de Ca + intracelular. En primer lugar, apéndices auriculares adecuados obtenidos de pacientes sometidos a cirugía a corazón abierto se cortan en trozos pequeños de tejido ("método trozo") y se lavaron en solución de Ca 2 + libre. A continuación, los trozos de tejidos se digieren en colagenasa y proteasa que contiene soluciones con 20 mM de Ca 2 +. A partir de entonces, los miocitos aislados son harvested por filtración y la centrifugación de la suspensión de tejido. Por último, la concentración de Ca2 + en la solución de almacenamiento celular se ajusta paso a paso a 0,2 mM. Se discute brevemente el significado de Ca 2 + y Ca 2 + amortiguación durante el proceso de aislamiento y también proporcionar grabaciones representativas de los potenciales de acción y las corrientes de membrana, tanto con simultánea Ca 2 + transitorios mediciones, realizadas en estos miocitos aislados.
Introduction
El estudio de las propiedades electrofisiológicas de los canales iónicos cardíacos con la técnica de patch-clamp y la exploración de Ca2 + celular anomalías de manejo requieren cardiomiocitos aislados. Estos se obtienen normalmente después de la exposición in vitro de muestras de tejidos cardiacos a las enzimas digestivas (colagenasa, hialuronidasa, peptidasa, etc). Desde el primer informe de aislamiento de los miocitos cardíacos viables en 1955 2 una gran cantidad de protocolos ha sido desarrollado con el fin de cosechar individuales cardiomiocitos auriculares y ventriculares a partir de diferentes especies, incluyendo ratón, rata, conejo, perro, conejillo de indias y humanos. En esta revisión, nos centramos en el aislamiento de los miocitos auriculares humanos. En cuanto a los procedimientos para el aislamiento de los miocitos de otras especies nos referimos a la "Worthington Tissue disociación guía" proporcionada por Worthington Biochemical Corp., EE.UU. ( www.tissuedissociation.com ).
et al. 3 A continuación presentamos una descripción paso a paso de una técnica, la cual está adaptada a partir de un método publicado previamente, con el fin de obtener miocitos auriculares adecuados no sólo para los experimentos de patch-clamp, sino también por Ca 2 + intracelular mediciones simultáneas. 4-11
Protocol
Los protocolos experimentales deben ser aprobados por el comité de ética local y todos los pacientes deben dar su consentimiento informado por escrito. Nuestra investigación fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de Mannheim, Universidad de Heidelberg (# 2011-216N-MA) y se llevó a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.
0. Obtención de tejido auricular humano
Durante los procedimientos de canulación de rutina en pacientes sometidos a cirugía a corazón abierto para injerto de bypass cardiopulmonar, la punta del apéndice auricular derecho generalmente se extirpa y se puede utilizar para el aislamiento de miocitos auriculares. Después de la escisión de la muestra de tejido se transfiere inmediatamente a un tubo de 50 ml Falcon estéril con Ca 2 + sin solución de transporte que contiene 2,3-butanodiona monoxima (Tabla I; BDM, inhibidor de la contracción, la prevención de los miocitos contracture). Con tiempos de transporte entre los 30 y 45 min, no reconocimos una clara ventaja de refrigeración u oxigenación con respecto al número y calidad de los miocitos auriculares aislados. En general de transporte al laboratorio debe ser lo más rápido posible. Sin embargo, si es más largo el tiempo de transporte no se puede evitar, de transporte a 4 ° C en solución oxigenada podría ser ventajoso.
1. Prearrangements
- Encender el thermocirculator, que controla la temperatura del vaso de precipitados con camisa (Tabla II). Asegúrese de que la temperatura dentro del recipiente es igual a 37 ° C. Cubrir el vaso con una tapa de vidrio para mantener una temperatura constante dentro del vaso de precipitados a lo largo de todo el proceso de aislamiento.
- Pese la colagenasa I y XXIV proteasa en tres vasos de vidrio y guárdelo a temperatura ambiente. Las enzimas se diluyeron justo antes de su uso.
- Tienda 20 ml de Ca 2 + solución libre en una placa de Petri a 4 ° C.
- Tienda 250 ml de Ca 2 + solución libre en un baño de agua a 37 ° C.
2. Limpieza del tejido
- Transferir la muestra de tejido, junto con la solución de transporte en una placa de Petri (~ 10 cm de diámetro) y eliminar el tejido graso utilizando más o menos unas tijeras.
- Pesar la muestra de tejido. Entre 200 y 600 mg se utilizan para el aislamiento de células. El tejido restante se puede congelar en nitrógeno líquido para su posterior análisis bioquímico.
- Transferir la muestra de tejido en la placa de Petri que contiene 20 ml de solución de Ca 2 + libre a 4 º C (véase el paso 1.3) y cortar la muestra de tejido en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm de tamaño 3.
- Los siguientes pasos deben ser ejecutados a 37 ° C y bajo gasificación continua con O2 al 100%. Una punta de la pipeta se puede colocar sobre el tubo de oxígeno para evitar la fuerte burbujeo y generar un flujo de aire continuo.
- La transferencia de los trozos de tejido junto con la solución 2 + libre de Ca enal vaso de precipitados con camisa y se agita cuidadosamente durante aproximadamente 3 minutos con una barra de agitación magnética.
- Detener la agitación y permitir que los trozos de tejido para establecerse durante unos segundos. Colar con cuidado el sobrenadante a través de una malla de nylon (200 micras, Tabla II). Volver a los trozos de tejido restringidas de la malla en el vaso con unas pinzas.
- Vuelva a llenar el vaso con Ca 2 + solución gratuita y repetir la etapa de lavado 2,4 y 2,5 dos veces.
3. En primer lugar la digestión enzimática
- Vuelva a suspender los trozos de tejido con 20 ml de solución de enzima E1 (Tabla I) que contiene colagenasa y proteasa y se agita cuidadosamente durante 10 min.
- Añadir 40 l de 10 mM CaCl 2-solución para obtener una concentración final de 20 mM Ca 2 +.
- Después de 35 min la cepa cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nylon (200 micras, Tabla II) de una manera que la mayor parte de los trozos de tejido permanecen en el vaso de precipitados. Volver restollovió trozos de tejido de la malla en el vaso de precipitados.
4. En segundo lugar digestión enzimática
- Resuspender los trozos de tejido de nuevo con 20 ml de solución de enzima E2 que contiene colagenasa I sólo (Tabla I). Añadir 40 l de 10 mM CaCl 2-solución inmediatamente para obtener una concentración final de 20 mM Ca 2 +.
- Durante el segundo tijeras para cortar el uso de digestión más coágulos tejido ocasionalmente.
- Después de 5 minutos tomar una muestra con una pipeta Pasteur para comprobar la disociación de las células. Repita esto cada 2-3 minutos hasta que aparezcan en forma de barra, cardiomiocitos estriados.
- Detener la agitación y permitir que los trozos de tejido que se establecen por unos 20 a 30 segundos.
- Colar el líquido sobrenadante con cuidado a través de una malla de nylon (200 m, Tabla II) en un tubo de 50 ml Falcon (Tubo A). Volver a los trozos de tejido restringidas de la malla en el vaso.
- Vuelva a suspender los trozos de tejido en el vaso con 20 ml Storasolución de GE (Tabla I) 10 y disociar aún más las células por trituración mecánica suave con una pipeta serológica de 20 ml con dispensador. Trate de evitar la formación de burbujas ya que las burbujas son perjudiciales para la supervivencia celular y la calidad.
- Colar el líquido sobrenadante con cuidado a través de una malla de nylon (200 m, Tabla II) en un tubo de 50 ml Falcon (Tubo B).
5. Preparación final y ajuste final de Ca 2 + de concentración
- Centrifugar tanto en tubos Falcon de A y B (véase el paso 4.5 y 4.7) a 95 xg durante 10 min.
- Eliminar el sobrenadante de ambos tubos cuidadosamente por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. Descartar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las dos pastillas de 1,5 ml solución de almacenamiento (Tabla I) cada uno (temperatura ambiente).
- Agregue dos veces 7,5 l de solución de 10 mM CaCl 2 a cada Falcon y remover con cuidado. Incubar durante 10 min después de cada paso.
- Añadir 15 l de solución 10 mM de CaCl2 para obtener una final concentración de Ca2 + de 0,2 mM.
6. Carga de los miocitos con el Ca 2 +-fluorescente indicador Fluo-3 AM (Figura 1)
- Transferir 1,5 ml de suspensión celular (tubo A y / o el tubo B) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml (tubo Eppendorf).
- Los siguientes pasos deben ser ejecutados bajo la consideración de la sensibilidad a la luz del fluorescente de Ca 2 + Indicador Fluo-3.
- Disolver 50 g de la membrana permeable derivado de éster de acetoximetilo de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabla III) en 44 l de Pluronic F-127 (Tabla III) solución madre (20% w / v en DMSO anhidro) para conseguir un 1 mM de Fluo-3 a.m. solución madre, que puede ser almacenado a -20 ° C durante un máximo de 1 semana.
- Añadir 15 l de la Fluo-3 a.m. solución madre al tubo de microcentrífuga que contiene 1,5 ml de suspensión de células (véase el paso 6.1) y agitarcuidadosamente.
- Incubar la suspensión de células durante 10 min en una caja ópticamente opaca.
- Centrifugar brevemente a aproximadamente 6.000 rpm.
- Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1,5 ml de solución de baño (Tabla IV).
- Agregar la suspensión de células durante aproximadamente 30 min para la de-esterificación antes de comenzar con los experimentos.
7. Patch-clamp y epifluorescencia Ca 2 + mediciones simultáneas
Dado que las mediciones de patch-clamp no son el tema principal de esta revisión, remitimos al lector interesado a otras publicaciones que proporcionan una descripción más profunda de esta técnica. 11-14 En aras de la exhaustividad, se proporciona un breve resumen de un protocolo para medir potenciales de acción o L-tipo Ca 2 + corrientes, ambos junto con grabaciones simultáneas Ca 2 +-transitorios.
Durante los experimentos miocitos se superfundieron a 37 ° C con bañera solutien (Tabla IV) usando un sistema de perfusión rápida (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Para los experimentos de fijación de voltaje, corrientes de K + se bloquean mediante la adición de 4-aminopiridina (5 mmol / L) y BaCl 2 (0,1 mmol / L) a la solución del baño. Microelectrodos de vidrio de borosilicato se utilizan y deben inclinar han resistencias de 2-5 mW cuando se llena con la solución de la pipeta (Tabla V). Además de la Fluo-3 a.m. carga de los miocitos (vea el paso 6), Fluo-3 también se incluye en la solución de la pipeta (Tabla V). Fluorescencia se excita a 488 nm y la luz emitida (<520 nm) convierte en [Ca 2 +] i suponiendo
donde k d = constante de disociación de Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescencia;. F max = Ca 2 +-saturada de fluorescencia obtenido al final de cada experimento 12 Ambas señales eléctricas y señales de Ca 2 + epifluorescencia se registran simultáneamente. Los potenciales de acción son estimulados a 0,5 Hz en modo de corriente-clamp con 1 ms pulsos de corriente de fuerza umbral de 1,2 x. De tipo L Ca 2 +-corrientes se miden en el modo de fijación de voltaje con un potencial de mantenimiento de -80 mV y una rampa de 100 mseg-pulso a -40 mV para inactivar el ayuno de Na +-corriente, seguido de un 100-mseg prueba de pulso a 10 mV a 0,5 Hz.
Representative Results
Figura 2A muestra tres ejemplos representativos de miocitos aislados de aurícula derecha. Para cuantificar el rendimiento de células que pipeta de 10 l de suspensión celular (paso 5.5) en un portaobjetos CellFinder ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Rendimientos celulares promediados en la Figura 2B indican claramente que hay una tendencia a la baja en los rendimientos celulares FA crónica (CAF) muestras de pacientes (tubo A: 16,5 ± 3,1 células/10 l (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 l células/10 (n = 10) en la SR y la CAF, respectivamente, p <0,05; tubo B: 17,9 ± 3,9 células/10 l (n = 29) frente a 5,9 ± 2,0 células/10 l (n = 9) en SR y la CAF, respectivamente, p = 0,107).
Los ejemplos representativos de las mediciones del potencial de acción y grabaciones simultáneas de citosólica de Ca 2 + transitorios se dan en la Figura 3. En aproximadamente el 90% de las células investigadas, tque la acción potencial desencadenado Ca 2 + en libertad hace que las contracciones de células claras y regulares. Como se informó anteriormente, el potencial de membrana en reposo, que es un indicador aceptado de la integridad celular, promedio de alrededor de -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 / miocitos pacientes) y -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 / miocitos pacientes ) en la SR y la CAF, respectivamente (p> 0,05). 15 Figura 4 muestra grabaciones simultáneas representativas de voltaje de tipo L de Ca 2 + corrientes y citosólica de Ca 2 + transitorios. Aplicación de la isoprenalina agonista β-adrenérgico no selectivo (1 M) aumenta amplitudes de ambas Ca I, L y citosólica de Ca 2 + transitorios, lo que sugiere intacta β-adrenérgico cascada de transducción de señal.
Figura 1. Diagrama de flujo de los miocitos Fluo-03 a.m. cargando protocolo (véase el paso 6.1 a 6.5). m / v, masa / volumen.
Figura 2. A, miocitos aislados de aurícula derecha después de una hora en una solución de almacenamiento. B, Media ± SEM del rendimiento de células contadas en 10 l de células en solución de almacenamiento (véase el paso 5.5). n se refiere al número de preparaciones dentro de cada grupo. * P <0,05.
Figura 3. Grabaciones representativas del potencial de acción activada por Ca 2 +-transitorios (CAT) en un miocito auricular de un ritmo sinusal y la Comisión de Derechos Humanoslos pacientes de fibrilación auricular ónico. Top: corriente inyectada membrana (I M) que se utiliza para la estimulación (0,5 Hz). Abajo: Grabación simultánea de potencial de membrana (V M), y el gato activado (abajo). (Dibujado de nuevo con el permiso de Voigt et al. 2012) 15
Figura 4. Grabaciones representativas de la (1 M) efecto de isoprenalina en L-tipo Ca 2 + corriente activada por Ca 2 +-transitorios (CAT) en un miocito auricular de un ritmo sinusal y un paciente de la fibrilación auricular crónica. Top: Voltage-clamp protocolo (0,5 Hz). Abajo: Grabación simultánea de la membrana total neto actual (I M), principalmente como resultado del tipo L Ca 2 + CaT actual (centro) y provocó (abajo). (Dibujado de nuevo con el permiso de Voigt,et al. 2012) 15
Tabla I. Solutions.
Tabla II. Equipos.
Tabla III. Sustancias para la carga de los miocitos con Fluo-3 PM.
Tabla IV. Solución de baño para patch-clamp.
Tabla V. solución de pipeta de patch-clamp *.
Discussion
Aquí se describe un método para el aislamiento de miocitos auriculares humanos de apéndices auriculares adecuados obtenidos a partir de pacientes sometidos a cirugía de corazón abierto. Para utilizar estos miocitos para las mediciones de citosólica de Ca 2 + se adaptó un método descrito previamente 4-11 omitiendo EGTA de la solución de almacenamiento.
Ya en 1970 se observó que a pesar de los miocitos se disocian en presencia de Ca 2 + durante la digestión, todos ellos estaban en la contractura y no viables. 16,17 Por lo tanto, el aislamiento de células se realiza en solución de Ca 2 + libre. Sin embargo, la re-introducción de concentraciones fisiológicas de Ca 2 + se tradujo en un rápido Ca 2 + afluencia y la muerte celular. Esto ha sido descrito como el fenómeno de Ca 2 + paradoja que se observó originalmente en corazones perfundidos por Zimmerman y Hulsman. 18 Las modificaciones de los medios de aislamiento, incluyendo la reducción del pH a 7,0, <sup> 19 adición de taurina 20 o de pequeñas cantidades de Ca 2 + (véase el paso 3.2 y 4.1), 21 así como almacenamiento de miocitos aislados en almacenamiento que contienen EGTA-solución 22 se han sugerido para evitar que el Ca 2 + paradoja. 17 Sin embargo, es bien sabido que el Ca 2 + tampón a través de EGTA reduce la amplitud de la L-tipo Ca 2 + Ca 2 + inducida por la corriente amplitudes de transitorios y los resultados en un decaimiento bifásica de los transitorios de Ca 2 +. 23 Por lo tanto, hemos omitido EGTA lo largo de todo el proceso de aislamiento con el fin de obtener Ca 2 + transitorios con las propiedades típicas y decae monofásicos. Para proteger las células de la Ca 2 + paradoja aumentamos el final de concentración de Ca2 + de la solución de almacenamiento de una manera escalonada hasta 0,2 mM.
La elección de la colagenasa es probablemente el paso más crítico para el aislamiento de miocitos éxito. Coll convencionalagenases son preparaciones crudas obtenidas a partir de Clostridium histolyticum y contienen colagenasa, además de un número de otras proteinasas, polisacaridasas y lipasas. Con base en sus colagenasas generales de composición se subdividen en distintos tipos. 24 Worthington colagenasa tipo I y II se han utilizado con éxito para el aislamiento de los miocitos auriculares humanos. 4-10,15,25-30 En el protocolo descrito actualmente se recomienda el uso de colagenasa Tipo I, aunque también hemos sido capaces de obtener cantidades aceptables de células viables utilizando colagenasa tipo II. Sin embargo, incluso dentro de un solo tipo colagenasa hay una variación de lote a lote significativa con respecto a las actividades enzimáticas. Estas variaciones requieren la selección de lote y comprobar cuidadosamente los diversos lotes para optimizar el procedimiento de aislamiento. La herramienta dispone de lotes de selección en línea de Worthington Biochemical Corp. ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) puede ser usado para encontrar los lotes disponibles con una composición que ha demostrado ser adecuado para el aislamiento de miocitos auriculares humanos. Actualmente utilizamos colagenasa tipo I con 250 U / mg de actividad de la colagenasa, U / mg de actividad caseinase 345 U / mg de actividad clostripaína 2,16 y 0,48 U / mg de actividad tríptico (lote # 49H11338).
Las células obtenidas usando el procedimiento descrito en este manuscrito se pueden utilizar dentro de 8 horas para los estudios de patch-clamp, Ca 2 + mediciones de transitorios y una combinación de ambos. 15 Además, estas células permiten mediciones de la contracción celular en respuesta a la estimulación de campo eléctrico o la estimulación eléctrica utilizando la pipeta de patch-clamp (observaciones no publicadas).
Disclosures
Worthington Biochemical Corp. apoyó esta publicación cubriendo los costos de producción del archivo de vídeo. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Acknowledgments
Además, agradecemos a los cirujanos cardiacos en la Universidad de Heidelberg para la prestación de tejido auricular humano y Claudia Liebetrau, Katrin Kupser y Ramona Nagel por su excelente apoyo técnico. Un agradecimiento especial también a Andy W. Trafford por sus útiles sugerencias y consejos durante el establecimiento de las medidas transitorias 2 + Ca. Los autores desean expresar su más profundo agradecimiento a los miembros del Departamento de Farmacología y Toxicología (cabeza: Ursula Ravens) de la Universidad Técnica de Dresde por la oportunidad que nos ofrecen para aprender las técnicas básicas y habilidades en electrofisiología celular y el aislamiento de cardiomiocitos.
Investigación de los autores con el apoyo de la Fundación Alemana para la Investigación (Do769/1-1-3), el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación a través de la red de competencia Fibrilación Atrial (01Gi0204) y el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular, la Unión Europea a través de la ueRed ropeo de Investigación Traslacional en la fibrilación auricular (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, el proyecto de integración a gran escala, la Propuesta N º 261057) y la Alianza para la Investigación Fibrilación Atrial Europa-América del Norte (ENAFRA) concesión de Fondation Leducq (07CVD03).
La visión esquemática se muestra en el archivo de vídeo se produjo usando técnica médica Servier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
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