Summary
ここでは、ショウジョウバエの幼虫のために明暗選好テストを記述します。このアッセイは、光センシングと処理photobehaviorの自然免疫と概日規制に関する情報を提供します。
Abstract
光は様々なレベルで動物の行動を制御するための環境シグナルとして機能します。 ショウジョウバエの幼虫の神経系は、光情報が処理され、迅速かつ概日行動の間で共有される方法についての基本的な質問に答えるためにユニークなモデルとして使用されます。光にさらされたときに、ショウジョウバエの幼虫はステレオタイプ回避行動を表示します。比較的単純な明暗嗜好試験を適用することができる光依存性挙動を調査する。脊椎動物と節足動物では部分的に視覚入力を感知すると、処理に関わる神経経路は、光の概日情報を処理したものと重複する。光センシングシステムと概日システムが行動の出力が調整さ保つためにどのように相互作用するかの魅惑的な質問は、主に未踏のままです。 ショウジョウバエは脳内の神経細胞の数が少ないために、これらの質問に接近する影響を与える生物学的モデル、および遺伝的なツールの可用性です神経manipul用ATION。提示明暗選好アッセイは、走光性の概日制御を含む視覚的な行動の範囲の調査を可能にします。
Introduction
ここでは、暗闇のための幼虫の選好（または光）に基づいて行動アッセイを記述します。幼虫は餌の段階で強いと常ネガ応答（初期のL3にL1）1と反応する。アッセイは、幼虫の羞明の挙動を評価することを目的とし、寒天でコーティングされたペトリ皿の中で自由に移動する幼虫のグループの光や暗い好みを比較している。この行動のアッセイは視覚系の感度は、統合的、時間的可塑性に関する情報を提供するだけでなく、それがさらなる光感受性とそのプロセスが概日システムによって制御されている方法についてのヒントを提供しています。
ショウジョウバエの幼虫の目（とも呼ばれるBowligオルガン、BO）は、光の知覚のための主要な器官である。それぞれの目にはPRの緑感性rhodopsin6（RH6）と4つのPRを表明12光受容体（PR）、8で構成されている青感性rhodopsin5（RH5）2,3を表現。のPRに加えて、ALS幼虫の体壁を覆うプレーヤークラスIVのmultidendriticニューロンは、4,5有害な光強度に対応するために同定されている。また、中央の幼虫の脳に位置するペースメーカーニューロンが脳内で6,7クロック内在青色光センサーとして機能し、光に敏感なタンパク質クリプト（クライ）を発現することが知られている。このアッセイでテストするときに興味深いことに、野生型動物のphotophobicityは、昼と夜のコースの中の異なる時点でのサーカディアンコンポーネントを示しています。明暗好み7のためにテストされたときに採餌L3幼虫の光への応答は夕暮れ夜明け強くphotophobicityと下位photophobicityを示した。 RH6-PRのは必須では間に興味深いだけRH5-PRのは、光の回避のために必要とされる。 、RH5-PRのとRH6-PRの両方が光8で分子時計をリセットすることに関与している。クライ経路は内の適切な行動の出力を調整するために、他の光センシング経路と調整する必要がありますその日のコースです。 PRの中でアセチルコリンは光回避行動と同様、分子時計の同調に不可欠な役割を果たしている。のPRから概日ペースメーカーニューロンにアセチルコリン神経伝達をブロックすると、光闇の好みアッセイ8羞明の応答を低減します。同じアッセイを採用し、ニューロンの2つの対称のペアは最近ショウジョウバエ 9の三齢幼虫の光優先を切り替えることが同定されている。動物はおそらく適切なpupariationのサイトを見つけるために食べ物を残したときにニューロンのこれら二つのペアは、後期幼生の段階で機能していることがあります。しかし、視覚的な経路が相互作用し、概日的に幼虫の視覚的な動作を制御する方法の問題は、主に未回答のままです。光優先アッセイは異なる光質下概日時点、フライラインとサーカディアン状態間の比較を可能にします。アッセイは、容易に調製と安価であり、私は以前に役立っているnの幼虫の光派生動作を記述し、勉強するには、いくつかのラボ。
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Protocol
1。幼虫飼育
- °Cコーンミール媒体に光とタイマーを装備フライインキュベーター内で、12時間の明-12-時間明暗サイクルの下で25℃大衆文化の中で株や遺伝子交配を飛ばしてください。
- 流体ペースト（H 2 Oを蒸留3〜4ミリリットルで希釈し、背の酵母10g）を形成するために水にバッカー酵母を希釈する。コーンミール食品に小滴を追加し、バイアルをカバーしています。酵母ペーストにこだわる大人のハエを避けるために、少なくとも1時間乾燥させます。食品の表面に水で希釈された酵母の小滴を置くことは産卵を高めることができます。あるいはパン酵母ペーストを、20％酢酸（AcOH中）（シグマ·アルドリッチ社、スイスA6283-100ML）を用いることができる。このために、コーンミール食品表面上の解決策と普及上のQ-ティップの先端を浸す。
- コーンミール食品バイアルに成人ハエを（少なくとも四日間古いが、10日以上経過していない）を入れ。嗜好を繰り返すのに十分な幼虫を得るために、各バイアルに十分な大人に置く何回かテストし、統計的な比較を可能にする。遺伝的交配のために、我々は一般的に20人の女性とバイアルあたり5-10男性の最小値を使用しますが、いくつかの行が十分な幼虫の子孫を得るために、より多くの女性を必要とする。
- 大人が12時間のために卵を産むと新しいバイアルに転送することができます。大人は、朝と夕方に転送することができます。我々は通常、7〜10日のために大人を転送し、必要に応じて新たな大人を取る。
- インキュベーター内のすべての12時間を取られ、卵のコレクションを保持し、25℃で幼虫を育ててみましょう°C、12時間の光12時間明暗サイクル、60％の湿度。採卵後の定数暗闇に視覚的な動作の動きの幼虫（DD）48時間（二明暗周期に相当する）の概日のコンポーネントをテストする。このため、光のない独立したインキュベーターを使用しますが、温度や湿度などの同一の他のすべての条件を保つ。ただ暗期への切り替え前に、DDインキュベーターにバイアルを転送してください。 anothにバイアルを移動する前にえーインキュベータは段ボール箱にバイアルを置くか、または転送中露光（段ボール箱や包装で梱包がインキュベーター間のシフトの前に "ライトオン段階"の間に行われなければならない）を防ぐために、アルミホイルでバイアルを包む。このポイントの後、実験開始まで、任意の露光から動物を防ぐ。
- 4日後（産卵84から108時間）（4を参照してください。ライト選好テスト、ポイント。4.4。）テストする時点で初期のL3（給餌の幼虫）を収集。
2。テストのセットアップ
- 一定の温度と湿度の条件で暗い部屋で実験を行う。
- 暗闇の中でシャーレの2象限を維持するには、黒のテープとアルミホイルでふたをカバーしています。そうするために、蓋円周の中心をマークする。また、それらの間の分離の90°と蓋の境界に4点をマーク。それを簡単にするために、上の10センチの長さの4象限に分割20センチ正方形を描くの紙やコンピュータの助けを借りてシート。アルミ箔と黒テープ（ 図1A）の10センチの正方形をカット。アルミ箔の接着二乗で二つの正反対の象限をカバー、それを覆う第1層と黒テープとして、また蓋の境界線をカバーするように注意してください。
このアッセイの過去の2つのわずかの異なる形態で使用されていた。ここでは、ペトリ皿を10 4つの等しい4分割されている"四半期プレート"アッセイを使用しています。代替"ハーフプレート"アッセイではペトリ皿割った半分（半分光にさらされ、暗闇の中で半分）1,7,8です。今日まで2つのアッセイ間に有意差は公表されていない。 - 接着剤などの右側のテーブル上に光源下蓋のマーキングに使用されたものと象限シート。象限の交差点を中心としたペトリ皿の円周をマーク。光源の下で同じ位置に常に試験板を配置するための基準として符を使用します。
- インストールランプ、シンプルな白い電球（フィリップス、Softtone 5W）や鉄のサポートスタンド（フィッシャーサイエンティフィック、S47808）の助けを借りて、シャーレ上LEDランプ（LEDランプ、80012白、オスラム）のどちらか。全体の試験板を均一に照明されるようにして高さを調整します。彼らは、従来の電球よりも特定の波長を放射するので、我々は強くLEDランプの使用をお勧めします。またLEDは少ない熱を発する。
- 光度計（環境計PCE EM882）の助けを借りて、光強度を調整します。必要に応じて350から760ルクスに必要な光強度を達成するために、上下にランプを移動します。調整可能な電源にランプを接続すると、ランプ（ 図1B）を移動させずに強度を変更するためのより多くの柔軟性を提供します。
3。プレートの準備
- 蒸留水（ミリポア）で2.5％の寒天を200ml（Sigma-Aldrich社、スイスA5093-500G）を作る。
- テーブル（90 mmの直径にペトリ皿を置きます;グライナーバイオワン社、4550 Kremsmeinster、オーストリア）行でホットアガロースを注ぐようにする。
- ソリューションは完全に透明で流体になるまで電子レンジでアガロースを沸かす。溶液は気泡が含まれていないことを確認してください。注意：慎重にテーブルへの交通ソリューションは非常に熱くなっていますので、！
- 全面を均一溶液の薄層で被覆されるまで、ペトリ皿にホットアガロースを注ぎ、2〜3ミリ十分である。アガロース、コーティングする前に、すべてのプレートを凝固を防ぐために迅速になる。プレートがクールダウンしましょう。室温でプレートを保存し、唯一の準備の同じ日にそれらを使用しています。
4。光嗜好テスト
- ショウジョウバエは、光の赤色波長を感知することができないので、テストの前に光の影響を防ぐために、実験室での赤色光の条件下で動作します。 Tを照らすランプに取り付けられた赤色電球（フィリップス、PFE712E * 8）を使用して、彼は仕事に配置します。
- 25ですべての実験を通して温度を維持℃にヒーターや冷却装置によってコントロールルームは、温度、必要に応じて。
- 一定の暗さ（セクション1から）で2日間のサイクルで飼育バイアルからいくつかの食品を取る。幼虫は、通常、食品の表面に掘っているので、スパチュラ（フィッシャー·サイエンティフィック、14 373 25A）の助けを借りて、最上層（約5mm深く）を取る。シャーレのふたの外側に食べ物を広げ、いくつかの水を追加して、へらで軽く混ぜる。
- 食物からのL3幼虫を餌集める。光好みがテストされるように、負の走光性が確保されているので、唯一の供給/初期のL3幼虫を選択することが重要です。食品にクロール後期/放浪L3幼虫や大きな幼虫はおそらくすでにphotobehaviorを切り替えた。その前方気門が開いていて、指状に外側へ突出しているため給電L3幼虫（負の走光）を認識することができる。後部気門sが3つの開口部それぞれ、大分枝毛4つのグループを有する。唾液腺は、第二腹部セグメント11に伸びる。ない白色光を使用しないことに対し、顕微鏡下で幼虫のステージングと便利です。赤色光ランプ、実験が必要となる前に、実体顕微鏡下ステージング場合に幼虫を照明することが必要である。
- 水道水で簡単に幼虫を洗浄し、早期供給サード齢幼虫（まだ赤い光で）を収集。試験板に幼虫を移す前に、ペーパータオルや濾紙で余分な水分を吸収する慎重濡れ絵筆で幼虫を取ると。それは動物に害を与えると、その動作に影響を与える可能性があるので、あまりにも過度に幼虫を乾燥させないでください。
- ぬれた絵筆を使用して慎重にプレートに幼虫を移す。プレートの中央に約30幼虫のグループを配置。すでに象限で調製蓋付きプレートをカバーし、実験の準備が光源の下でプレートを設定します（秒る2）。
- 白色光ランプをオンにして、タイマーを開始。幼虫は5分間プレートに自由に移動しましょう、その後、すぐに蓋を取り外して、暗闇の中で光と象限における幼虫の数を数える。マーカーで各幼虫の位置をマークすると、カウントが容易になります。また、プレートの写真を撮ると事後を数える。幼虫は壁にクロールまたは寒天に穴を掘るように、不明確光選好を示す幼虫は中立好みとして考慮されるべきであるし、ちょうど光選好指数が算出された幼虫の総数に含まれる。
- カウントした後、幼虫でプレートを破棄し、次の実験のための新しいテストプレートと交換してください。後で取扱い及び処分のためのオートクレーブビニール袋で使用プレートを収集します。
- たら、新しい遺伝子型をテストできる実験に十分な数を実行した。遺伝子型ごとの10-15試験は、分析のために十分です。
5。データAnalysiの
- 便宜上エクセル（マイクロソフト）またはさらなる統計分析のために、コンピュータ上の起源（オリジンラボ）などのデータシートにデータを転送。つの列の2番目の列の光象限における動物の数で、プレート（ "中立"の幼虫を含む）における動物の合計3分の暗闇の中で動物の数を手配。
- 次の式を使用して、各実験のために闇の優先指数（PREF）を計算します：
PREF（闇）=（暗闇の中で幼虫の数 - 光の中で幼虫の数）/幼虫の総数 - グループのための適切な分析と統計的にデータのセットを比較してください。ここでは、統計的に2つのグループを比較するためにウィルコクソン検定を使用する。正規分布の仮定がマニホールドグループと比較して満たされている場合、Tukeyの多重比較- 事後テストは、行うことができます。とANOVA検定
- 日サイクルに沿って線やタイムポイント間で明確に比較を示すグラフを作成します。 W電子使用起源ソフトウェア（オリジンラボ）統計的有意性をテストし、適切なグラフを生成するが、他の統計ソフトウェアが役立ちます。
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Representative Results
上記プロトコルに続いて、我々は、野生型カントン-Sの初期三幼虫スタジアムで明暗好みをテストした二つの異なる概日時間にCT0とCT12を飛ぶ。大人は、12時間の光-12-時間暗を飼育し、12時間のために卵を産むために残っていた。幼虫は同じ明暗政権下で最初の二日間育つ。我々は一定の条件（概日時計のフリーランニング）の下で概日変調をテストしたかったので、テストが（ 図3A）を行ったまでは、幼虫は、その後、次の3日間のために一定の暗さに移した。
それは、これが他の強度（70〜600ルクス）7と比較して、概日周期に沿ったショウジョウバエの幼虫の光の応答の相違を検出するための最適な光強度であることが示されているので、ここでは350ルクスを使用した。 CT12でCT0とを比較するときに光応答して光感受性の差、したがってが観察される。 ショウジョウバエ 、CT0で一致夜明けとS、CT0-CT12間半サイクルは主観日とみなされ、CT12からCT24主観的夜の12に。光感光性は幼虫のほぼ77％が早期に主観的な夜（ 図3B）で暗い好みのほぼ69％と比較して暗闇を好むとき、闇から光への移行後に簡潔に高くなっています。これは、各実験について上記に示さ式で計算暗い優先度指数（PREF（濃度））によって反射される。すべての繰り返しをアベレージたちはCT12用CT0および0.36の0.52の優先インデックスを取得しました。ウィルコクソン検定（原点）を用いて二時点間の統計的有意差はた（p = 0.0229）が示されている。
図1（A）ペトリ皿のふたで象限をマーク。象限は、助けを借りて、シャーレのふたでマークすることができますキャンバスとして使用されたプリント象限の。後方にアルミ箔の第1の層は、プレートの外面に接着することができ、暗闇のための2つの反対の象限に黒いテープで覆われている。（B）図は明暗選好テスト用にセットアップします（C）ペトリディッシュダーク象限で覆われ、2.5％寒天で満たされ、実験に使用する準備は大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。明暗選好テスト、右試験板（スタート）の幼虫を設定した後、5分間（終了）後に料理の一例。一般的に、我々はそれぞれの実験のために30の動物のグループを使用します。
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図3（A）ライト政権はL3の幼虫を餌に光好みをテストするために続いた。（B）の両方の時間のために暗い好みの割合が（CT0とCT12）テストポイント。優先闇と光は、それぞれ繰り返し、すべての繰り返しのためにカウントされている幼虫の割合が平均した。寒天上にプレートや掘削の境界で幼虫を中立とみなされます（C）ダーク選好指数は同時点のために計算。群間の統計的有意差はウィルコクソン和ランク検定た（p <0.05）で示されている。 （時点ごとにN = 18（540幼虫））。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
説明光選好テストは幼虫の生得photobehaviorを利用しています。アッセイは、確立することが容易であり、低コストで多くの繰り返しを可能にし、光センシングと処理に関する貴重な情報を提供します。実験的なパラダイムは、個人が光や暗い好むどのように多くの比較的迅速定量化を可能にします。このような好みを粗パーセントとしてあるいは、優先指数（PREF）として表示することができます。 PREF、好ましい光および好ましい闇が動物の合計で割ったことを動物その動物の違いとして表現される。
光選好テストのための重要なポイントは、実験の期間です。ここでは、5分をテストし、しかし、それは他の遺伝子型または他の光の質の違いの下では、この実験の期間を使ってそれほど明確ではない可能性があります。特定の刺激のために（味覚）我々はもはや実験は、期間の20分で、クリーナーpreferenを届けることを実現している小さい変動でCES。異なる実験期間をテストする運動や感度が影響を受けている遺伝子型と幼虫を用いた場合は特に公正かもしれないテストプレートを探索するために長い時間を必要とする。その場合、時間が等しくコントロール遺伝子型と実験のために調整されるべきである。
アッセイはまた、ここで、前のレポート7,13に示すように概日周期を通じ一日の時点間の違いを検出することができます。光の刺激に光反応が強く、おそらく光受容体の変調感度で、概日時計によって規制されている。幼虫の応答はその日の最初の2時間の間に減少した光との位相の残りの10時間の間に安定する。日のうちの異なるグループを比較するために、各グループの概日周期の等価又は同一の時点で実験をすることが重要である。また、その変更を避けるためにも重要である暗闇の中で作業している場合の実験前の熱揺らぎや光入力として、幼虫の行動に影響を与えることができる。このためには、実験のために使用されるものよりも同じ温度と湿度で幼虫を育てる、必要なときに暗闇の中で動物を維持して注意することが重要です。
少なくとも三つの最近記載経路はショウジョウバエの幼虫5,14でセンシング光に寄与する：1）の幼虫の目でロドプシン依存システム媒介、幼虫の体と3に沿って広がり2）multidendriticニューロンクラスIV、）クロック本質的な青色光センサー叫びを表現。視覚的な動作のために異なる光センシング経路の寄与は、ここで説明選好テストによって対処することができます。具体的な強度と波長の異なる照明源は、異なる光の品質をテストするために使用することができる。この可能性は、光検出システムの個々の要素の感度についての詳細に依存することができますdのような光の入力がどのように処理されるか。光刺激に関するより詳細な実験のために、アッセイを簡単に別の光の品質をテストするために変更することができる。増加し、光強度が減少するだけでなく、異なる光波長をテストすることは、特定の波長（多くの可能性が市場で利用可能な）で自作のLEDランプを使用することにより可能です。電源装置を搭載したようなランプの制御は、強度の良い範囲を提供しています。光の性質を操作するためのこれらの可能性は、光の選好テストでテストする変数の広い範囲を提供。
また、 ショウジョウバエの幼虫は母国photobehavior 15の変更、光や闇のいずれかで罰や報酬を関連付けることができます。これについては、説明されたプロトコルの適応は、アッセイの多様性を示す用いた。要約すると、明暗選好テストは急速のより良い理解と貢献貴重な楽器ですと概日行動光刺激に由来し、光に敏感なシステムの要素とショウジョウバエの幼虫の体内時計は、このプロセスに関与している。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、実りある議論のために生物学、フリブール大学の学科で私たちの仲間に感謝します。私たちは、ハエの株式を提供するためのブルーミントンストックセンターに感謝します。この作品は、財政的にスイス国立科学財団（PP00P3_123339）とSGSにベルックス財団によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
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