Summary
Un protocollo per l'analisi del ciclo cellulare di vivere
Abstract
Citometria di flusso è stato ampiamente utilizzato per ottenere informazioni sul contenuto di DNA in una popolazione di cellule, per inferire percentuali relative a diverse fasi del ciclo cellulare. Questa tecnica è stata estesa con successo ai tessuti mitotici dell'organismo modello Drosophila melanogaster per studi genetici di regolazione del ciclo cellulare in vivo. Quando accoppiato con cellule di tipo espressione della proteina fluorescente specifico e manipolazioni genetiche, si possono ottenere informazioni dettagliate sui effetti sul numero di cellulare, la dimensione delle cellule e del ciclo cellulare graduale in vivo. Tuttavia questo metodo live-cell è basata sull'uso della cellula permeabile colorante Hoechst 33342 DNA ad intercalazione, limitando gli utenti a citofluorimetri equipaggiati con un laser UV. Abbiamo modificato questo protocollo per usare un colorante più nuovo live-cell DNA, Vybrant DyeCycle viola, compatibile con i più comuni laser viola 405nm. Il protocollo qui presentata consente di analisi del ciclo cellulare efficiente accoppiato con cellatipo, dimensione relativa cella ed informazioni di numero cellulare, in una varietà di tessuti di Drosophila. Questo protocollo estende il ciclo cellulare tecnica utile per analisi Drosophila tessuti vivi ad un piccolo analizzatore da banco, la Attune Acoustic Focusing citometro, che può essere eseguito e mantenuto su scala di laboratorio singolo.
Introduction
Citometria di flusso può essere utilizzato per misure di vitalità cellulare, dimensione cella relativo, contenuto di DNA e l'espressione della proteina fluorescente in popolazioni di cellule vive. Dovuto alla replicazione del DNA nucleare durante la fase S, informazioni sul contenuto di DNA in una popolazione di cellule può essere utilizzato per inferire relative percentuali in diverse fasi del ciclo cellulare 1-3. Questo metodo è diventato una pietra miliare della analisi del ciclo cellulare in sistemi modello dal lievito ai mammiferi.
Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema ottimo modello per genetica nelle analisi in vivo di regolazione del ciclo cellulare. Gli ampi strumenti genetici disponibili in mosche permettono manipolazioni specifiche del tessuto elegante e temporalmente regolamentato di regolatori del ciclo cellulare con in fluorescente lignaggio a base di proteine in vivo tracciamento 4-6. Citometria a flusso è stato utilizzato per studiare contenuto di DNA in un certo numero di tipi di cellule di Drosophila, compresi endoreplicating cellule e cellule mitotiche in coltura 7,8. Un importante passo avanti per gli studi del ciclo cellulare in vivo è stata fatta da de la Cruz e Edgar, con lo sviluppo di un protocollo per l'analisi citofluorimetrica di diploidi Drosophila dischi immaginali vivo 9,10, un protocollo che è stato usato e adattato da molti laboratori. Questa tecnica, quando accoppiato con genetico in vivo lineage tracing via inducibile espressione della proteina fluorescente e l'etichettatura specifica dei tessuti, permette di ottenere informazioni sugli effetti di manipolazione genica in tempo di raddoppiamento cellulare globale, la dimensione delle cellule e per determinare precisa tempistica delle fasi del ciclo cellulare in vivo 9 , 11. Tuttavia questo metodo si è finora fondata sull'uso della cellula permeabile colorante Hoechst 33342 DNA ad intercalazione di macchiare e quantificare il DNA in cellule vive, che ha limitato agli utenti di fluire cytometers con un laser UV in grado di eccitare il colorante Hoechst. Questi si trovano generalmente solo in selezionatrici (cioè BD FACS Vantage, BD FACSAria) o costosi sistemi da banco multicolor (cioè BD LSR), di solito richiedono il supporto di strutture di base del flusso istituzionali.
Abbiamo modificato il protocollo Hoechst-based per utilizzare un nuovo colorante DNA live-cell da Invitrogen, Vybrant DyeCycle Viola. Questa tintura è compatibile con una viola del laser 405 nm, più comune negli analizzatori da banco più piccoli e disponibili nel piccolo analizzatore da banco self-contained, l'Acoustic Sintonizzatevi Concentrandosi Cytometer. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'analisi del ciclo cellulare che può essere accoppiato con tipo di cellula, dimensione cellulare, numero di cellulare e analisi lineage in una varietà di tessuti Drosophila durante le varie fasi di sviluppo utilizzando DyeCycle Violet e la Attune. Questo protocollo si espande il numero di cytometers adatti per tale analisi con i tessuti di Drosophila e fornisce esempi di come questo tipo di analisi del ciclo cellulare in diretta può essere modificato per i tipi di tessuto supplementari e fasi di sviluppo.
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Protocol
1. Fly Zootecnica
- Croce vola di genotipi desiderati in fiale di plastica strette con 10 ml di lievito-Glucosio Medio 3 o altri supporti ricchi di proteine di vostra scelta. Gli estesi Drosophila strumenti transgenici per espressione e specifico lineage tracing con tessuto in espressione della proteina fluorescente vivo sono descritti in dettaglio altrove 4,5. Trasferire ai genitori di fiale freschi ogni giorno per ottenere serie di 24 collezioni progenie ore, o per più messa in scena precisa, raccogliere embrioni su piastre di agar e trasferire larva appena schiusi di fiale, come descritto 10. Per garantire condizioni uniformi attraverso esperimenti ed evitare sovraffollamento, il numero totale di progenie F1 in un singolo flaconcino deve essere non più di 100. A seconda della struttura genetica dell'esperimento, tenere fiale in un appropriato incubatore fino allo stadio di sviluppo desiderato.
- Raccogliere animali da esperimento: dovrai larve mature al 3 ° larvaleinstar (L3) a circa 110-120 ore di sviluppo per le larve dissezioni o bianco prepupa (WPP) per l'accurata messa in scena di pupa. Drammatici cambiamenti del ciclo cellulare, tra cui il passaggio a uno stato di non-proliferativa si verificano a intervalli di tempo distinti durante la metamorfosi 12,13. Pertanto corretta stadiazione di pupa (entro 1 ora di sviluppo) è essenziale per i dati del ciclo cellulare riproducibili durante la metamorfosi. WPP corrisponde a 0 ore dopo la formazione pupa (0 hr APF) come mostrato in Figura 1, pannello I. Raccogliere WPP in una capsula di Petri 35 millimetri su un Kimwipe umido piegato con 2,5 ml di acqua per mantenere una certa umidità. Età pupa fino desiderato stadio (ore APF) a temperatura adeguata. Si noti che lo sviluppo procede 1,2 volte più veloce a 29 ° C e 2,2 volte più lentamente a 18 ° C rispetto alla norma 25 ° C 14.
- Animali da shock termico per attivare heat-shock flipase (hs-FLP) indotta ricombinazione per lignaggio-tracing cloni, se necessario 9,11. Per il calore-shock di larva, immergerefiale in un bagno d'acqua (a 37 ° C) e garantire larve sono completamente sommersi. Per il calore-shock della pupa, sigillare la piastra di Petri con Parafilm e completamente immergere in un bagno d'acqua. Assicurarsi di rimuovere Parafilm dopo il caldo-shock, per consentire lo scambio di ossigeno sufficiente per la sopravvivenza degli animali. Durata della heat shock dipende dall'attività del transgene flipase utilizzato e numero di cloni desiderati. Noi abitualmente uso 7-8 min per indurre "Flipout" lineage tracing cloni 15 in larve con la hs-FLP transgene sul primo cromosoma e 2-4 minuti per shock termico di pupe in 35 piatti mm, mentre la hs-flp transgene su il secondo richiede un cromosoma 20 min. shock termico per ottenere un numero simile di cloni.
Il tasso di divisione cellulare e la tempistica di dissezione determina la dimensione del clone in ogni tessuto. In condizioni normali, si scopre che i cloni indotti nell'ala larvale con un min scossa 20 di calore (utilizzando l'hs-FLP transgene sul secondo cromosoma) e dissezioneted 48 ore più tardi, contenere circa 20-30 cloni ben separati con dimensioni che vanno da 10 cellule per clone di due cellule per clone, con una media di circa quattro celle per clone. Al contrario, un 7 min heat-shock con la stessa hs-FLP transgene di pupe in una capsula di Petri a 0 ore APF sezionato 36 ore dopo, i rendimenti ben separati cloni (circa 15-25) che varia da uno a quattro cellule con una media di 2,2 cellule per clone. Tali dati possono essere utilizzati per determinare il tempo medio di raddoppiamento cella per il tessuto in esame.
2. Dissection
- Delicatamente trasferire le larve / pupe ad una chiara piatto dissezione di vetro contenente PBS 1X.
- Utilizzando un microscopio e la luce ampia dissezione, afferrare delicatamente una larva per l'addome, con un brusco Inox # 5 pinza, tagliate la parte anteriore con micro-forbici, e invertire il terzo anteriore spingendo l'area verso l'interno della bocca verso il posteriore mentre si tiene il larvale cuticola costante (Figura 1A). Rimuovere con attenzione opaqucorporeo e grasso e qualsiasi intestino rimanente per aumentare la visibilità dei tessuti desiderati, come ala, occhio o il cervello. Sezionare i tessuti desiderati; pulito rimuovendo le ali di trachea e cuticola con una pinza, gli occhi, dalla bocca-ganci, o il cervello da occhi (Figura 1G).
- Per sezionare pupa; utilizzare una pinza per afferrare delicatamente una pupa con la punta anteriore della pupa caso in cui vi è una bolla d'aria, per evitare di danneggiare la pupa all'interno (Figura 1C). Forcipe o micro-forbici in mano avversaria può essere utilizzato per posizionare la pupa galleggiante per afferrare corretta. Pulito tagliare la punta posteriore della pupa con micro-forbici. Questo taglio trasversale dovrebbe essere leggermente inclinato verso la parte dorsale dell'animale, per rilasciare la pressione interna senza forzare il grasso histolyzed nei tessuti desiderati nel torace e testa. Tagliare con cura lungo la mediana dorsale, evitando le ali e il complesso occhio-cervello anteriore. Rimuovere con attenzione la pupa dalla pupacaso afferrando il margine posteriore dell'epidermide pupa e tirandolo fuori del caso pupa (Figura 1D). Poke un piccolo foro nella parte anteriore cuticola al complesso occhio-cervello con una pinza. Usando una pipetta Pasteur di vetro con un bulbo di gomma, lavare delicatamente soluzione dissezione PBS attraverso la pupa parzialmente sezionato per rimuovere il grasso histolyzed e qualsiasi tessuto intestinale rimanente. Questo lubrifica anche efficacemente la pipetta di vetro con lipidi e proteine, che riduce l'incidenza di tessuti dissezionati di attaccarsi al l'interno della pipetta di vetro successiva.
- Per ottenere le ali pupa, la cuticola avvolgente l'ala e l'ala stessa deve essere curiosato dalla pupa (Figura 1E). Questo può essere fatto tenendo la pupa dalla testa con una pinza mentre si utilizza un'altra pinza per afferrare la punta sia più posteriore della cuticola ala e si estrae o manovra della pinza sotto l'ala vicino alla cerniera prima di staccare dal lato di la carcassa (Figura 1E). L'ala può quindi essere tagliato o strappato sulla cerniera per rimuoverlo dal corpo e messo in una pila lontano dalle carcasse e altro materiale.
- Per ottenere gli occhi pupa o cervello, lavare la pupa fino al complesso occhio-cervello si libera e libera dalla pupa (Figura 1F, 1H). Usando una pinza, tirare delicatamente l'occhio pupa lontano dal cervello e salvare il tessuto desiderato.
- Non assumere più di 45 min a sezionare ogni campione, come risultato diventa meno accurato delle cellule più lunghe vengono lasciati in PBS dopo l'apertura gli animali.
3. Tissue Dissociazione e DNA colorazione
- Usando una pipetta Pasteur lubrificata, trasferire accuratamente i tessuti dissezionati in 0,5 ml di soluzione di DNA in diretta Stain in una provetta da 5 polistirolo (Fig. 1G). Trasferimento il meno possibile PBS (meno di 300 microlitri) nel DNA Stain Solution, come diluizione di tripsina inibirà dissociazione tissutale.
- Incubare le provette con shaking a 23 ° C a 500 rpm (usiamo un Eppendorf Thermomixer).
- Incubare per 70 min, poi vortice delicatamente per 5 secondi ad una velocità media (impostazione di 5). Vortex eccessivo causerà distruzione cellulare e forma detriti, mentre sotto-vortex porterà a grumi di cellule. Riportare i campioni di agitazione a 23 ° C a 500 giri al minuto per un ulteriore 15 a 20 minuti prima vortex di loro ancora una volta per 5 secondi a velocità 5.
- Per il cervello e gli occhi pupa di età superiore 36hAPF, è necessario un protocollo modificato. Dissociare tessuti nel DNA Solution Stain a 23 ° C a 500 rpm per 45-60 min a 1,7 microprovette ml. Poi uno ad uno dissociano manualmente grossi pezzi di tessuto trasferendovi piatto dissezione insieme a circa 50 microlitri DNA Stain Solution e rapido pipettando su e giù con una pipetta Pasteur disegnati manualmente 16 (di circa 100-150 micron apertura). Trasferire ciascun campione dissociata con il resto del 0,5 ml di soluzione di DNA Stain in una provetta da 5 ml. Incubare un ulteriore 45-30 Min (fino a 90 minuti di tempo di incubazione totale) a 23 ° C con agitazione a 500 rpm fino grumi non sono più visibili.
- Completamente campioni dissociate dovrebbero avere pochissime grandi pezzi visibili di tessuto, anche se nota che la acellulare trasparente ala cuticola pupa non si dissocia.
4. Citometria a Flusso
- Accendere il citometro Sintonizzatevi e aprire il software Sintonizzatevi. I laser citometro devono essere attivate tramite il menu di avvio, e un test di performance giornaliera devono essere eseguiti con prestazioni Perle di rilevamento con punteggi adeguati prima di ogni giornata di acquisizione dati. I livelli dei fluidi dovrebbero essere almeno mezzo pieno e rifiuti svuotati prima della prova delle prestazioni. Dettagli per l'avvio, la corretta calibrazione e il funzionamento del Sintonizzatevi si trovano nel Manuale dell'utente Sintonizzatevi ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
- Progettare un nuovo template con la creazione di quattro grafici a punti e 2 istogrammi in un'area di lavoro vuota con i parametri indicati al punto 4.3, oppure selezionare un modello precedentemente progettato adatto per l'esperimento, e indicare il numero di campioni da raccogliere. Abbiamo fornito i modelli di Attune (file in formato. Ottenere formato) per l'analisi del ciclo cellulare Drosophila vivo con Vybrant DyeCycle Violet e GFP o espressione RFP nell'appendice I.
- I modelli forniti comprendono quattro grafici a punti e due istogrammi con i parametri indicati nella figura 2. I canali per la rilevazione sono: FSC e SSC - forward scatter e side scatter indicando dimensioni delle cellule e la complessità della membrana, VL1 altezza (H), larghezza (L) e l'area (A) - che indica Violet eccitazione laser di DyeCycle Violet colorazione del DNA, e BL1 -A - blu laser Canale 1 Area, indicando fluorescenza GFP. Il modello fornito per l'analisi RFP è identico al modello per analisi GFP, eccetto che usa il canale laser Blu 3 (BL3-A), che è ottized per il rilevamento di RFP.
- I grafici a punti nei modelli hanno porte per limitare analisi alle popolazioni desiderate e per limitare detriti e cellule ciuffi dall'analisi (Figura 2). Gate 1 esclude detriti e macchie a base di SSC vs FSC (Figura 2A). Gate 2 esclude le celle non colorate, sub G1 cellule apoptotiche e grumi di cellule basate su identificazione di canottiere (VL1Area vs VL1Width) (Figura 2B). Gate 3 è un cancello derivata, che comprende cellule entro cancelli 1 e 2, e individua GFP (o RFP) cellule negative vs contenuto di DNA sulla base VL1Height (Figura 2C). Gate 4 è un cancello derivata, che comprende cellule entro cancelli 1 e 2, e individua GFP (o RFP) cellule positive vs contenuto di DNA (Figura 2C). Dot appezzamenti di dimensioni della cella, misurato con GFP (o RFP) vs forward scatter (FSC) sono utilizzati per generare Gates 5 e 6 (Figura 2D). Il contenuto di DNA trama due istogrammi sul conteggio asse X e cellule sul Y-axis per le popolazioni definite dal Gate 3 e Porta 4. (Figura 2E e 2F) istogrammi possono essere inclusi per dimensione di cella se desiderato (non mostrato). Per istogrammi dimensione delle celle, popolazioni dovrebbero essere impostati a Gates 5 e 6, riportando FSC sul asse X e conta sulla y.
- Impostare la registrazione di fermarsi a 10.000 eventi positivi GFP o RFP (questo sarà il Gate 4, la Porta derivato della Porta 1, Porta 2 e il cancello positivo GFP o RFP). Varia da 6.000 - 10.000 eventi positivi GFP sono stati tradizionalmente l'obiettivo per i profili di qualità per la pubblicazione 9,11. Ti consigliamo di utilizzare un minimo di 15 ali o gli occhi, che sono circa il 50% GFP positive per ottenere Porta sufficiente 4 eventi 10 per i profili di alta qualità. Tuttavia, abbiamo ottenuto con successo dati chiari per l'analisi preliminare del ciclo cellulare da un minimo di sei ali (Figura 3A). Impostare il volume di acquisizione per 300 ml, questo utilizzerà circa 460 microlitri della totale 0,5 ml di campione. TaTabella 2 mostra le impostazioni di soglia e tensione adeguate previste nel modello per l'esempio in figura 2.
- Esegui campioni a sensibilità standard o ad alta sensibilità 100 l / min e di record. Troviamo poca o nessuna differenza nella nostra analisi con i diversi livelli di sensibilità. Dovuto alla focalizzazione acustica di celle, questa citometro può misurare esattamente campioni a portate molto elevate. A differenza cytometers tradizionali, non troviamo alcuna compromissione dei dati con l'acquisizione a velocità fino a 1500 eventi al secondo. I file dati registrati generati dal software Attune sono in formato. FCS, che è compatibile con la maggior parte software di modellazione ciclo cellulare.
5. Analisi dei dati
- Istogrammi di dimensione della cella e il contenuto di DNA per la GFP (o RFP) popolazioni positivi e negativi possono essere confrontati. Essi possono essere stratificati manualmente copiando e incollando utilizzando il software Adobe Photoshop. Se l'asse y è impostato su automatico, l'asse Y si scala con l'highest conteggio per ogni campione. Sovrapponendo due grafici con l'asse Y insieme ad autoscale crea una sovrapposizione di istogrammi con gli assi fissati per il massimo globale per ogni popolazione. Questo permette un facile confronto visivo per variazioni relative ciclo cellulare phasing, anche quando il numero di cellule totali di GFP positive e negative popolazioni GFP non sono equivalenti (esempio in Figura 3B). Alternativamente, una consuetudine asse y (opzione manuale asse y) può essere impostato su un valore fisso per gli istogrammi. In questo caso, i numeri di cella relativi per due popolazioni possono essere confrontati. Come il Sintonizzatevi utilizza un volume definito di campione per conduzione, la quantificazione assoluta di cellule per ogni esecuzione, in ogni cancello con percentuali di popolazione totale, sono disponibili presso la tabella delle statistiche generate automaticamente durante la corsa nello spazio di lavoro (esempio in Figura 3F ). Dot trame e gli istogrammi possono essere facilmente messi a strati nel software Sintonizzatevi, semplicemente trascinando e rilasciando diversi campioni da thmenù file di esempio di posta a destra sul grafico desiderato di un campione aperto per il confronto. Tuttavia per sovrapporre sottopopolazioni all'interno di un singolo campione (cioè GFP GFP positive e negative all'interno dello stesso campione), usiamo Photoshop.
- Due metodi possono essere utilizzati per trovare relative percentuali in diverse fasi del ciclo cellulare per una popolazione. Il metodo di approssimazione si basa su regioni definite dall'utente per delineare i confini di G1, S, G2 e> picchi G2. Questo metodo permette di stime rapide e facili di percentuali all'interno delle regioni definite dall'utente (Figura 3E). Abbiamo impostato le nostre regioni in base a un test diretto con le cellule Kc Drosophila, etichettato per la fase S usando Ethynyl-deossiuridina (UDE) incorporazione. Il secondo metodo utilizza software di modellazione di terzi per stima della distribuzione del ciclo cellulare. Abbiamo usato il software ModFitLT (Verity Software House), per esempio, in Figura 3F.
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Representative Results
La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi per un campione ala larvale, esprimendo GFP nella metà posteriore del tessuto, utilizzando il modello fornito GFP. Risultati simili si ottengono con lo stesso tipo di tessuto e pattern di espressione per RFP utilizzando il modello fornito RFP (Figura 3A). I modelli e le tensioni previste (Tabella 2) sono adatti per l'analisi di occhi larvali (Figura 3B), cervello e le ali, così come gli occhi pupa, cervelli (Figura 3D) e le ali. Istogrammi di dimensione della cella relativa fornita da tramando FSC per le popolazioni a Gates 5 e 6 possono anche essere generati (Figura 3C). Gates potrebbe essere necessario regolare leggermente a causa di differenze nelle dimensioni delle cellule di diversi tessuti o differenze di intensità di fluorescenza di GFP diverso o RFP transgeni. Questo può essere fatto durante l'esecuzione di un piccolo volume di campione di prova (50-100 microlitri), prima di colpire record.
Allowing l'asse y (counts) per il ciclo cellulare o istogrammi dimensione delle celle per auto-scala (scala dell'asse y impostato su automatico) nel software Attune, provoca istogrammi mostrano la massima globale di ciascuna popolazione. mostra la figura 3B-3D risultati rappresentativi con GFP positive e GFP istogrammi negativi con asse y impostati al massimo globale per ogni popolazione. L'impostazione di una specifica massima asse y (scala asse y impostato a manuale con un valore definito dall'utente), permette la comparazione di numeri assoluti tra le popolazioni, che può essere utile per confrontare tassi di proliferazione, ma rende difficile il confronto del ciclo cellulare phasing in popolazioni, quando il numero di cellule GFP positive vs cellule negative GFP sono molto diversi.
Figura 3B mostra i profili del ciclo cellulare per le cellule GFP positive e negative negli occhi larvali, che esprimono GFP nel posteriore utilizzando i-Gal4 GMR, UAS-GFP transgeni. La sovrapposizione rivela le differenze di ciclo cellulare phasing della GFP posteriore cellule esprimenti. Figura 3C mostra la variazione relativa dimensione cellulare tra cellule positive e negative GFP in B, riportando dimensione delle celle come misurato da FSC. figura 3D mostra un profilo ciclo cellulare da cervelli pupa a 46h APF. Cellule GFP positive sono lineage tracing cloni che esprimono il G1-S regolatori ciclina D e E2F che interrompono quiescenza e portare a ingresso S-fase, indicato dalla freccia rossa e confermato da etichettatura fase S con incorporazione di Edu (figura 3D nel riquadro). Questo è in contrasto con i non-esprimenti GFP cellule negative, che in questa fase sono normalmente arrestati in G1 (traccia nera, figura 3D).
Maggior parte dei profili del ciclo cellulare sono utilizzati per ottenere informazioni relative percentuali di una popolazione in diverse fasi del ciclo cellulare. Questo può essere approssimata nel software Sintonizzatevi con la creazione di regioni definite dall'utente sul istogrammi delineano G1, S e G2 fasi (<strong> Figura 3E). Il software Sintonizzatevi genera automaticamente una tabella di statistiche per ogni esecuzione, dando la conta assoluta delle cellule all'interno del utente regioni e percentuali (Figura 3F) definite. Questo metodo funziona bene quando si confrontano i cambiamenti relativi nella distribuzione di fase tra il comando e la popolazione sperimentale. Alternativamente, software di modellazione può essere utilizzata per stimare le percentuali in ogni fase e cellule apoptotiche. Abbiamo usato ModFitLT (Verity Software House) in Figura 3G, che può aprire direttamente i file. Fcs di dati generati dal software Sintonizzatevi.
Figura 1. Dissezione e la messa in scena di tessuti larvali e di pupa. A. La dissezione di larve (di genotipo w 1118 illustrato) a 110hr di sviluppo che mostra il terzo anteriore prima (in alto) e dopo (in basso) inversione. Bianco punta di freccia indica un'ala attaccata alla cuticola larvale e una punta di freccia rossa indica la posizione del cervello B. Wings (punta di freccia bianca; nota ala a sinistra è collegato a un disco gamba, ala a destra viene strappato alla Notum dorsale), occhi (giallo) e del cervello (rosso) rimosso dal larve. C. La dissezione di pupa che mostra le posizioni dei tagli con una pinza poste alla spazio aereo anteriore alla testa (linee tratteggiate rosse) D. Pupa rimossa dalla cuticola prima del lavaggio per rimuovere il grasso e intestino . E. Puliti pupa processo di sollevamento di ali per la rimozione mostrando F. Puliti pupa che mostra le ali (tratteggiata) e parzialmente rimosso complesso occhio-cervello (frecce rosse e gialle). G. Dissected ali larvali e gli occhi che mostrano pipetta per il trasferimento. H. Dissected post-mitotico pupa occhio-cervello complesso. I. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Rappresentante analisi del ciclo cellulare dei tessuti che esprimono GFP utilizzando Vybrant DyeCycle Violet e il Sintonizzatevi. Un'area di lavoro rappresentante, contenente 4 dot plot e 2 istogrammi viene mostrato per un campione ala larvale che esprimono GFP e la ciclina D nell'ala posteriore, azionato da un engrailed-Gal4 transgene. A. Dot plot della dimensione cellulare con Gate 1 per escludere residui e grumi. B. Dot plot di discriminare canottiere con Gate 2 di escludere le cellule non colorati, contenuti DNA sub-G1 (apoptosi), e ciuffi. C. Dot plot di GFP vs contenuto di DNA. (Gate 4) le cellule GFP negativi (Gate 3) e positivo può essere distinto e 2N e 4N contenuto di DNA è evidente in base alla posizione lungo l'asse x. D. Dot plot della dimensione delle cellule misurata con GFP vs forward scatter (FSC) per generare Gates 5 e 6. Si noti che le celle all'interno Gate1 sono di colore rosso per l'assistenza visiva nel determinare Gates 5 e 6 di questo grafico a dispersione. E. Istogramma del contenuto di DNA vs conta per GFP o RFP negativo (popolazione impostato Gate 3). F. Istogramma del contenuto di DNA vs conta per GFP o RFP positivo (popolazione impostato Gate 4). Gli istogrammi possono essere inclusi anche per le dimensioni delle celle, se desiderato. Per istogrammi dimensioni delle celle, le popolazioni di spallad essere impostato Gates 5 e 6. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Istogrammi rappresentativi del ciclo cellulare e di analisi della dimensione delle celle per i vari stadi di sviluppo e tessuti. (A) i dati di istogramma rappresentativo è mostrato per confronto del ciclo cellulare in tipi cellulari specifici utilizzando un'espressione RFP con DyeCycle Violet (inserto mostra un diagramma a dispersione di RFP fluorescenza contenuti vs DNA ). Questo esempio contiene ali larvali che esprimono RFP nel posteriore, azionato da un transgene engrailed-Gal4. (B) Sovrapposizioni di GFP vs GFP DNA istogrammi contenuti negativi positivi occhi larvali con espressione GFP guidato dalla GMR-GAL4 promoter 17, che mostra la maggior parte delle cellule GFP positive in G1. (C) minore dimensione relativa cellula del GMR guidato GFP + cellule rispetto alla GFP-controlli, come misurato dalla dispersione in avanti con Gates 5 e 6. (D) Nel cervello di pupa, GFP positivo celle indicano shock termico indotto lignaggio cloni tracciamento tramite FLP-out metodo 5 indotta durante il 2 ° stadio larvale, che sovra-esprimono il G1-S del ciclo cellulare regolatori ciclina D e E2F, causando aberrante entrata in fase S (freccia rossa) nel G1 normalmente postmitotico arrestato tessuto. L'ingresso S-fase anomalo osservato mediante citometria di flusso è stato confermato per incorporazione di EdU, che etichetta le cellule in fase S (nel riquadro). (E) Esempio di regioni utilizzate per stimare le percentuali relative a G1, S e G2 fasi. I confini sono stati stimati in base al momento della costituzione della fase S di EdU in cellule di Drosophila in un esperimento separato. (F) Esempio di statistiche tabella generata da Attunsoftware e mostrando percentuali relative alle regioni definite. (G) Esempio di ciclo di modellazione cella di dati rappresentativi Attune utilizzando ModFitLT. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Il protocollo qui descritto consente l'analisi del ciclo cellulare, la dimensione di cella relativa e il numero di cella relativa in vivo tessuti di Drosophila a vari stadi di sviluppo. Se questa analisi è accoppiato con cellule di tipo espressione della proteina fluorescente specifico o lignaggio rintracciamento, informazioni dettagliate possono essere ottenute su risposte cellulari ciclo cellulare discreto o perturbazioni di crescita. Come prova di principio, abbiamo perturbato quiescenza nel cervello della mosca pupa esprimendo G1-S regolatori del ciclo cellulare in GFP cloni di cellule marcate, che porta alla replicazione del DNA aberrante in una fase evolutiva in cui le cellule del cervello sono di norma più del 90% G1 arrestato (Figura 3D) .
Tuttavia ci sono alcune importanti limitazioni a questo metodo di analisi del ciclo cellulare in diretta. Prima, non si può distinguere tra cellule nelle varie fasi della mitosi usando il protocollo qui descritto. Così, l'analisi qui descritta deve essere integrata con immcolorazione unofluorescence per un marcatore mitotico, come Ser10-fosforilata istone H3 18 per quantificare indice mitotico nei tessuti di interesse. Inoltre il metodo qui descritto non può distinguere tra le cellule in G1 vs un G0 arresto, in quanto entrambi gli stati hanno lo stesso contenuto di DNA. Dal DyeCycle Violet è occupato da cellule vive, l'identificazione di cellule in fase di apoptosi in seguito è anche limitato. Infine, è importante notare che le misurazioni di dimensione della cella sulla base forward scatter sono misurazioni relative dimensioni di cellule piuttosto che quantificazione assoluta di dimensioni. Per la quantificazione assoluta della dimensione cellulare si consiglia un approccio volumetrico come quello utilizzato in un Coulter Counter (Beckman Coulter).
Quando fase del ciclo cellulare e dimensione dati è accoppiato con lineage tracing per misurare il tempo di raddoppiamento cella, informazioni dettagliate sul ciclo cellulare e la crescita può essere calcolato, come la lunghezza della G1, S e G2 e fasi cella tasso di crescita 9,11 in vivo in grado di fornire informazioni dettagliate sul ciclo cellulare e la regolazione della crescita per il ciclo cellulare, la crescita cellulare e la modellazione quantitativa morfogenesi dei tessuti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Aida de la Cruz per lo sviluppo e l'insegnamento del protocollo originale su cui si basa questa versione 10. Work in Buttitta Lab è sostenuto da NIH concedere GM086517.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
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Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
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References
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