Summary
Um protocolo para a análise do ciclo celular viva
Abstract
A citometria de fluxo foi utilizada para obter informação sobre o conteúdo de ADN numa população de células, para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular. Esta técnica tem sido aumentado com sucesso para os tecidos mitóticas do organismo-modelo de Drosophila melanogaster para estudos genéticos de regulação do ciclo celular in vivo. Quando combinada com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula e manipulações genéticas, pode-se obter informações detalhadas sobre os efeitos sobre o número de células, o tamanho da célula e do ciclo celular phasing in vivo. No entanto, este método de células vivas foi contado com a utilização da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante, limitando aos utilizadores citómetros de fluxo equipado com um laser de UV. Nós modificamos este protocolo para usar uma tintura nova célula viva DNA, Vybrant DyeCycle Violet, compatível com o violeta do laser 405nm mais comum. O protocolo aqui apresentado permite a análise do ciclo celular eficiente juntamente com célulastipo, o tamanho relativo da célula e informação do número de células, em uma variedade de tecidos de Drosophila. Este protocolo estende a técnica útil para a análise do ciclo celular de tecidos vivos de Drosophila para um pequeno analisador de bancada, a Focagem Citómetro Attune acústica, o que pode ser executado e mantidas numa escala de um único laboratório.
Introduction
A citometria de fluxo pode ser usado para as medições de viabilidade celular, o tamanho da célula relativo, teor de ADN e expressão de proteína fluorescente em populações de células vivas. Devido à replicação do ADN nuclear durante a fase S, as informações sobre o conteúdo de ADN numa população de células pode ser usada para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular 1-3. Este método tornou-se um elemento fundamental da análise do ciclo celular, em sistemas modelo de leveduras aos mamíferos.
A mosca da fruta Drosophila melanogaster, tornou-se um sistema modelo excelente para a análise in vivo genética de regulação do ciclo celular. As extensas ferramentas genéticas disponíveis em moscas permitir manipulações tecido elegante específicas e temporalmente regulada de reguladores do ciclo celular, juntamente com a linhagem baseada em proteína fluorescente vivo rastreamento 4-6. A citometria de fluxo foi utilizado para estudar o conteúdo de DNA numa série de tipos de células de Drosophila, incluindo endoreple células mitóticas cultivadas icating 7,8. Um avanço importante para estudos do ciclo celular in vivo foi realizada por de la Cruz e Edgar, com o desenvolvimento de um protocolo de análise por citometria de fluxo directo diplóides 9,10 discos imaginais de Drosophila, um protocolo que foi usado e adaptado por muitos laboratórios. Esta técnica, quando acoplado com material genético in vivo linhagem rastreio através da expressão da proteína fluorescente indutível e rotulagem tecido específico, permite a obtenção de informações sobre os efeitos de manipulação de genes no tempo de duplicação celular em geral, o tamanho das células e determinar a temporização precisa de fases do ciclo celular in vivo 9 , 11. No entanto, este método tem, até agora, baseou-se no uso da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante ao manchar e quantificar o DNA em células vivas, o que tem limitado a utilizadores citómetros de fluxo com um laser de UV capaz de excitar o corante de Hoechst. Estes são geralmente encontradas apenas em classificadores (ou seja BD FACS Vantage, BD FACSAria) ou caro multicolor sistemas de bancada (ou seja BD LSR), geralmente necessitando de apoio institucional por instalações do núcleo de fluxo.
Nós modificamos o protocolo baseado em Hoechst usar um corante de DNA de células vivas de novo Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violeta. Este é compatível com o corante violeta de 405 nm, um laser, mais comum em analisadores de bancada menores e disponíveis no analisador de bancada pequena auto-contido, o acústico Attune Focando Citómetro. Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a análise do ciclo celular, que pode ser acoplado com o tipo de célula, o tamanho da célula, o número de células e a análise da linhagem de uma variedade de tecidos de Drosophila durante várias fases de desenvolvimento, utilizando o violeta e DyeCycle Attune. Este protocolo expande o número de citómetros adequados para esta análise com os tecidos de Drosophila e fornece exemplos de como este tipo de análise de ciclo de células vivas pode ser modificado para tipos adicionais dos tecidos e estágios de desenvolvimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Pecuária
- Cruz voa de genótipos desejados em frascos de plástico estreitas com 10 ml de levedura-Glucose Médio 3 ou outros meios de comunicação ricos em proteínas de sua escolha. As extensas Drosophila transgénicas ferramentas disponíveis para a expressão específica de tecido e da linhagem de rastreio com a expressão da proteína fluorescente in vivo estão descritos em detalhe noutro local 4,5. Transfira os pais frascos frescos diariamente para obter série de 24 coleções de progênie RH ou para o estadiamento mais preciso, coletar embriões em placas de ágar e transferir larva recém eclodida para frascos, conforme descrito 10. Para garantir condições uniformes de experimentos e evitar a aglomeração, o número total de descendência F1 num frasco deve ser não mais do que 100. Dependendo da estrutura genética do experimento, manter os frascos num incubador adequada até que o estádio de desenvolvimento desejado.
- Coletar animais experimentais: você vai precisar larvas maduras no 3 º larvalinstar (L3) em cerca de 110-120 horas de desenvolvimento para dissecções larvas ou branco prepupa (WPP) para o preparo de pupa preciso. Alterações do ciclo celular dramáticas, incluindo uma mudança para um estado não-proliferativa ocorrer em instantes distintos durante a metamorfose 12,13. Portanto preparo correto de pupa (dentro de 1 hr de desenvolvimento) é essencial para os dados do ciclo celular reprodutíveis durante a metamorfose. WPP corresponde a 0 horas depois da formação de crisálidas (0 hr APF), como mostrado na Figura 1, o painel I. Recolha WPP em de 35 mm sobre uma placa de Petri Kimwipe desistiu molhado com 2,5 ml de água para manter uma certa humidade. Idade pupa até o estágio (horário APF) desejado em temperatura adequada. Note-se que o desenvolvimento prossegue, 1,2 vezes mais rápida a 29 ° C e 2,2 vezes mais lentamente a 18 ° C do que no padrão de 25 ° C 14.
- Animais de choque térmico para ativar choque térmico flipase (hs-flp) induzida por recombinação de clones linhagem de rastreamento, se necessário 9,11. Para o choque térmico de larva, mergulhefrascos em um banho de água (a 37 ° C) e garantir larvas são totalmente submerso. Para o choque térmico de pupa, selar a placa de Petri com Parafilm e mergulhe-o em banho-maria por completo. Certifique-se de remover Parafilm após o choque térmico, para permitir a troca de oxigênio suficiente para a sobrevivência animal. A duração do choque de calor depende da actividade do transgene flipase utilizado e do número de clones desejados. Rotineiramente usamos 7-8 min para induzir "Flipout" linhagem rastreamento clones 15 em larvas com o hs-flp transgene no primeiro cromossomo e 2-4 min por choque térmico de pupas em 35 milímetros pratos, enquanto o hs-flp transgene em o segundo cromossoma requer de 20 minutos. choque térmico para se obter um número semelhante de clones.
A taxa de divisão celular e de sincronização de dissecção determina o tamanho do clone em cada tecido. Em condições normais, nós achamos que clones induzido na asa larval com 20 min de choque térmico (usando o hs-flp transgene no segundo cromossomo) e dissecçãoted 48 horas mais tarde, contêm cerca de 20-30 clones bem separados, com tamanhos que variam de 10 células por clone de duas células por clone, com uma média de cerca de quatro células por clone. Em contraste, a 7 minutos de choque de calor com a mesma hs-flp transgene de pupas numa placa de Petri, a 0 hr APF dissecados 36 horas mais tarde, os rendimentos de clones bem separadas (aproximadamente 15-25), variando de um a quatro células, com uma média de 2,2 células por clone. Tais dados podem ser utilizados para determinar o tempo de duplicação médio de célula para o tecido em estudo.
2. Dissecação
- Gentilmente transferir as larvas / pupas de uma clara dissecação prato de vidro contendo 1X PBS.
- Usando um microscópio e muita luz dissecando, segure suavemente a larva pelo abdômen com um Inox afiada º 5 pinça, corte do terço anterior com micro-tesoura, e inverter a terceira anterior, empurrando para dentro área da boca em direção ao posterior, mantendo a larval cutícula constante (Figura 1A). Remova cuidadosamente opaque gordura corporal e qualquer intestino remanescente para aumentar a visibilidade dos tecidos desejados, tais como asa, olho ou cérebro. Dissecar os tecidos desejados; limpa remoção asas da traquéia e cutícula com uma pinça, os olhos da boca-ganchos, ou cérebro dos olhos (Figura 1G).
- Para dissecar pupa; utilizar uma pinça para agarrar uma pupa suavemente pela ponta anterior da pupa caso em que existe uma bolha de ar, para evitar danificar a pupa dentro (Figura 1C). Pinça ou micro-tesouras no lado oposto pode ser utilizada para ajudar a posicionar a pupa flutuante para agarrar apropriada. Cleanly cortar a ponta posterior da pupa com micro-tesoura. Este corte transversal deve ser feita em um pequeno ângulo para a parte dorsal do animal, para liberar a pressão interna sem forçar a gordura histolyzed nos tecidos desejados no tórax e na cabeça. Corte cuidadosamente ao longo da mediana dorsal, evitando as asas e do complexo olho-cérebro anterior. Remova cuidadosamente a pupa da pupacaso, segurando a borda posterior da epiderme pupa e puxando-o para fora do caso de pupa (Figura 1D). Picar um pequeno buraco no anterior cutícula ao complexo olho-cérebro com uma pinça. Usando um vidro Pasteur pipeta com uma pêra de borracha, lave delicadamente solução dissecção PBS através da pupa parcialmente dissecado para remover a gordura histolyzed e qualquer tecido do intestino remanescente. Isto também eficazmente lubrifica a pipeta de vidro com lípidos e proteínas, o que reduz a incidência de tecidos dissecados de furar para o interior da pipeta de vidro posterior.
- Para obter asas de pupa, a cutícula envolvendo o ala e da própria ala deve ser erguida a partir da pupa (Figura 1E). Isto pode ser feito segurando a pupa por baixo da cabeça com uma pinça, enquanto utilizando uma outra pinça para agarrar a ponta ou mais posterior da cutícula da asa e puxar para fora ou manobrar o fórceps sob a asa perto da dobradiça antes desalojando-o do lado de a carcaça (Figura 1E). A asa pode então ser cortada ou rasgada na dobradiça para removê-la a partir do corpo e colocado numa pilha de distância das carcaças e outros materiais.
- Para obter olhos pupa ou cérebro, lave a pupa até o complexo olho-cérebro torna-se desalojado e livre da pupa (Figura 1F, 1H). Usando uma pinça, puxe o olho pupal longe do cérebro e salvar o tecido desejado.
- Não demorar mais de 45 minutos para dissecar cada amostra, os resultados torna-se menos precisa das células maiores são deixados em PBS após a abertura dos animais.
3. A dissociação de tecidos e de DNA de Coloração
- Usando uma pipeta Pasteur lubrificado, transferir cuidadosamente os tecidos dissecados em 0,5 ml de solução de coloração de ADN vivo num tubo de 5 ml de poliestireno (Figura 1G). Transferência tão pouco quanto possível de PBS (menos do que 300 ul) à solução corante de ADN, como a diluição de tripsina irá inibir a dissociação de tecidos.
- Incubar os tubos com shaking a 23 ° C a 500 rpm (usamos um Thermomixer de Eppendorf).
- Incubar por 70 min, em seguida, vortex suavemente durante 5 segundos a uma velocidade média (criação de 5). Vórtex excessiva causará ruptura celular e detritos forma, enquanto que sob-vórtex conduzirá a aglomerados de células. Retorno as amostras a agitação a 23 ° C a 500 rpm durante mais 15 a 20 minutos antes de vórtex se mais uma vez durante 5 segundos na velocidade 5.
- Para cérebros e olhos pupa mais de 36hAPF, é necessário um protocolo modificado. Separar os tecidos em solução de coloração de ADN a 23 ° C a 500 rpm durante 45-60 min em tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Em seguida, um-a-um dissociar manualmente grandes pedaços de tecido, transferindo para prato de dissecação, juntamente com cerca de 50 mL da solução de DNA de manchas e rápido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de Pasteur, desenhada manualmente 16 (abertura de cerca de 100-150 um). Transferir cada espécime dissociados com o resto do 0,5 ml da solução de coloração de ADN para um tubo de 5 ml. Incubar mais 45-30 Min (até 90 minutos do tempo total de incubação) a 23 ° C com agitação a 500 rpm até aglomerados já não são visíveis.
- Totalmente amostras dissociados deve ter muito poucas grandes pedaços visíveis de tecido, embora note que o acelular transparente cutícula asa pupa não se dissociam.
4. Citometria de Fluxo
- Ligue o citômetro Attune e abrir o software Attune. Os lasers citómetro deve ser ligada através do menu de inicialização, e um teste de desempenho diário deve ser realizado com os grânulos acompanhamento de desempenho com pontuações adequadas antes de cada dia de aquisição de dados. Níveis de fluido deve ser pelo menos meio cheio e resíduos esvaziado antes do teste de performance. Detalhes para inicialização, calibração adequada e operação do Attune podem ser encontradas no Guia do Usuário do Attune ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
- Projetar uma nova template criando quatro gráficos de pontos e dois histogramas em um espaço em branco com os parâmetros indicados no item 4.3, ou selecionar um modelo previamente elaborado adequado para o experimento, e indicar o número de amostras a serem coletadas. Temos desde modelos sintonizar (arquivos em formato. Obter) para análise ao vivo do ciclo celular Drosophila com Vybrant DyeCycle Violeta e GFP ou expressão RFP no Apêndice I.
- Os modelos fornecidos incluem quatro gráficos de pontos e dois histogramas com os parâmetros indicados na Figura 2. Canais para detecção incluem: FSC e SSC - dispersão para a frente e dispersão lateral indica o tamanho e complexidade da membrana celular, VL1 altura (H), largura (W) e área (A) - indicando excitação laser violeta de coloração violeta DyeCycle o DNA, e BL1 -A - Azul Canal 1 Área de laser, que indica fluorescência da GFP. O molde fornecido para análise RFP é idêntico ao modelo de análise de GFP, excepto que se utiliza o canal de laser azul 3 (BL3-A), que é optimized para detecção de RFP.
- Os gráficos de pontos nos modelos têm portas de análise de restrição para as populações pretendidas e para limitar e detritos de células aglomerados a partir de análise (Figura 2). Portão 1 exclui detritos e aglomerados baseados em FSC vs SSC (Figura 2A). Gate 2 exclui células não coradas, as células em apoptose G1 sub e aglomerados de células com base em identificação de singlets (VL1Area vs VL1Width) (Figura 2B). Portão 3 é derivada de um portão, as células que engloba dentro portões 1 e 2, e identifica a GFP (ou RFP), células negativas contra o conteúdo de ADN com base em VL1Height (Figura 2C). Portão 4 é um derivado do portão, as células que engloba dentro portões 1 e 2, e identifica a GFP (ou RFP) células positivas versus conteúdo de DNA (Figura 2C). Os gráficos de pontos de tamanho de célula medido por GFP (ou RFP) versus dispersão frontal (FSC), são usados para gerar portões 5 e 6 (Figura 2D). O conteúdo de DNA trama dois histogramas no eixo X e contagem de células no Y-axis para as populações definidas pelo portão 3 e Portão 4. (Figura 2E e 2F) histogramas pode também ser incluído para se desejado, o tamanho da célula (não mostrado). Para histogramas tamanho da célula, as populações devem ser definidos para portões 5 e 6, traçando FSC no eixo X e conta com o eixo-y.
- Conjunto de gravação para parar a 10.000 GFP ou RFP eventos positivos (este será Gate 4, o Portão derivado de Portão 1, Portão 2 eo portão positivo GFP ou RFP). Varia de 6000 - 10.000 GFP eventos positivos têm sido tradicionalmente o objetivo de perfis de qualidade de publicação 9,11. Sugerimos utilizar um mínimo de 15 asas ou olhos, que são aproximadamente 50% GFP positivo para obter Portão suficiente 4 eventos para 10 perfis de alta qualidade. No entanto, temos obtido êxito dados claros para a análise do ciclo celular preliminar de tão poucos como seis asas (Figura 3A). Defina o volume de aquisição de 300 ml, este irá utilizar cerca de 460 mL do total de 0,5 ml da amostra. Tatabela 2 mostra as definições de limiar e tensão adequadas previstas no molde para o exemplo na Figura 2.
- Executar amostras a sensibilidade padrão ou de alta sensibilidade de 100 mL / min e registro. Encontramos pouca ou nenhuma diferença em nossa análise com os diferentes níveis de sensibilidade. Devido à acústica foco de células, este citômetro pode medir com precisão amostras em altas taxas de fluxo. Ao contrário cytometers tradicionais, encontramos nenhum compromisso com a aquisição de dados em velocidades de até 1.500 eventos por segundo. Os ficheiros de dados gravados gerados pelo software Attune estão no formato. FCS, que é compatível com a maioria dos softwares de modelagem de ciclo celular.
5. Análise de Dados
- Os histogramas do tamanho das células e o conteúdo de DNA para GFP (ou RFP) populações positivas e negativas podem ser comparados. Eles podem ser colocados em camadas manualmente copiando e colando usando o software Adobe Photoshop. Se o eixo-y é definido como automático, o eixo Y será ampliado com a highest contagem para cada amostra. Sobreposição de dois gráficos com o conjunto do eixo Y para autoscale cria uma sobreposição de histogramas com os eixos definidos para o máximo global para cada população. Isto permite a comparação fácil visual para modificações relativas na faseamento do ciclo celular, mesmo quando o número total de células de GFP positivas e negativas GFP populações não são equivalentes (exemplo na Figura 3B). Alternativamente, um costume eixo y (opção manual eixo y) pode ser ajustado para um valor fixo para os histogramas. Neste caso, podem ser comparados aos números de células relativos de duas populações. Como o Attune utiliza um volume definido de amostra de cada corrida, a quantificação absoluta de células para cada experiência, em cada porta, com percentagens do total da população, pode ser obtida a partir da tabela de estatísticas gerado automaticamente, durante o funcionamento, no espaço de trabalho (exemplo na Figura 3F ). Gráficos de pontos e histogramas também podem ser facilmente em camadas no software Attune, simplesmente arrastando e soltando diferentes amostras a partir de diamenu de arquivo de amostra e à direita para o gráfico desejado de uma amostra aberta para comparação. No entanto, para sobrepor subpopulações de dentro de uma única amostra (isto é, a GFP e GFP positivo negativa dentro da mesma amostra), usamos Photoshop.
- Dois métodos podem ser usados para encontrar a percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular de uma população. O método de aproximação baseia-se em regiões definidas pelo usuário para delinear os limites do G1, S, G2 e G2> picos. Este método permite que as estimativas rápidas e fáceis de percentagens nas regiões definidas pelo usuário (Figura 3E). Montamos nossas regiões com base em um teste direto com células Kc Drosophila, marcado para a fase S com etinil-deoxiuridina (UDE) incorporação. O segundo método usa o software de modelagem de terceiros para a estimativa da distribuição do ciclo celular. Nós usamos software ModFitLT (Verity Software House), por exemplo, na Figura 3F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 2 mostra resultados representativos para uma amostra de larvas de asa, expressando GFP na metade posterior do tecido, utilizando o modelo previsto a GFP. Resultados semelhantes são obtidos com o mesmo tipo de tecido e padrão de expressão para a RFP, utilizando o modelo de RFP fornecida (Figura 3A). Os modelos e voltagens fornecidas (Tabela 2) são adequados para análise de olhos larvais (Figura 3B), cérebros e asas, assim como os olhos, cérebros pupa (Figura 3D) e asas. Os histogramas do tamanho das células em relação fornecida através da representação gráfica do FSC para populações em portões 5 e 6 também pode ser gerado (Figura 3C). Gates, pode precisar de ser ligeiramente ajustados devido às diferenças no tamanho da célula para diferentes tecidos ou as diferenças na intensidade da fluorescência da GFP diferente ou RFP transgenes. Isso pode ser feito durante a execução de um volume pequeno teste de amostra (50-100 mL), antes de bater recorde.
Allowing o eixo y (contagens) para o ciclo de célula ou histogramas de tamanho de célula para auto-escala (escala do eixo y definido como automático) no software do Attune, resulta em histogramas que mostram o máximo global para cada população. Figura 3B mostra-3D resultados representativos com GFP positivas e negativas com GFP histogramas eixo-y definido para o máximo global para cada população. A definição de um máximo de eixo-y específico (escala do eixo y definido para manual com um valor definido pelo usuário), permite a comparação de números absolutos entre as populações, o que pode ser útil para comparar as taxas de proliferação, mas torna difícil a comparação do ciclo celular faseamento populações quando o número de células positivas para GFP vs células negativas GFP são muito diferentes.
A Figura 3B mostra os perfis do ciclo celular para células GFP positivas e negativas em olhos de larvas, expressando GFP na região posterior utilizando as GMR-Gal4, UAS-GFP transgenes. A sobreposição revela as diferenças no ciclo celular phasing da GFP posterior células expressando. Figura 3C mostra a mudança relativa no tamanho da célula entre as células positivas e negativas GFP em B, traçando o tamanho da célula, medida pelo FSC. figura 3D mostra um perfil do ciclo celular a partir de cérebros de pupa em 46h APF. Células GFP positivas são linhagem de rastreio de clones que expressam o G1-S reguladores de ciclina D e E2F que interrompem a quiescência e levar à entrada em fase S, indicadas pela seta vermelha e confirmado por marcação da fase S com a incorporação de EdU (Figura 3D inserção). Isto está em contraste com as células não expressando GFP negativos, que, nesta fase, são normalmente detidos em G1 (traço preto, Figura 3D).
A maioria dos perfis do ciclo celular são usados para obter informação sobre a percentagem de uma população em diferentes fases do ciclo celular. Isso pode ser aproximada no software Attune através da criação de regiões definidas pelo usuário sobre a histogramas delineando G1, S e fases G2 (<strong> Figura 3E). O software Attune gera automaticamente uma tabela de estatísticas para cada execução, dando a contagem absoluta de células dentro das regiões e porcentagens (Figura 3F) definidos pelo usuário. Este método funciona bem quando comparando as alterações relativas na fase de distribuição entre uma população de controlo e experimental. Em alternativa, o software de modelagem pode ser utilizado para estimar percentagens em cada fase, bem como células apoptóticas. Usamos ModFitLT (Verity Software House) na Figura 3G, o que pode abrir diretamente os arquivos de dados. Fcs gerados pelo software Attune.
Figura 1. Dissecção e preparo dos tecidos de larva e pupa. A. Dissecção de larvas (do genótipo w 1.118 mostrado) a 110h de desenvolvimento mostrando o terço anterior antes (em cima) e após (em baixo) de inversão. Seta branca indica uma asa ligada à cutícula das larvas e uma seta vermelha indica a posição do cérebro B. Asas (seta branca, asa nota à esquerda está ligado a um disco perna, asa à direita é rasgada no notum dorsal), olhos (amarelo) e cérebro (vermelho) foram retirados das larvas. C. Dissecção de crisálidas que mostra as posições dos cortes com uma pinça colocada no espaço aéreo anterior a cabeça (linhas pontilhadas vermelhas) D. Pupa removido cutícula antes da lavagem para remover a gordura e intestino . E. Limpo pupa processo de levantar as asas para remoção mostrando F. Limpo pupa mostrando asas (pontilhada) e parcialmente removido complexo olho-cérebro (setas vermelhas e amarelas). G. dissecado asas larvas e os olhos mostrando pipeta de transferência. H. dissecado pós-mitótico pupa olho-cérebro complexo. I. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Análise representativa do ciclo celular dos tecidos expressando GFP usando Vybrant Violet DyeCycle eo Attune. Uma área de trabalho representativo, contendo 4 gráficos de pontos e dois histogramas é mostrado para uma amostra asa larval expressando GFP e ciclina D na asa posterior, conduzido por um serrilhared-Gal4 transgene. A. Dot enredo do tamanho da célula com Gate 1 para excluir detritos e pedaços. B. enredo Dot discriminar singlets com Gate 2 para excluir as células não coradas, sub-G1 conteúdo de DNA (apoptose) e aglomerados. C. Dot lote de GFP versus conteúdo de DNA. Células GFP negativos (Portão 3) e positiva (Portão 4) pode ser distinto e 2N e conteúdo de DNA 4N é evidente com base na posição ao longo do eixo x. D. Dot enredo do tamanho da célula medida pelo GFP vs dispersão frontal (FSC) para gerar portões 5 e 6. Note-se que as células dentro Gate1 são de cor vermelha para auxílio visual na determinação portões 5 e 6 para o gráfico de dispersão. E. histograma do conteúdo de DNA versus contagens para GFP ou RFP negativa (população definida para Portão 3). F. Histograma de conteúdo de DNA vs conta para GFP ou RFP positivo (população definida para Portão 4). Os histogramas podem também ser incluídas para o tamanho da célula, se desejado. Para histogramas tamanho da célula, populações should ser ajustado para portões 5 e 6. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 3. Histogramas representativos do ciclo celular e análise de tamanho de célula para vários estágios de desenvolvimento e tecidos. (A) dados do histograma representativo é mostrado para comparação do ciclo celular em tipos específicos de células usando a expressão RFP com DyeCycle Violet (inset mostra Dispersão de RFP fluorescência versus conteúdo de DNA ). Este exemplo contém asas larvas expressar RFP no posterior, conduzido por um transgene Engrailed-Gal4. (B) Sobreposições de GFP positivos vs GFP DNA histogramas conteúdo negativo nos olhos larvais com expressão GFP impulsionada pela GMR-gal4 promoter 17, mostrando a maioria das células GFP positivas no G1. (C) menor tamanho de célula relativa do GMR orientada GFP + células em comparação com GFP-controles, medido pela dispersão para a frente com portões 5 e 6. (D) No cérebro de pupa, GFP positivo células indicam choque térmico induzido linhagem de rastreamento via clones flp-out método 5 induzido durante o 2 º instar larval, sobre-expressão do G1-S do ciclo celular reguladores ciclina D e E2F, causando entrada de fase S aberrante (seta vermelha) na G1 normalmente pós-mitóticas preso tecido. A entrada da fase S anormal observado por citometria de fluxo foi confirmada por incorporação de edu, que rotula células na fase S (inset). (E) Exemplo de regiões utilizadas para estimar percentagens relativas em G1, S e G2 fases. Limites foram estimadas com base na incorporação da fase S de células de Drosophila em EdU numa experiência separada. (F) Exemplo de estatísticas tabela gerada por Attunsoftware e mostrando percentagens relativas nas regiões definidas. (G) Exemplo de modelagem de dados representativos sintonizar usando ModFitLT ciclo celular. Clique aqui para ver a figura maior .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo aqui descrito permite a análise do ciclo celular, o tamanho da célula relativo e número relativo de células em tecidos de Drosophila vivo em vários estágios de desenvolvimento. Quando esta análise é acoplado com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula ou linhagem rastreamento, informações detalhadas podem ser obtidas sobre respostas celulares ao ciclo celular discreta ou perturbações de crescimento. Como prova de princípio, interrompido quietude no cérebro da mosca pupa expressando G1-S reguladores do ciclo celular em GFP clones de células marcadas, levando a replicação do DNA aberrante em um estágio de desenvolvimento em que as células do cérebro são, normalmente, mais de 90% G1 preso (Figura 3D) .
No entanto, existem algumas limitações importantes a este método de análise de ciclo celular ao vivo. Em primeiro lugar, não é possível distinguir entre as células nas diferentes fases da mitose usando o protocolo aqui descrito. Assim, a análise aqui descrita deve ser suplementado com immcoloração unofluorescence para um marcador mitótico, tal como Ser10-histona H3 fosforilada 18 para quantificar índice mitótico nos tecidos de interesse. Além disso, o método descrito aqui não é possível distinguir entre as células em G1 vs uma parada G0, pois ambos os estados têm o mesmo conteúdo de DNA. Desde DyeCycle violeta é absorvido pelas células vivas, a identificação de células em fases posteriores apoptóticas também é limitada. Finalmente, é importante notar que as medições do tamanho das células com base em medições de dispersão para a frente são o tamanho da célula relativo ao invés de quantificação absoluta de tamanho. Por quantificação absoluta do tamanho da célula, recomendamos uma abordagem volumétrica tais como os utilizados em um Contador de Coulter (Beckman Coulter).
Quando a fase do ciclo celular e os dados de tamanho é acoplado com linhagem de rastreio para medir o tempo de duplicação celular, informações detalhadas sobre o ciclo celular e crescimento pode ser calculado, tal como o comprimento da G1, S e fases G2 e taxa de crescimento da célula 9,11 in vivo pode fornecer informações detalhadas sobre o ciclo celular e regulação do crescimento para o ciclo, o crescimento da célula quantitativa e modelagem morfogênese do tecido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Aida de la Cruz para desenvolver e ensinar o protocolo original em que esta versão é baseada 10. Trabalho no Buttitta Lab é financiado pelo NIH conceder GM086517.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
||||||||||||||||||
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
