Summary
Canlı hücre döngüsü analizi için bir protokol
Abstract
Flow sitometri çok farklı hücre döngüsü aşamalarında göre yüzde anlaması için, bir hücre nüfus DNA içeriği hakkında bilgi edinmek için kullanılır olmuştur. Bu teknik başarılı in vivo hücre döngüsü düzenleme genetik çalışmalar için model organizma Drosophila melanogaster mitotik dokulara uzatıldı. Hücre türüne özgü floresan protein ekspresyonu ve genetik manipülasyonlar ile birleştiğinde, bir hücre sayısı, hücre boyutu ve in vivo olarak aşamalı hücre döngüsü üzerindeki etkileri hakkında ayrıntılı bilgi edinebilirsiniz. Ancak bu canlı hücre yöntemi UV lazer ile donatılmış akış sitometrelerinde kullanıcıları sınırlayıcı, hücre geçirgen Hoechst 33.342 DNA-intercalating boya kullanımı güvendi. Biz daha yaygın mor 405nm lazer ile uyumlu yeni bir canlı hücre DNA boya, Vybrant DyeCycle Violet, kullanmak için bu protokol değiştirdiniz. Burada sunulan protokol, hücre ile birlikte verimli bir hücre döngüsü analizi sağlarDrosophila dokularda çeşitli tip, göreli hücre boyutu ve hücre sayısı bilgiler. Bu protokol tek laboratuvar ölçekte çalışan ve korunabilir bir küçük masa üstü analiz için canlı Drosophila dokular için yararlı hücre döngüsü analizi tekniği, Attune Akustik Odaklama Sitometreyi, uzanır.
Introduction
Akış sitometri hücre canlılığı, nispi hücre boyutu, DNA içeriği ve canlı hücre popülasyonunda floresan proteini ifade ölçümü için kullanılabilir. S-fazı, bir hücre popülasyonunda DNA içeriği hakkında bilgi boyunca nükleer DNA çoğaltma bağlı olarak farklı hücre döngüsü faz 1-3 görece yüzdeleri belirlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, mayadan memelilere modeli sistemlerinde hücre döngüsü analizi bir taşı haline gelmiştir.
Meyve sineği Drosophila melanogaster hücre döngüsünün düzenlenmesi in vivo analizlerde genetik için mükemmel bir model sistem haline gelmiştir. Sinekler mevcut geniş genetik araçları vivo floresan protein bazlı soy 4-6 izleme ile birlikte hücre döngüsü düzenleyicileri zarif doku özel ve geçici olarak düzenlenir manipülasyonlar için izin verir. Akış sitometri endorepl da dahil olmak üzere, Drosophila hücre tipleri arasında bir dizi DNA içeriği incelemek için kullanılmıştırhücreleri ve kültür mitotik hücreler 7,8 icating. In vivo hücre döngüsü çalışmalar için önemli bir ilerleme canlı diploid Drosophila hayali diskler 9,10 akış sitometrik analizi, birçok laboratuvar tarafından kullanılan ve adapte edilmiş bir protokol için bir protokol gelişimi ile, de la Cruz ve Edgar tarafından yapıldı. Indüklenebilir floresan protein ekspresyonu ve doku özel etiketleme ile izleme in vivo soy genetik ile birlikte bu teknik,, in vivo 9 bir genel hücre katına çıkma süresi, hücre boyutu gen manipülasyonu etkileri hakkında bilgi edinmek için ve hücre döngüsü aşamalarının hassas zamanlama belirlemenize olanak sağlar , 11. Bununla birlikte, bu yöntem, bugüne kadar kullanıcılar verici Hoechst boya yeteneğine sahip bir UV lazer sitometre akmaya sınırlı olan canlı hücreler, DNA leke ve ölçmek için hücrenin kullanımını geçirgen Hoechst 33.342 DNA intercalating boya dayanmıştır. Bunlar genellikle sadece seçmeler (yani BD FACS Vanta bulunurge, BD FACSAria) veya pahalı çok renkli masa üstü sistemleri (yani BD LSR), kurumsal akış çekirdek tesisleri tarafından genellikle gerektiren destek.
Biz Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet yeni bir canlı hücre DNA boya kullanmak için Hoechst-tabanlı protokol değiştirdiniz. Bu boya daha küçük masa üstü analiz yaygın ve küçük bağımsız masa üstü analizörü, Sitometre Odaklama Attune Akustik mevcut bir mor 405 nm lazer ile uyumludur. Burada DyeCycle menekşe ve Akort kullanılarak çeşitli gelişim aşamalarında hücre tipi, hücre boyutu, hücre sayısı ve Drosophila dokularının çeşitli soy analizi ile akuple edilebilir hücre döngüsü analizi için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol Drosophila dokuları ile bu analiz için uygun sitometrelerinde sayısı genişletir ve canlı hücre döngüsü analizi bu tür ek doku tipleri ve gelişim evreleri için değiştirilebilir nasıl örnekleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yetiştiriciliği Fly
- Çapraz 10 ml Maya-Glikoz Orta 3 veya seçtiğiniz diğer proteinden zengin medya ile dar plastik şişeleri istenen genotip uçar. In vivo floresan protein ekspresyonu ile izleme doku spesifik ifade ve soy için uygun geniş bir Drosophila transgenik başka araçlar 4,5 detaylı bir şekilde tarif edilmektedir. 24 saat döl koleksiyon serisi elde etmek için her gün taze şişeleri için anne transfer, ya da daha kesin evreleme için, agar plakaları üzerinde embriyo toplamak ve 10 açıklandığı gibi şişeleri için yeni yumurtadan larva transferi. Deney boyunca tek şartları yürütülmesini sağlamak ve aşırı kalabalık önlemek için, tek bir şişe içinde F1 döl toplam sayısı en fazla 100 olmalıdır. Deney genetik tasarımına bağlı olarak, istenilen gelişimsel aşamada kadar uygun bir inkübatör şişeleri tutun.
- Deney hayvanları toplayın: Eğer 3. larva az olgun larva gerekirdoğru pupa evreleme için larva diseksiyonu veya beyaz prepupa (RES) için geliştirme 110-120 yaklaşık saatte evre (L3). Olmayan bir proliferatif durumuna bir geçiş dahil olmak üzere dramatik bir hücre döngüsü değişiklikleri, metamorfoz 12,13 sırasında farklı zaman noktalarında meydana gelir. Pupa Bu nedenle doğru evreleme (gelişim 1 saat içinde) Başkalaşım sırasında tekrarlanabilir hücre döngüsü veri için gereklidir. Şekil 1'de gösterildiği gibi WPP (0 saat APF) pupa oluşumu sonra 0 saat karşılık, panel ben. Bazı nem korumak için su 2.5 ml ıslak katlanmış bir Kimwipe bir 35 mm Petri kabındaki WPP toplayın. Yaş pupa kadar uygun sıcaklıkta aşamasında (saat APF) istenen. Gelişme 29 de 1.2 kat daha hızlı ilerler unutmayın 18 daha yavaş ° C ile 2.2 kat ° standart 25 ° C 14 daha C.
- 9,11 gerekirse klonlar soy-izleme için ısı şok flipase (hs-flp) bağlı rekombinasyon etkinleştirmek için ısı-şok hayvanlar. Larva, batırmayın sıcağında-şokbir su banyosu (37 ° C olarak belirlenmiştir) ve larvaları sağlamak içinde şişeleri tamamen batık. Pupa sıcağında-şok, Parafilm ve tam batığın bu su banyosu içine ile Petri kabı mühür. Hayvan hayatta kalmak için yeterli oksijen alışverişi sağlamak için, ısı-şok sonra Parafilm kaldırmak emin olun. Isı-şok süresi flipase kullanılan transgen ve arzu edilen klonların sayısı aktivitesine bağlıdır. Biz rutin olarak hs-flp transgen ederken, hs-flp ilk kromozom üzerinde transgen ve 35 mm yemekleri pupa ısı şoku için 2-4 dk ile larvaları klonlar 15 izleme soy "flipout" uyaran için 7-8 dk kullanın ikinci kromozom bir 20 dakika gerektirir. ısı şok klonların benzer numaraları almak için.
Hücre bölünmesi ve diseksiyon zamanlaması oranı her dokuda klon boyutunu belirler. Normal şartlar altında, biz klonlar bir 20 dakika ısı şok (ikinci kromozom üzerindeki hs-flp transgen kullanarak) ve diseksiyon ile larva kanadında neden bulmakted 48 saat sonra, klon başına dört hücre etrafında ortalama, klon başına 10 hücrelerinden klon başına iki hücre arasında değişen boyutları ile yaklaşık 20-30 iyi ayrılmış klonlar içerir. Buna karşılık, 0 saat APF bir Petri kabındaki pupa, aynı hs-flp transgen ile 7 dk ısı-şok 36 saat sonra disseke, verimi iyi bir ortalama birinden dört hücre kadar (yaklaşık 15-25) klonlar ayrılmış Klon başına 2.2 hücre. Bu tür veriler, incelenen doku için ortalama hücre iki katına çıkma süresi belirlemek için kullanılabilir.
2. Teşrih
- Yavaşça 1X PBS içeren temiz bir cam diseksiyon çanak larva / pupa aktarın.
- Bir mikroskop ve bol ışık kullanarak, hafifçe, keskin Inox 5. forcep ile karın tarafından bir larva kavramak mikro-makas ile ön üçüncü kesim ve larva tutarken arka doğru ağız bölgesinde içe doğru iterek ön üçüncü ters manikür sabit (Şekil 1A). Dikkatlice opaqu kaldırmakE vücut yağ ve bu kanat, göz veya beyin istediğiniz gibi dokular, görünürlüğünü artırmak için kalan gut. İstenilen dokular incelemek, temiz forseps, ağız kanca gözleri, ya da göz (Şekil 1G) için beyin ile trakea ve manikür kanat kaldırma.
- Pupa diseksiyon için; pupa içinde (Şekil 1C) zarar görmemesi için, bir hava kabarcığı olduğu yerde hafifçe pupa davanın ön ucu ile bir pupa kavramak için bir forcep kullanın. Karşı el forseps ya da mikro-makas uygun kavrama için pozisyon yüzen pupa yardımcı olmak için kullanılabilir. Temiz mikro-makas ile pupa arka ucu kesti. Bu enine kesit kesilmiş göğüs ve kafa istenen dokulara histolyzed yağ zorlamadan iç basıncı serbest bırakmak için, hayvanın sırt tarafına doğru hafif bir açıyla yapılmalıdır. Kanat ve ön göz-beyin karmaşık kaçınarak, dorsal medyan boyunca dikkatli bir şekilde kesin. Dikkatlice pupa gelen pupa çıkarınpupa epidermisin arka kenarı açgözlü ve pupa durumda (Şekil 1D) dışarı çekerek durumda. Forseps ile göz-beyin kompleksine manikür ön küçük bir delik Poke. Bir lastik ampul ile bir cam Pasteur pipet kullanarak, yavaşça histolyzed yağ ve kalan bağırsak dokusu kaldırmak için kısmen disseke pupa ile PBS diseksiyon çözüm yıkayın. Bu aynı zamanda etkin bir şekilde daha sonra cam pipet iç yapışmasını disseke dokuların insidansını azaltır lipid ve proteinler, ile cam pipet yağlar.
- Pupa kanat elde etmek için, manikür kanat saran ve kanat kendisi pupa (Şekil 1E) den pried gerekir. Bu yan onu yerini değiştirmemek önce ya da kanat manikür en arka ucu kavramak için başka bir forcep kullanarak ve çekerek veya menteşe yakın kanatları altında forcep manevra sırasında bir forcep ile başkanı tarafından pupa basılı tutarak yapılabilir karkas (FŞEKIL 1E). Kanat sonra kesmek veya vücuttan çıkarın ve uzak karkas ve diğer malzemeden bir yığın koymak için menteşe yırtılmış olabilir.
- Göz-beyin karmaşık yerinden oynamış ve pupa (Şekil 1F, 1 H) ücretsiz hale gelinceye kadar pupa göz veya beyin elde etmek için, pupa yıkayın. Bir forcep kullanarak, yavaşça beyin uzak pupa göz çekin ve istenilen doku kaydedin.
- Sonuç uzun hücreler hayvanlara açıldıktan sonra PBS içinde kalan daha az hassas hale gelir, her bir örnek incelemek için 45 dakika daha uzun zaman yoktur.
3. Doku Ayrılma ve DNA Boyama
- Bir yağlanmış Pasteur pipeti kullanarak, dikkatli bir şekilde 5 ml polistiren tüpü (Şekil 1G) Canlı DNA boyama çözeltinin 0.5 ml'lik parçalara doku aktarın. DNA Leke Çözüm içine mümkün olduğunca az PBS olarak transferi (en az 300 ul), tripsin seyreltme olarak doku ayrışma engeller.
- Shaki ile inkübe edinng 23 500 rpm (biz bir Eppendorf Thermomixer kullanın) ° C.
- Bir orta hız (5 ayar) az 5 saniye hafifçe sonra vorteks 70 dakika, inkübe edin. Altında-vorteks hücre kümeleri yol açacaktır ise aşırı vorteks, hücre parçalama ve form enkaz neden olur. 23 sallayarak örnekleri dönüş hızı 5 ° C'de, 5 saniye için bir kere daha vorteks önce ek 15-20 dakika boyunca 500 rpm'de C.
- Beyin ve 36hAPF daha eski pupa gözler için, değiştirilmiş bir protokol gereklidir. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 45-60 dakika boyunca 500 rpm'de 23 ° C'de DNA'nın leke çözüm dokuların ayrıştırmaları. Sonra bir-bir elle yaklaşık 50 ul DNA Leke Çözüm ve hızlı bir elle çizilmiş Pasteur pipeti 16 (yaklaşık 100-150 mikron açma) ile yukarı ve aşağı pipetleme ile birlikte diseksiyon çanak aktararak doku büyük boyutta ayırmak. 5 ml'lik bir tüp içine DNA boyama Çözüm 0.5 ml geri kalanı ile, her numune ayrışmış aktarın. Ek bir 45 inkübe23 -30 dakika (toplam inkübasyon süresi en fazla 90 dakika) ° 500 rpm'de sallayarak ile C kümeleri kadar artık görülebilir.
- Not acellular şeffaf pupa kanat manikür ayırmak olmaz rağmen tamamen ayrışmış örnekleri, doku çok az büyük görünür boyutta olmalıdır.
4. Sitometrisi
- Akort sitometresinde açın ve Attune yazılımını açın. Sitometresinin lazerler başlangıç menüsünden açık olması gerekir, ve bir günlük performans testi veri toplama her günü önce yeterli puanları ile Performans İzleme Boncuk ile yapılmalıdır. Sıvı seviyeleri en az yarısı dolu ve performans test öncesi boşaltılması atık olmalıdır. Akort devreye, uygun kalibrasyon ve çalışma için Detayları Attune Kullanım Kılavuzu (bulunabilir http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
- Yeni te Tasarımparametreleri 4.3 belirtilen boş bir çalışma alanında 4 nokta araziler ve 2 histogramlar oluşturarak mplate, ya da deney için uygun önceden tasarlanmış şablonu seçin, ve toplanacak numune sayısını gösterir. Biz Vybrant DyeCycle Mor ve GFP veya Ek I'de TTT ifade ile canlı Drosophila hücre döngüsü analizi için Attune şablonları (. Almak formatındaki dosyaları) sağladı
- Resim şablonları, Şekil 2'de belirtilen parametreleri ile dört nokta araziler ve iki histogramları. Tespiti için Kanallar şunlardır: FSC ve SSC - hücre boyutu ve membran karmaşıklığı, VL1 yüksekliği (H), genişlik (W) ve alan (A) gösteren forward scatter ve yan dağılım - DyeCycle Violet boyama belirten Menekşe lazer uyarma DNA ve BL1 -A - GFP floresan gösteren Mavi lazer Kanal 1 Alanı,. TTT analizi için sağlanan şablonu Optimize olan mavi lazer kanal 3 (BL3-A), kullanması dışında, GFP analizi için bir şablon ile aynıdırRFP tespiti için zed.
- Şablonlar nokta araziler istenen nüfus analiz kısıtlamak için ve analizi (Şekil 2) enkaz ve hücre kümeleri sınırlamak kapıları var. Gate 1 enkaz ve SSC vs FSC (Şekil 2A) dayalı kümeleri hariç. Kapı 2 singlet (VL1Area genel VL1Width) (Şekil 2B) belirlenmesi dayalı boyanmamış hücreler, alt G1 apoptotik hücre ve hücre kümeleri dışlar. Gate 3 kapılar 1 ve 2 içinde hücreleri kapsayan, türetilmiş bir kapısı ve GFP (veya RFP) negatif hücreler vs VL1Height (Şekil 2C) dayalı DNA içeriği tanımlar. Gate 4 kapılar 1 ve 2 içinde hücreleri kapsayan, türetilmiş bir kapısı ve GFP (veya RFP) DNA içeriği (Şekil 2C) vs pozitif hücreleri tanımlayan. GFP (veya RFP) karşı ileri dağılım (FSC) tarafından ölçülen hücre boyutu nokta araziler kapılar 5 ve 6 (Şekil 2B) oluşturmak için kullanılır. Y-axi üzerinde X ekseni ve hücre sayısı üzerinde iki histogramlar arsa DNA içeriğiGate 3 ve Gate 4 tarafından tanımlanan nüfus için s. Istenirse (Şekil 2E ve 2F) Histogramlar (gösterilmemiş olan) hücre boyutu için dahil edilebilir. Hücre boyutu histogram için, nüfus X ekseni ve y-ekseninde sayıları FSC komplo, Gates, 5 ve 6 olarak ayarlanmalıdır.
- 10.000 GFP veya RFP olumlu olaylar (bu Gate 4, Gate 1 türetilmiş Kapısı, Gate 2 ve GFP veya RFP olumlu kapısı olacak) durdurmak için kayıt ayarlayın. 6.000 arasında değişmektedir - 10.000 GFP pozitif olayların geleneksel olarak yayın kalitesi profilleri 9,11 için hedef olmuştur. Biz kaliteli profilleri için 4 etkinlik 10 yeterli Gate elde etmek için pozitif yaklaşık% 50 GFP 15 kanat veya gözlerde az, kullanmanızı öneririz. Ancak, başarılı bir şekilde 6 kanatları (Şekil 3A) gibi az gelen ilk hücre döngüsü analizi için net veriler elde edilmiştir. 300 ul için ise elde etme seviyesini ayarlamak, bu toplam 0.5 ml örnek 460 ul hakkında kullanacaktır. TaÇizelge 2, Şekil 2'de, örneğin şablon sağlanan uygun bir eşik değeri ve voltaj ayarlar gösterilmektedir.
- Standart hassasiyet veya 100 ul / dak ve kayıt hassasiyeti yüksek numune çalıştırın. Biz farklı hassasiyet seviyesi ile analizinde fark çok az buluyorum. Hücrelerin odaklama akustik nedeniyle, bu sitometresinin doğru çok yüksek debilerde örnekleri ölçebilirsiniz. Geleneksel sitometrelerinde aksine, saniyede 1.500 olaylara hızlarda alarak bir veri uzlaşma bulmak. Akort yazılım tarafından oluşturulan kaydedilen veri dosyaları en hücre döngüsü modelleme yazılımı ile uyumludur. Fcs biçiminde bulunmaktadır.
5. Veri Analizi
- GFP (veya RFP) için hücre boyutu ve DNA içeriği histogramları pozitif ve negatif popülasyonları karşılaştırılabilir. Bunlar elle kopyalama ve Adobe Photoshop yazılımı kullanarak yapıştırarak katmanlı olabilir. Y ekseni otomatik olarak ayarlanırsa, Y ekseni h dönüşebilecekHer numune için ighest sayılır. Otomatik ölçekli için Y ekseni seti ile iki grafik kaplayan her nüfus için global maksimum için belirlenen eksen ile histogramlar bir bindirme oluşturur. Bu (Şekil 3B örneğin) GFP pozitif ve GFP negatif nüfus toplam hücre sayıları eşdeğer değildir bile, aşamalı hücre döngüsü göreceli değişiklikler için kolay görsel karşılaştırma sağlar. Alternatif olarak, özel bir y ekseni (y-ekseni manuel seçeneği) histogramlar için sabit bir değere ayarlanabilir. Bu durumda iki farklı popülasyonlar için nispi hücre sayıları karşılaştırılabilir. Akort çalıştırmak başına örnek belirli bir hacmi kullanır gibi, toplam nüfusun yüzde her kapı her çalıştırmak için hücrelerin mutlak ölçümü, Şekil 3F de çalışma alanında çalışma (örneğin sırasında otomatik olarak oluşturulan istatistikler tablodan elde edilebilir .) Nokta araziler ve histogramlar de kolayca sadece inci farklı örnekleri sürükleyip bırakarak, Attune yazılım katmanlı olabilirkarşılaştırma için açık bir örnek istenilen grafik üzerine sağ E örnek dosya menüsü. Ancak tek bir örnek (aynı örnek içinde negatif yani GFP pozitif ve GFP) içinde alt popülasyonlar bindirmek için, biz Photoshop kullanın.
- Iki yöntem bir popülasyon için, hücre döngüsünün çeşitli evrelerinde görece yüzdeleri bulmak için de kullanılabilir. Yaklaşım yöntemi G1, S, G2 ve> G2 doruklarına sınırlarını tanımlamak için kullanıcı tanımlı bölgelere dayanmaktadır. Bu yöntem, kullanıcı tanımlı bölgelerde yüzdeleri hızlı ve kolay tahminleri (Şekil 3E) sağlar. Biz Etinil-dezoksiuridin (EDU) Kuruluş kullanarak S-faz için etiketli Drosophila Kc hücreleri ile doğrudan testi, dayalı bizim bölge ayarlayın. İkinci yöntem, hücre devri dağılımı tahmini için üçüncü taraf modelleme yazılımı kullanır. Biz, Şekil 3F, örneğin ModFitLT (Verity Software House) yazılımı kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 sağlanan GFP şablonu kullanarak, doku arka yarısında GFP ifade, bir larva kanat örnek temsilcisi sonuçları gösterir. Benzer sonuçlar, aynı doku tipindeki ve verilen TTT şablon (Şekil 3A) kullanılarak TTT için ekspresyon modeli ile elde edilir. Resim şablonları ve gerilimleri (Tablo 2) larva gözde (Şekil 3B), beyin ve kanatların yanı sıra, pupa gözler, beyinleri (Şekil 3B) ve kanatların analizi için uygundur. Kapılar 5 ve 6 popülasyonlar için FSC çizilmesi ile sağlanan nispi hücre boyutu Histogramlar (Şekil 3C) oluşturulabilir. Kapılar bağlı olarak farklı dokularda veya farklı GFP veya RFP transgen için floresan yoğunluğu farklılıklar için hücre boyutu farklılıklar hafifçe ayarlanması gerekebilir. Örnek küçük bir test hacmi (50-100 ul) çalışırken Bu kayıt isabet önce, yapılabilir.
BirAkort yazılım otomatik ölçekli hücre döngüsü veya hücre boyutu histogram için y ekseni (sayıları) (y-ekseni ölçeği otomatik olarak ayarlanır) llowing, her nüfus için global maksimum gösteren histogramlar ile sonuçlanır. Şekil 3B-3D gösterir y ekseni ile GFP pozitif ve GFP negatif histogramlar ile temsilcisi sonuçları her nüfus için global maksimum ayarlanır. Belirli bir y-ekseni en büyük (y-ekseni ölçekli bir kullanıcı tanımlı değeri manuel ayarlanır), Ayar çoğalması oranlarını karşılaştıran için yararlı olabilir nüfus arasında kesin rakamlar karşılaştırılması için izin verir, ama zor aşamalı hücre döngüsü karşılaştırması yapılabilir GFP negatif hücreler vs GFP pozitif hücrelerin sayısı çok farklıdır nüfus.
Şekil 3B GMR-Gal4, UAS-GFP transgenlerin kullanarak arka GFP ifade, larva gözünde GFP pozitif ve negatif hücreler için hücre döngüsü profillerini göstermektedir. Bindirme hücre döngüsü s farklılıkları ortayasentezleyici hücrelerin arka GFP hasing. Şekil 3C gösterir B GFP pozitif ve negatif hücreleri arasında hücre boyutu göreceli değişim, FSC ile ölçülen hücre boyutuna işaretlenmesiyle. Şekil 3B 46H APF az pupa beyinlerinden elde edilmiş bir hücre döngüsü profili gösterir. GFP pozitif hücreler G1-S düzenleyiciler Siklin D ve sükunet bozabilir ve S-faz giriş yol E2F ifade soy izleme klonlar, kırmızı ok ile gösterilen ve Edu dahil edilmesi (Şekil 3D ilave) ile S-faz etiketleme ile teyit vardır. Bu, bu aşamada normal G1 (siyah iz, Şekil 3D) olarak tutuklandı olmayan ifade GFP negatif hücreler, aksine bulunmaktadır.
En hücre döngüsü profilleri farklı hücre döngüsü aşamalarında bir nüfus yüzdeleri hakkında bilgi elde etmek için kullanılır. Bu G1, S ve G2 fazları (<sınırlarını belirleyen histogramlar kullanıcı tanımlı bölgeler oluşturarak Attune yazılımında yaklaşık olarak hesaplanabilirstrong> Şekil 3E). Akort yazılım otomatik olarak kullanıcı tanımlı bölgeler ve yüzdeleri (Şekil 3F) içinde hücrelerin mutlak sayıları veren, her çalışma için bir istatistik tablosu oluşturur. Bir kontrol ve deneysel nüfus arasındaki faz dağılımındaki göreceli değişiklikler karşılaştırırken bu yöntem iyi çalışır. Alternatif olarak, modelleme yazılımı her bir faz olarak apoptotik hücre yüzdesi tahmin etmek için de kullanılabilir. Biz doğrudan alıştırmak yazılım tarafından oluşturulan. Fcs veri dosyalarını açabilirsiniz Şekil 3G ModFitLT (Verity Software House), kullanılır.
Şekil 1. 110 larva diseksiyonu ve larva ve pupa dokuların evreleme. A. Diseksiyon (genotip 1118 w gösterilir)kalkınma saat önce ön üçüncü gösteren (üst) ve (alt) inversiyon sonra. Beyaz ok ucu larva manikür ve bir kırmızı ok ucu bağlı bir kanat beyin B. Wings konumunu gösterir gösterir (beyaz ok ucu; solda not kanat bir bacak diske bağlı, sağ kanat dorsal notum da yırtılmış), göz (sarı) ve beyin (kırmızı) larvaları kaldırılır. pupa D. Pupa kaldırmak için yıkamadan önce manikür kaldırılır baş (kırmızı noktalı çizgi) için ön hava sahasını yer forseps ile kesim pozisyonlarını gösteren C. Diseksiyon yağ ve gut . E. pupa F. pupa (kırmızı ve sarı ok başları) kanat gösteren (noktalı) ve kısmen göz-beyin karmaşık kaldırıldı Temizlenmiş kaldırılması için kanat kaldırma işlemi gösteren temizlenmelidir. G. larva kanat ve transfer için pipet gösteren gözleri Dissected. H. Dissected post-mitotik pupa göz-beyin karmaşık. I. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Vybrant DyeCycle Mor ve Attune kullanarak GFP ifade dokuların Temsilcisi hücre döngüsü analizi. Temsilcisi çalışma alanı, 4 nokta araziler ve 2 histogramlar içeren bir engrail tarafından yönlendirilen, arka kanat GFP ve Siklin D ifade eden bir larva kanat örnek gösterilirGate 1 ile hücre boyutu ed-Gal4 transgen. A. Nokta arsa enkaz ve kümeleri dışlamak için. B. Nokta arsa lekesiz hücreleri, alt-G1 DNA içeriği (apoptoz) ve kümeleri dışlamak için Gate 2 atlet ayrımcılık. C. GFP vs DNA içerik nokta arsa. GFP negatif (Geçit 3) ve pozitif (Geçit 4) hücreleri ayırt edici ve 2N olabilir ve 4N DNA muhtevasına GFP genel ileri dağılım (FSC) tarafından ölçülen hücre boyutu x-ekseni. D. nokta arsa boyunca olan konuma bağlı olarak belirgindir Kapılar 5 ve 6 oluşturmak için. Gate1 içindeki hücrelerin DNA içeriği vs GFP veya RFP negatif (Gate 3 ayarlı nüfus) için sayar. E. Histogram Bu dağılım çizim kapıları 5 ve 6 belirlenmesinde görsel yardım için renkli kırmızı olduğunu unutmayın. DNA içeriği F. Histogram GFP veya RFP pozitif (Gate 4 olarak ayarlanmış nüfus) için vs sayar. Histogramlar, arzu edildiği takdirde de hücre boyutu için dahil edilebilir. Hücre boyutu histogram için, nüfus omuzd Gates, 5 ve 6 olarak ayarlanmalıdır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Hücre döngüsü ve çeşitli gelişim evreleri ve dokular için hücre boyutu analizi Temsilcisi histogramlar. (A) Temsilcisi histogram verileri DyeCycle Violet (RFP floresan vs DNA içeriği ilave gösterir dağılım çizim ile TTT ifade kullanarak belirli hücre tiplerinde hücre döngüsü karşılaştırmak için gösterilir .) Bu örnek bir engrailed-Gal4 transgen tarafından yönlendirilen posterior TTT, ifade larva kanatları içerir. (B) GMR-gal4 pr ile tahrik GFP ifade ile larva gözünde GFP pozitif vs GFP negatif DNA içeriği histogramlar KaplamalarG1 en GFP pozitif hücreler arası omoter 17,. (C) GMR tahrik GFP arasında küçük nispi hücre boyutuna + hücreleri kapılar 5 ve 6 ile ileri dağılım ile ölçülmüş olarak, GFP kontroller ile karşılaştırıldığında. (D) pupa beyin olarak, GFP pozitif hücreler içinde anormal S-faz giriş (kırmızı ok ucu) neden aşırı ifade eden G1-S hücre döngüsü düzenleyicileri Siklin D ve E2F, 2. larva sırasında uyarılan flp-out yöntemi 5 ile izleme klonlar soy bağlı ısı şoku gösterir normal postmitotic G1 doku tutuklandı. Akış sitometrisi ile gözlenen anormal S fazı giriş S fazı (ilave) hücreleri etiketler edu dahil edilmesi ile de teyit edilmiştir. G1, S ve G2 fazda görece yüzdeleri tahmin etmek için kullanılan bölge (e), Örnek. Sınırlar ayrı bir deney ile Drosophila hücreleri edu S-fazı esas dayalı olarak tahmin edilmiştir. Attun tarafından üretilen (F), istatistik Örnek tablosue yazılım tanımlı bölgelerde göreceli yüzde gösteren. (G) ModFitLT kullanarak temsil Attune veri hücre döngüsü modelleme örneği. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen protokole, hücre döngüsü, göreli hücre boyutu ve nispi hücre sayısı, çeşitli gelişim aşamalarında Drosophila canlı dokularda analizi için olanak sağlar. Bu analiz hücre türüne özgü floresan protein ifade veya izleme soy bağlandığı zaman, detaylı bilgi gizli hücre döngüsü veya büyüme tedirginlikler hücresel yanıtları hakkında elde edilebilir. Beyin hücreleri tutuklandı 90% G1 üzerinde normal olduğunda ilkesinin kanıtı olarak, biz (3D Şekil) bir gelişim aşamasında anormal DNA replikasyonu yol açan, GFP etiketli hücre klonlar G1-S hücre döngüsü düzenleyicileri ifade ederek pupa sinek beyinde sükunet kesintiye .
Ancak bu canlı hücre döngüsü analizi yöntemi için bazı önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, burada tarif edilen protokol kullanılarak mitoz çeşitli aşamalarında hücreleri arasında ayrım yapamaz. Bu nedenle, burada açıklanan analizleri imm ile takviye edilmelidirilgi dokularda mitotik indeks ölçmek için bu Ser10-fosforile Histon H3 18 gibi bir mitoz işaretleyici, için unofluorescence boyama. Ayrıca yöntem her iki devlet aynı DNA içeriği gibi, bir G0 tutuklama vs G1 hücreleri ayırt edemez Burada anlatılan. DyeCycle menekşe canlı hücreler tarafından alınır yana sonra apoptotik aşamalarında hücrelerin belirlenmesi da sınırlıdır. Son olarak, ileri dağılım dayalı hücre boyutu ölçümleri yerine büyüklüğü mutlak miktar daha göreceli hücre boyutu ölçümleri olduğunu not etmek önemlidir. Hücre boyutu mutlak ölçümü için böyle bir Coulter Sayaç (Beckman Coulter) kullanılan bu kadar bir hacim yaklaşımı öneriyoruz.
Hücre döngüsü faz ve boyutu veri hücresi iki katına zaman, hücre döngüsü hakkında ayrıntılı bilgi ve ölçmek için izleme soy bağlandığı zaman büyüme, G1 uzunluğu, S ve G2 fazları ve hücre büyüme oranı 9,11 olarak, hesaplanabilir In vivo hücre döngüsü düzenleyicilerinin gizli genetik manipülasyonlar ile birleştiğinde hücre döngüsü ve kantitatif hücre döngüsü, hücre büyümesi ve doku morfolojilerinden modelleme için büyüme düzenleme hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz gelişmekte olan ve bu sürüm 10 dayandığı orijinal protokol öğretmek için Aida de la Cruz teşekkür ederim. Buttitta Laboratuarı'nda çalışma NIH hibe GM086517 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
||||||||||||||||||
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
