Summary
Un protocole pour l'analyse du cycle cellulaire de vivants
Abstract
La cytométrie en flux a été largement utilisé pour obtenir des informations sur le contenu de l'ADN dans une population de cellules, de déduire pourcentages relatifs aux différentes phases du cycle cellulaire. Cette technique a été étendu avec succès aux tissus de la mitose de l'organisme modèle Drosophila melanogaster pour les études génétiques de la régulation du cycle cellulaire in vivo. Lorsqu'il est couplé avec l'expression de la protéine fluorescente spécifique de type cellulaire et les manipulations génétiques, on peut obtenir des informations détaillées sur les effets sur le nombre de cellules, la taille des cellules et cycle cellulaire élimination in vivo. Cependant, cette méthode cellules vivantes a misé sur l'utilisation de la cellule perméable Hoechst 33342 DNA-intercalant, limitant les utilisateurs à cytomètres équipé d'un laser UV. Nous avons modifié ce protocole à utiliser un colorant plus récent ADN des cellules vivantes, Vybrant DyeCycle Violet, compatible avec le laser violet 405nm plus commun. Le protocole présenté ici permet une analyse du cycle cellulaire efficace couplé avec cellulele type, la taille relative de la cellule et des informations de nombre de cellules, dans une variété de tissus de Drosophila. Ce protocole étend la technique utile du cycle cellulaire d'analyse des tissus vivants drosophile à un petit analyseur de paillasse, le Attune acoustique Cytometer mise au point, qui peut être exécuté et maintenu sur une échelle unique laboratoire.
Introduction
La cytométrie en flux est utilisée pour les mesures de viabilité des cellules, la taille des cellules par rapport, le contenu de ADN et l'expression de la protéine fluorescente dans les populations de cellules vivantes. En raison de la réplication de l'ADN nucléaire au cours de la phase S, des informations sur la teneur en ADN dans une population de cellules peuvent être utilisées pour déduire pourcentages relatifs aux différentes phases du cycle cellulaire 1-3. Cette méthode est devenue une pierre angulaire de l'analyse du cycle cellulaire dans des systèmes modèles de la levure aux mammifères.
La mouche Drosophila melanogaster est devenu un excellent modèle pour génétique analyses in vivo de la régulation du cycle cellulaire. Les outils génétiques disponibles dans de vastes mouches permettent des manipulations tissu élégant précis et régulé temporellement des régulateurs du cycle cellulaire ainsi que dans la lignée à base de protéine fluorescente in vivo traçage 4-6. La cytométrie en flux a été utilisée pour étudier la teneur en ADN dans un certain nombre de types de cellules de drosophile, y compris endoreplet les cellules en mitose culture intoxicantes 7,8. Une avancée importante pour les études du cycle cellulaire in vivo a été faite par de la Cruz et Edgar, avec l'élaboration d'un protocole pour l'analyse par cytométrie de flux de diploïdes direct drosophile imaginales disques 9,10, un protocole qui a été utilisé et adapté par de nombreux laboratoires. Cette technique, couplée avec génétique dans la lignée vivo traçage via l'expression de la protéine fluorescente inductible et l'étiquetage spécifique des tissus, permet d'obtenir des informations sur les effets de manipulation génétique sur le temps de doublement des cellules dans l'ensemble, la taille des cellules et de déterminer le moment précis de phases du cycle cellulaire in vivo 9 , 11. Cependant cette méthode n'a jusqu'à présent compté sur l'utilisation de la cellule perméable Hoechst 33342 de colorant intercalant d'ADN pour colorer et quantifier l'ADN dans des cellules vivantes, ce qui a limité les utilisateurs de s'écouler cytomètres avec un laser UV capable d'exciter le colorant Hoechst. Ceux-ci se trouvent généralement que dans trieurs (c. BD FACS Vantage, BD FACSAria) ou coûteux systèmes de paillasse multicolore (c.-à-BD LSR), nécessitant habituellement un soutien par institutionnels installations de base de flux.
Nous avons modifié le protocole Hoechst basée à utiliser un nouveau colorant de l'ADN des cellules vivantes chez Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Ce colorant est compatible avec un laser violet de 405 nm, plus fréquente chez les petits analyseurs de paillasse et disponible dans le petit analyseur de paillasse autonome, l'acoustique Attune concentrer Cytometer. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'analyse du cycle cellulaire qui peut être couplé avec le type de cellule, la taille de la cellule, le nombre de cellules et l'analyse de la lignée dans une variété de tissus drosophile à divers stades de développement utilisant DyeCycle Violet et le Attune. Ce protocole étend le nombre de cytometers appropriés pour une telle analyse avec des tissus chez la drosophile et fournit des exemples de ce type d'analyse du cycle cellulaire en direct peut être modifié pour des types de tissus supplémentaires et des stades de développement.
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Protocol
1. Fly élevage
- Cross vole de génotypes désirés dans des flacons en plastique étroites avec 10 ml de levure Glucose Moyen 3 ou d'autres médias riches en protéines de votre choix. Les nombreux outils transgéniques Drosophila disponibles pour l'expression spécifique du tissu et de la lignée de traçage avec l'expression de la protéine fluorescente in vivo sont décrits en détail ailleurs 4,5. Transfert aux parents de flacons frais quotidiens d'obtenir des séries de 24 h collections de la descendance, ou pour la stadification plus précise, recueillir des embryons sur des plaques d'agar-agar et transférer larve nouvellement éclos dans des flacons comme décrit 10. Pour assurer des conditions uniformes à travers les expériences et éviter la surpopulation, le nombre total de descendants F1 dans un seul flacon ne doit pas être plus de 100. Selon la conception génétique de l'expérience, mettre les flacons dans un incubateur approprié jusqu'à ce que le stade de développement souhaité.
- Recueillir les animaux de laboratoire: vous devrez larves matures à la 3 e larvairestade (L3) à environ 110-120 heures de développement pour les dissections larvaires ou blanc prepupa (WPP) pour la mise en scène nymphe précis. Les changements du cycle cellulaire dramatiques, y compris le passage à un état de non-prolifération se produisent à timepoints distinctes au cours de métamorphose 12,13. C'est pourquoi la mise en scène correcte de pupe (à 1 h de développement) est essentielle pour les données du cycle cellulaire reproductibles lors de la métamorphose. WPP correspond à 0 h après la formation pupe (0 h APF), comme illustré à la figure 1, tableau I. Recueillir WPP dans un 35 mm boîte de Pétri sur un Kimwipe plié humide avec 2,5 ml d'eau pour maintenir une certaine humidité. Age chrysalide jusqu'à ce stade (heures APF) souhaitée à la température appropriée. Notez que le développement se poursuit 1,2 fois plus rapide à 29 ° C et 2,2 fois plus lentement à 18 ° C qu'à la norme 25 ° C 14.
- Animaux de choc thermique pour activer choc thermique flipase (hs-FLP) induite par recombinaison pour la lignée de traçage clones si nécessaire 9,11. Pour le choc thermique de la larve, plongezfioles dans un bain d'eau (réglé à 37 ° C) et d'assurer les larves sont complètement immergés. Pour le choc thermique de nymphe, sceller la boîte de Pétri avec du Parafilm et entièrement plonger dans le bain-marie. Veillez à retirer Parafilm après le choc thermique, afin de permettre l'échange d'oxygène suffisante pour la survie de l'animal. Durée de la thermo-choc dépend de l'activité du transgène flipase utilisée et le nombre de clones souhaités. Nous utilisons régulièrement 7-8 min pour induire "FlipOut" lignée de traçage clones 15 dans les larves avec le hs-FLP transgène sur le premier chromosome et 2-4 min pour un choc thermique de pupes dans des boîtes de 35 mm, tandis que le hs-FLP transgène sur le second chromosome nécessite une 20 min. choc thermique afin d'obtenir le même nombre de clones.
Le taux de division cellulaire et le calendrier de dissection détermine la taille du clone dans chaque tissu. Dans des conditions normales, nous constatons que les clones induits dans l'aile larvaire avec un choc thermique de 20 min (en utilisant le hs-FLP transgène sur le deuxième chromosome) et dissectionTED 48 heures plus tard, contenir environ 20-30 clones bien séparées avec des tailles allant de 10 cellules par clone à deux cellules par clone, avec une moyenne autour de quatre cellules par clone. En revanche, à 7 min de choc thermique avec le même hs-FLP transgène de pupes dans une boîte de Petri à 0 h APF disséqué 36 heures plus tard, les rendements des clones bien séparées (environ 15-25) allant de un à quatre cellules avec une moyenne de 2,2 cellules par clone. Ces données peuvent être utilisées pour déterminer le temps de doublement des cellules moyenne pour le tissu en cours d'étude.
2. Dissection
- Transférer délicatement les larves / nymphes à un plat de dissection en verre transparent contenant du PBS 1X.
- En utilisant une lumière du microscope et un grand dissection, saisir délicatement une larve par l'abdomen avec un Inox forte # 5 pince, couper le tiers antérieur avec micro-ciseaux, et inverser le tiers antérieur en poussant vers l'intérieur de la zone de la bouche vers le postérieur tout en maintenant la larve cuticule stable (figure 1A). Retirez délicatement opaque corps gras et un intestin restant pour augmenter la visibilité des tissus désirés, tels que les ailes, les yeux ou le cerveau. Disséquer les tissus souhaités; enlever proprement ailes de la trachée et les cuticules avec une pince, les yeux de la bouche des crochets ou le cerveau des yeux (figure 1G).
- Pour disséquer chrysalide; utiliser une pince pour saisir délicatement une nymphe de la pointe antérieure de la coque de nymphose où il ya une bulle d'air, pour éviter d'endommager la pupe à l'intérieur (figure 1C). Forceps ou de micro-ciseaux dans la main opposée peuvent être utilisés pour aider à la nymphe flottante pour saisir appropriée. Proprement couper à travers l'extrémité postérieure de la nymphe avec micro-ciseaux. Cette réduction de section transversale doit être faite à un léger angle vers la partie dorsale de l'animal, pour libérer la pression interne sans forcer la graisse dans les tissus histolyzed souhaités dans le thorax et de la tête. Découpez soigneusement le long de la dorsale médiane, en évitant les ailes et le complexe oeil-cerveau antérieur. Retirez délicatement la nymphe de la chrysalidecas en saisissant le bord postérieur de l'épiderme nymphe et le tirant hors de la coque de nymphose (figure 1D). Percez un petit trou dans la partie antérieure de la cuticule au complexe oeil-cerveau avec une pince. En utilisant une pipette Pasteur en verre avec une poire en caoutchouc, lavez doucement solution de dissection PBS à travers la nymphe partiellement disséqué pour enlever la graisse histolyzed et n'importe quel tissu de l'intestin restant. Cette lubrifie également efficacement la pipette en verre avec des lipides et des protéines, ce qui diminue l'incidence de tissus disséqués de coller à l'intérieur de la pipette de verre plus tard.
- Pour obtenir des ailes chrysalide, la cuticule enveloppant l'aile et l'aile elle-même doit être fouillait de la pupe (figure 1E). Cela peut être fait en tenant la pupe par la tête avec une pince tout en utilisant une autre pince pour saisir soit la pointe la plus postérieure de la cuticule aile et en tirant ou manoeuvrer le pince sous l'aile près de la charnière avant de déloger du côté de la carcasse (Figure 1E). L'aile peut alors être coupée ou déchirée à la charnière pour le retirer du corps et le mettre dans une pile à une distance de la carcasse et d'autres documents.
- Pour obtenir yeux pupes ou le cerveau, laver la chrysalide jusqu'à ce que le complexe oeil-cerveau devient délogé et libre de la pupe (figure 1F, 1H). En utilisant une pince, tirez doucement l'œil nymphe loin du cerveau et sauvegarder le tissu désiré.
- Ne pas prendre plus de 45 minutes pour disséquer chaque échantillon, les résultats deviennent moins précis des cellules plus longues sont laissés dans PBS après l'ouverture des animaux.
3. Tissue dissociation et de l'ADN coloration
- Utilisation d'une pipette Pasteur lubrifié, transférer soigneusement les tissus disséqués dans 0,5 ml de solution de coloration d'ADN en direct dans un tube en polystyrène de 5 ml (figure 1G). Transfert aussi peu PBS que possible (moins de 300 pi) dans la solution de coloration de l'ADN, la dilution de la trypsine va inhiber la dissociation des tissus.
- Incuber les tubes avec Shaking à 23 ° C à 500 rpm (nous utilisons un Eppendorf Thermomixer).
- Incuber pendant 70 min, puis vortex doucement pendant 5 secondes à une vitesse moyenne (valeur 5). Vortex excessive entraînera la rupture des cellules et des débris forme, tandis que la sous-vortex mènera à des amas de cellules. Remettre les échantillons à des secousses à 23 ° C à 500 rpm pendant 15 à 20 minutes supplémentaires avant de les vortex une fois de plus pendant 5 secondes à la vitesse 5.
- Pour cerveau et des yeux pupes de plus de 36hAPF, un protocole modifié est nécessaire. Dissocier les tissus de l'ADN Solution Stain à 23 ° C à 500 rpm pendant 45-60 min à 1,7 microtubes ml. Puis, un par un, manuellement dissocier de grands morceaux de tissu en transférant à plat disséquer avec environ 50 ul ADN Solution Stain et rapide de pipetage de haut en bas avec une pipette Pasteur tiré manuellement 16 (sur environ 100-150 ouverture de um). Transférer chaque échantillon dissocié avec le reste de la 0,5 ml de solution de coloration d'ADN dans un tube de 5 ml. Incuber un montant supplémentaire de 45-30 Min (jusqu'à 90 min de temps d'incubation total) à 23 ° C sous agitation à 500 rpm jusqu'à ce que des touffes ne sont plus visibles.
- Entièrement échantillons dissociés devraient avoir très peu de gros morceaux visibles de tissu, bien noter que la cuticule de l'aile nymphe transparent acellulaire sera pas dissociable.
4. cytométrie en flux
- Allumez le cytomètre Attune et ouvrez le logiciel Attune. Les lasers de cytomètre doivent être activés via le menu de démarrage, et un test de performances quotidiennes doivent être effectuées avec des performances Perles de suivi avec des scores adéquats avant chaque jour de l'acquisition des données. les niveaux de liquide doit être au moins à moitié plein et des déchets vidés avant le test de performance. Détails pour le démarrage, l'étalonnage et le bon fonctionnement de la Attune peuvent être trouvés dans le Guide de l'utilisateur Attune ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
- Concevoir un nouveau template en créant 4 parcelles de points et 2 histogrammes dans un espace vide avec les paramètres indiqués à la section 4.3, ou sélectionnez un modèle conçu précédemment adapté à l'expérience, et indiquer le nombre d'échantillons à prélever. Nous avons fourni des modèles Attune (fichiers à obtenir le format.) Pour l'analyse du cycle cellulaire chez la drosophile en direct avec Vybrant DyeCycle Violet et GFP ou expression DP à l'annexe I.
- Les modèles fournis comprennent quatre parcelles de points et deux histogrammes avec les paramètres indiqués dans la figure 2. Les canaux de détection comprennent: FSC et SSC - diffusion vers l'avant et la diffusion latérale indiquant la taille des cellules et de la complexité de la membrane, VL1 hauteur (H), la largeur (W) et la zone (A) - indiquant une excitation laser violet de DyeCycle Violet coloration l'ADN, et BL1 -A - Bleu Canal 1 Zone laser, indiquant fluorescence de la GFP. Le modèle fourni pour l'analyse DP est identique à la matrice pour analyse GFP, si ce n'est qu'elle utilise le canal de laser Blue 3 (BL3-A), qui est optimisationzed pour la détection DP.
- Les parcelles de points dans les modèles présentent des grilles de limiter l'analyse aux populations souhaitées de limiter les débris et amas cellulaire de l'analyse (Figure 2). Porte 1 exclut les débris et les mottes sur la base de SSC vs FSC (figure 2A). Porte 2 exclut les cellules non colorées, sous les cellules apoptotiques G1 et amas de cellules basées sur l'identification des maillots (VL1Area vs VL1Width) (figure 2B). Porte 3 est une porte dérivée, englobant des cellules dans les portes 1 et 2, et identifie GFP (ou DP) cellules négatives fonction de la teneur d'ADN basé sur VL1Height (figure 2C). Porte 4 est une porte dérivée, englobant des cellules dans les portes 1 et 2, et identifie GFP (ou DP) des cellules positives fonction de la teneur d'ADN (figure 2C). Dot parcelles de la taille des cellules, mesurée par la GFP (ou DP) vs diffusion vers l'avant (FSC) sont utilisés pour générer Gates, 5 et 6 (figure 2D). Les deux teneur en ADN de la parcelle histogrammes sur le comptage d'axe X et la cellule sur la Y-axis pour les populations définies par la porte 3 et la porte 4. (Figure 2E et 2F) histogrammes peuvent également être inclus pour la taille des cellules, si désiré (non représenté). Pour les histogrammes de la taille des cellules, les populations doivent être mis à portes 5 et 6, traçant FSC sur l'axe X et compte sur l'axe des ordonnées.
- Réglez l'enregistrement de s'arrêter à 10.000 événements GFP-positives ou DP (ce sera la porte 4, la Porte dérivé de la Porte 1, Porte 2 et la porte positif GFP ou DP). Varie de 6.000 - 10.000 événements positifs de la GFP ont toujours été l'objectif de publication des profils de qualité 9,11. Nous vous suggérons d'utiliser un minimum de 15 ailes ou des yeux, qui sont environ 50% GFP positive à obtenir suffisamment Porte 4 événements pour 10 profils de haute qualité. Cependant, nous avons réussi à obtenir des données claires pour l'analyse préliminaire du cycle cellulaire d'aussi peu que 6 ailes (figure 3A). Régler le volume d'acquisition de 300 pi, cela va utiliser environ 460 pi du total échantillon de 0,5 ml. Table 2 montre les paramètres de seuil et de tension appropriées prévues dans le modèle de l'exemple de la figure 2.
- Exécuter des échantillons à sensibilité standard ou haute sensibilité 100 pi / min et d'enregistrement. Nous trouvons peu ou pas de différence dans notre analyse avec les différents niveaux de sensibilité. En raison de la focalisation acoustique des cellules, ce cytomètre peut mesurer avec précision des échantillons à des débits très élevés. Contrairement cytometers traditionnels, nous ne trouvons aucune compromission des données par l'acquisition à des vitesses jusqu'à 1.500 événements par seconde. Les fichiers de données enregistrés générés par le logiciel Attune sont au format. FCS, qui est compatible avec la plupart des logiciels de modélisation du cycle cellulaire.
5. Analyse des données
- Histogrammes de la taille des cellules et le contenu de l'ADN pour la GFP (ou RFP) populations positives et négatives peuvent être comparés. Ils peuvent être superposés manuellement en copiant et collant l'aide du logiciel Adobe Photoshop. Si l'axe des y est automatique, l'axe Y va évoluer avec l'highest comptage pour chaque échantillon. Superposer deux graphiques avec le jeu de l'axe Y à l'échelle automatique crée une superposition des histogrammes avec les axes définis pour le maximum global pour chaque population. Ceci permet une comparaison visuelle facile pour les changements relatifs dans le cycle cellulaire en phase, même si le nombre total de cellules de GFP positives et négatives populations GFP ne sont pas équivalentes (par exemple dans la figure 3B). Alternativement, une mesure ordonnée (option manuelle axe Y) peut être réglé à une valeur fixe pour les histogrammes. Dans ce cas, le nombre de cellules relatives de deux populations peuvent être comparés. Comme le Attune utilise un volume défini de l'échantillon par cycle, la quantification absolue des cellules pour chaque course, dans chaque porte avec des pourcentages de la population totale, peut être obtenu à partir du tableau des statistiques générées automatiquement lors de la course à l'espace de travail (exemple de la figure 3F ). Parcelles et des histogrammes point peut également être facilement superposées dans le logiciel Attune, par simple glisser-déposer différents échantillons de ee menu fichier d'exemple à droite sur le graphique désiré d'un échantillon ouvert pour la comparaison. Cependant, pour superposer des sous-populations à partir d'un seul échantillon (c.-à-GFP positive et négative GFP dans le même échantillon), nous utilisons Photoshop.
- Deux méthodes peuvent être utilisées pour trouver des pourcentages relatifs aux différentes phases du cycle cellulaire d'une population. La méthode de l'approximation repose sur les régions définies par l'utilisateur pour définir les limites de G1, S, G2 et G2> pics. Cette méthode permet estimations rapides et faciles des pourcentages dans les régions définies par l'utilisateur (figure 3F). Nous avons mis nos régions fondée sur un test direct avec les cellules de drosophile Kc, étiqueté pour la phase S en utilisant Ethynyl-uridine (EDU) incorporation. La deuxième méthode utilise troisième logiciel de modélisation de partie pour l'estimation de la distribution du cycle cellulaire. Nous avons utilisé le logiciel ModFitLT (Verity Software House), par exemple, dans la figure 3F.
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Representative Results
La figure 2 montre des résultats représentatifs d'un échantillon d'aile larvaire, exprimant la GFP dans la moitié postérieure du tissu, en utilisant le modèle de GFP fourni. Des résultats similaires sont obtenus avec le même type de tissu et le modèle d'expression pour DP en utilisant le modèle DP fourni (figure 3A). Les modèles et les tensions fournies (tableau 2) sont adaptés à l'analyse des yeux larvaires (figure 3B), la cervelle et les ailes, ainsi que les yeux, le cerveau pupes (figure 3D) et les ailes. Histogrammes de taille relative des cellules fournie en traçant FSC pour les populations des portes 5 et 6 peuvent également être générés (figure 3C). Gates a peut-être nécessaire d'ajuster légèrement en raison de différences dans la taille des cellules de différents tissus ou des différences dans l'intensité de fluorescence de la GFP différents transgènes ou DP. Cela peut se faire lors de l'exécution d'un petit volume d'essai de l'échantillon (50-100 ul), avant de frapper dossier.
Allowing l'axe des ordonnées (chiffres) pour le cycle cellulaire ou des histogrammes de la taille des cellules à l'auto-échelle (échelle ordonnée en mode automatique) dans le logiciel de Attune, les résultats en histogrammes montrant le maximum global pour chaque population. Figure montre 3B-3D des résultats représentatifs avec GFP positives et négatives GFP histogrammes avec l'axe des y au niveau maximal global pour chaque population. Mise au maximum y-axe spécifique (échelle ordonnée en mode manuel avec une valeur définie par l'utilisateur), permet de comparer les chiffres absolus entre les populations, qui peut être utile pour comparer les taux de prolifération, mais il est difficile de comparer cycle cellulaire mise en place progressive populations lorsque le nombre de cellules GFP-positives par rapport aux cellules négatives GFP sont très différents.
La figure 3B montre les profils du cycle cellulaire des cellules positives et négatives GFP dans les yeux larvaires, exprimant la GFP dans la partie postérieure en utilisant les Gal4-GMR, UAS-GFP transgènes. La superposition révèle les différences dans le cycle cellulaire phasing de la GFP postérieure cellules exprimant. figure 3C montre la variation relative de la taille des cellules entre les cellules positives et négatives GFP en B, en traçant la taille des cellules, telle que mesurée par le FSC. Figure 3D montre un profil de cycle cellulaire de cerveaux pupes à 46h APF. Cellules GFP-positives sont clones lignée de traçage exprimant le G1-S régulateurs cycline D et E2F qui perturbent quiescence et conduit à l'entrée en phase S, indiqué par la flèche rouge et confirmé par l'étiquetage de la phase S avec incorporation de Edu (figure 3D encadré). Ceci est en contraste avec les non-cellules exprimant GFP négatifs, qui à ce stade sont normalement arrêtés en G1 (trace noire, figure 3D).
La plupart des profils du cycle cellulaire sont utilisés pour obtenir des informations sur les pourcentages de la population dans les différentes phases du cycle cellulaire. Cela peut être approchée dans le logiciel Attune en créant des régions définies par l'utilisateur sur le histogrammes délimitant G1, S et G2 phases (<strong> Figure 3E). Le logiciel Attune génère automatiquement un tableau de statistiques pour chaque opération, en donnant les valeurs absolues de cellules au sein des régions et des pourcentages (figure 3F) définis par l'utilisateur. Cette méthode fonctionne bien lorsque l'on compare les changements relatifs à la distribution de phase entre une commande et la population expérimentale. Alternativement, un logiciel de modélisation peut être utilisée pour estimer les pourcentages dans chaque phase ainsi que les cellules apoptotiques. Nous avons utilisé ModFitLT (Verity Software House) dans la figure 3G, ce qui peut ouvrir directement les fichiers de données. Fcs générés par le logiciel Attune.
Figure 1. Dissection et la tenue des tissus larvaires et chrysalide. A. Dissection des larves (de génotype w 1118 illustré) à 110h de développement montrant le tiers antérieur avant (en haut) et après (en bas) inversion. Tête de flèche blanche indique une aile attachée à la cuticule des larves et une flèche rouge indique la position du cerveau B. Ailes (tête de flèche blanche; noter aile à gauche est relié à un disque de la patte, aile de droite est déchirée au notum dorsale), les yeux (jaune) et le cerveau (rouge) retiré de la larve. C. Dissection de pupe montrant les positions des coupes avec des pinces placées à l'espace aérien antérieure à la tête (pointillés rouges) D. Pupa retiré de la cuticule avant le lavage pour enlever la graisse et les intestins . E. Nettoyé chrysalide processus de levée des ailes pour l'enlèvement montrant F. Nettoyé chrysalide montrant ailes (en pointillés) et partiellement enlevé complexe oeil-cerveau (flèches rouges et jaunes). G. disséqué ailes et des yeux montrant pipette pour le transfert des larves. H. disséqué post-mitotique nymphe oeil-cerveau complexe. I. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Analyse représentative du cycle cellulaire des tissus exprimant la GFP en utilisant Vybrant Violet DyeCycle et le Attune. Un espace de travail de représentant, contenant 4 parcelles de points et 2 histogrammes est indiqué pour un échantillon d'aile larvaire exprimant la GFP et la cycline D dans l'aile postérieure, entraînée par un engrailed-Gal4. A. Dot parcelle de la taille des cellules avec la porte 1 à exclure les débris et les mottes. B. Dot complot visant à discriminer maillots avec la porte 2 pour exclure les cellules non colorées, la teneur en ADN sub-G1 (apoptose), et de bouquets. C. Dot parcelle de GFP par rapport à la teneur en ADN. Cellules GFP négatifs (Porte 3) et positive (porte 4) peuvent être distingués et 2N et la teneur en ADN 4N est évident basé sur la position le long de l'axe x-. D. Dot parcelle de la taille des cellules, telle que mesurée par GFP vs diffusion vers l'avant (FSC) pour générer des portes 5 et 6. Notez que les cellules dans Gate1 sont de couleur rouge pour l'assistance visuelle pour déterminer Gates, 5 et 6 de ce nuage de points. E. histogramme de la teneur en ADN vs compte pour la GFP ou DP négatif (population mis à la porte 3). F. histogramme de la teneur en ADN vs compte pour la GFP ou DP positive (population mis à la porte 4). Histogrammes peuvent également être inclus pour la taille des cellules, si désiré. Pour les histogrammes de la taille des cellules, des populations épauled être mis à portes 5 et 6. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Histogrammes représentatifs de cycle cellulaire et l'analyse de la taille des cellules pour les différentes étapes et les tissus de développement. (A) des données d'histogramme représentatif est présenté pour comparer cycle cellulaire dans des types cellulaires spécifiques en utilisant l'expression DP avec DyeCycle Violet (encart montre nuage de points de DP fluorescence contenu par rapport à l'ADN ). Cet exemple contient ailes larvaires exprimant RFP dans le postérieur, entraînée par un transgène engrailed-Gal4. (B) Superpositions de la GFP positives vs GFP négatifs histogrammes de contenu d'ADN dans les yeux des larves avec l'expression de la GFP entraînés par le GMR-gal4 promoter 17, montrant la plupart des cellules positives pour la GFP dans G1. (C) la taille des cellules relativement plus petits de GMR axée GFP + des cellules par rapport à la GFP contrôles, tel que mesuré par diffusion vers l'avant à l'aide portes 5 et 6. (D) dans le cerveau chrysalide, GFP positif cellules indiquent choc thermique induit lignée clones de traçage via FLP-out méthode 5 induite lors de la 2 ème stade larvaire, la sur-expression de la G1-S du cycle cellulaire régulateurs cycline D et E2F, provoquant l'entrée en phase S aberrante (rouge pointe de flèche) dans le G1 normalement postmitotique arrêté tissus. L'entrée en phase S anormale constatée par cytométrie de flux a été confirmée par l'incorporation d'Edu, qui marque les cellules en phase S (en médaillon). (E) Exemple de régions utilisées pour estimer les pourcentages relatifs à G1, S et G2 phases. Ont été estimés sur la base des frontières lors de la constitution de la phase S de l'Education dans les cellules de drosophile dans une expérience séparée. (F) Exemple de statistiques table générée par Attunlogiciel de e montrant pourcentages relatifs à des régions définies. (G) Exemple de modélisation du cycle cellulaire des données représentatives Attune utilisant ModFitLT. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Le protocole décrit ici permet une analyse de cycle cellulaire, la taille relative de la cellule et le nombre relatif de cellules dans les tissus vivants drosophile à différents stades de développement. Lorsque cette analyse est couplée avec l'expression de la protéine fluorescente spécifique du type de cellule ou lignée de traçage, des informations détaillées peuvent être obtenues sur les réponses cellulaires au cycle cellulaire discrète ou perturbations de croissance. Comme preuve de principe, nous avons perturbé quiescence dans le cerveau de la mouche nymphe en exprimant régulateurs du cycle cellulaire G1-S dans les clones cellulaires marqués GFP, ce qui conduit à la réplication de l'ADN aberrante à un stade de développement où les cellules du cerveau sont normalement plus de 90% G1 arrêté (figure 3D) .
Cependant, il ya des limites importantes à cette méthode d'analyse de cycle de cellules vivantes. Tout d'abord, on ne peut pas distinguer entre les cellules dans les différentes étapes de la mitose en utilisant le protocole décrit ici. Ainsi, l'analyse décrite ici devrait être complétée par immcoloration unofluorescence pour un marqueur mitotique, comme Ser10-phosphorylé Histone H3 18 pour quantifier l'index mitotique dans les tissus d'intérêt. En outre, la méthode décrite ici ne peut pas distinguer entre les cellules en G1 par rapport à une arrestation G0, que les deux Etats ont la même teneur en ADN. Depuis DyeCycle Violet est absorbé par les cellules vivantes, identification des cellules apoptotiques dans les étapes ultérieures est également limitée. Enfin, il est important de noter que les mesures de la taille des cellules sur la base de dispersion vers l'avant sont des mesures de la taille des cellules relatives au lieu de quantification absolue de la taille. Pour la quantification absolue de la taille des cellules, nous recommandons une approche volumétrique tel que celui utilisé dans un compteur Coulter (Beckman Coulter).
Lorsque la phase du cycle cellulaire et la taille des données est couplée avec la lignée de traçage pour mesurer le temps de doublement des cellules, des informations détaillées sur le cycle cellulaire et la croissance peut être calculée, comme la longueur du G1, S et phases G2 et le taux de croissance des cellules 9,11 in vivo peut fournir des informations détaillées sur le cycle cellulaire et la régulation de la croissance pour le cycle, la croissance quantitative cellule cellule et la modélisation de la morphogenèse des tissus.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Aida de la Cruz pour le développement et l'enseignement du protocole original sur lequel cette version est basée 10. Le travail dans le Buttitta Lab est soutenu par NIH GM086517.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
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Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
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References
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