Summary
Een protocol voor celcyclus analyse gemaakt van live
Abstract
Flowcytometrie is op grote schaal gebruikt om informatie over DNA gehalte te bepalen in een populatie van cellen, de relatieve percentages afleiden in verschillende fasen van de celcyclus. Deze techniek is met succes uitgebreid naar de mitotische weefsels van het modelorganisme Drosophila melanogaster voor genetische studies van de celcyclus in vivo. In combinatie met celtype-specifieke fluorescente proteïne expressie en genetische manipulaties kan men informatie over effecten op het aantal cellen, celgrootte en celcyclus geleidelijk in vivo te verkrijgen. Maar dit levende cellen methode gebaseerd op de toepassing van de cel permeabele Hoechst 33342 DNA-intercalerende kleurstof, het beperken tot flowcytometers met een UV laser. We hebben dit protocol aangepast naar een nieuwere levende cellen DNA-kleurstof, Vybrant DyeCycle Violet, verenigbaar is met de meer voorkomende violet 405 nm laser gebruiken. Het protocol hier gepresenteerde zorgt voor een efficiënte celcyclusanalyse gekoppeld aan celtype, relatieve celgrootte en celaantal informatie in verschillende Drosophila weefsels. Dit protocol breidt de bruikbare celcyclus analyse techniek voor levende Drosophila weefsels een klein tafelmodel analyzer, de Attune Acoustic Focussen Cytometer, die kan worden uitgevoerd en gehandhaafd op een single-lab schaal.
Introduction
Flowcytometrie kan worden gebruikt voor het meten van cel levensvatbaarheid relatieve celgrootte DNA inhoud en fluorescerend eiwit expressie in levende celpopulaties. Door de replicatie van nucleair DNA in S-fase over DNA-inhoud in een populatie van cellen kan worden gebruikt om de relatieve percentages afleiden in verschillende fasen van de celcyclus 1-3. Deze methode is uitgegroeid tot een hoeksteen van de celcyclus analyse in modelsystemen van gist tot zoogdieren.
De fruitvlieg Drosophila melanogaster is uitgegroeid tot een uitstekend modelsysteem voor genetisch in vivo analyses van de celcyclus. De uitgebreide genetische tools beschikbaar in vliegen zorgen voor een elegante weefselspecifieke en tijd gereguleerd manipulaties van celcyclus regulatoren samen met in vivo fluorescent eiwit gebaseerde lineage tracing 4-6. Flowcytometrie werd gebruikt voor DNA-gehalte bestuderen in Drosophila aantal celtypes, waaronder endoreplicating cellen en gekweekte mitotische cellen 7,8. Een belangrijke vooruitgang voor in vivo celcyclus studies werd gemaakt door de la Cruz en Edgar, met de ontwikkeling van een protocol voor flowcytometrische analyse gemaakt van live diploïde Drosophila imaginal schijven 9,10, een protocol dat is gebruikt en aangepast door vele laboratoria. Deze techniek, wanneer gekoppeld aan genetische in vivo lineage tracing via induceerbare fluorescerend eiwit expressie en weefsel specifieke etiketteringsvoorschriften, maakt het mogelijk om informatie over genetische manipulatie effecten op de totale cel verdubbelingstijd, celgrootte te verkrijgen en om precieze timing van de fasen van de celcyclus bepalen in vivo 9 , 11. Maar deze methode is tot nu toe vertrouwd op het gebruik van de cel permeabele Hoechst 33342 DNA-intercalerende kleurstof vlekken en kwantificeren van DNA in levende cellen, die alleen gebruikers cytometers stromen met een UV laser kan opwindende Hoechst kleurstof. Deze zijn over het algemeen alleen te vinden in sorteerders (dwz BD FACS Vantage, BD FACSAria) of dure multicolor stationaire systemen (dwz BD LSR), meestal die steun door institutionele stroming kernfaciliteiten.
We hebben het Hoechst-gebaseerd protocol gewijzigd om een nieuwe live-cell DNA kleurstof van Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet gebruiken. Deze kleurstof is compatibel met een violet 405 nm laser, vaker voor bij kleinere stationaire analysers en verkrijgbaar in de kleine zelfstandige tafelmodel analyzer, de Attune Acoustic Scherpstellen Cytometer. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor celcyclus analyse die kan worden gekoppeld met celtype, celgrootte, het aantal cellen en lineage analyse verschillende Drosophila weefsels in verschillende ontwikkelingsfasen gebruik DyeCycle Violet en Attune. Dit protocol breidt het aantal cytometers geschikt voor een dergelijke analyse Drosophila weefsels en geeft voorbeelden van hoe dit soort levende celcyclus analyse kan worden aangepast voor andere soorten weefsels en ontwikkelingsstadia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Veehouderij
- Kruis vliegt van gewenste genotypen in smalle plastic flesjes met 10 ml gist-Glucose Medium 3 of andere eiwitrijke media van uw keuze. De uitgebreide Drosophila transgene tools beschikbaar voor weefsel-specifieke expressie en lineage tracing met in vivo fluorescent eiwit expressie worden in detail beschreven elders 4,5. Overdragen ouders om verse flesjes per dag naar reeks 24 uur nageslacht collecties te verkrijgen, of om nauwkeuriger enscenering, verzamel embryo's op agar platen en overdragen pas uitgekomen larve om flesjes zoals beschreven 10. Om uniforme voorwaarden over experimenten en vermijd overbevolking, moet het totale aantal F1 nakomelingen in een enkele flacon niet meer dan 100. Afhankelijk van de genetische ontwerp van het experiment te houden flesjes op passende incubator tot het gewenste ontwikkelingsstadium.
- Verzamel proefdieren: u zult volwassen larven in het 3e larvale nodiginstar (L3) op ongeveer 110-120 uur van de ontwikkeling van de larven dissecties of wit prepupa (WPP) voor nauwkeurige pupal enscenering. Dramatische celcyclus veranderingen, waaronder een switch naar een niet-proliferatieve toestand plaatsvinden op verschillende tijdstippen tijdens de metamorfose 12,13. Dus terecht enscenering van pop (binnen 1 uur van de ontwikkeling) is essentieel voor reproduceerbare celcyclus gegevens tijdens metamorfose. WPP komt overeen met 0 uur na pop formatie (0 hr APF) zoals weergegeven in figuur 1, paneel ik. Verzamel WPP in een 35 mm petrischaal op een gevouwen Kimwipe nat met 2,5 ml water om wat vocht te behouden. Leeftijd pop tot de gewenste fase (uren APF) op de juiste temperatuur. Merk op dat de ontwikkeling verloopt 1,2 keer sneller bij 29 ° C en 2,2 x zo lang bij 18 ° C dan bij de standaard 25 ° C 14.
- Heat-shock dieren hitte-shock flipase (hs-FLP)-geïnduceerde recombinatie activeren voor lineage tracing-klonen als dat nodig is 9,11. Voor de warmte-shock van larve, dompelflacons in een waterbad (ingesteld op 37 ° C) en zorgen voor larven zijn geheel onder water. Voor de warmte-shock van pop, verzegelen de petrischaal met Parafilm en volledig onderdompelen in het water-bad. Zorg ervoor dat u Parafilm verwijderen nadat de heat-shock, om voldoende zuurstof ruil voor dieren overleven mogelijk. Duur van de warmte-shock hangt de activiteit van het transgen flipase gebruikt en het aantal klonen wenst. Wij gebruiken routinematig 7-8 min. voor het induceren "flipout" lineage tracing klonen 15 in larven met de hs-FLP transgen op de eerste chromosoom en 2-4 min voor heat shock van poppen in 35 mm gerechten, terwijl de hs-flp transgen op het tweede chromosoom vereist een 20 min.. hitteschok vergelijkbare aantallen klonen te verkrijgen.
De snelheid van celdeling en de timing van de dissectie bepaalt kloon grootte in elk weefsel. Onder normale omstandigheden, vinden we dat klonen geïnduceerd in het larvale vleugel met een 20 min heat shock (met behulp van de hs-FLP transgen op het tweede chromosoom) en dissected 48 uur later, bevatten ongeveer 20-30 goed gescheiden klonen met maten variërend van 10 cellen per kloon tot twee cellen per kloon, met een gemiddelde rond vier cellen per kloon. In tegenstelling, een 7 min heat-shock met dezelfde hs-FLP transgen van poppen in een petrischaal bij 0 uur APF ontleed 36 uur later, levert goed gescheiden klonen (ongeveer 15-25), variërend van een tot vier cellen met een gemiddelde van 2,2 cellen per kloon. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om de gemiddelde cel-verdubbelingstijd van het weefsel onder studie te bepalen.
2. Ontleding
- Zacht overdracht van de larven / poppen aan een helder glas dissectie schotel met 1X PBS.
- Met behulp van een dissectie microscoop en voldoende licht, zacht greep een larve van de buik met een scherp Inox # 5 pincet, snijd het voorste derde deel met micro-schaar, en keer het voorste derde door op de mond gebied naar binnen in de richting van de achterste terwijl het larvale cuticula gestage (Figuur 1A). Verwijder voorzichtig opaque dik lichaam en de overgebleven darm om de zichtbaarheid van de gewenste weefsels, zoals vleugel, oog of de hersenen te verhogen. Ontleden de gewenste weefsels; netjes verwijderen vleugels van luchtpijp en nagelriemen met een pincet, de ogen van mond-haken, of de hersenen van de ogen (figuur 1G).
- Voor het ontleden van pop, gebruik een pincet om voorzichtig greep een pop door het voorste punt van het popstadium geval waar sprake is van een luchtbel, beschadiging van de pop binnen (figuur 1C) te vermijden. Forceps of micro-schaar in de tegengestelde hand kan worden gebruikt om de positie van de zwevende pop voor grijpbewegingen helpen. Netjes snijden door het achterste punt van de pop met micro-schaar. Deze cross-sectionele snede moet worden gemaakt in een lichte hoek in de richting van het dorsale gedeelte van het dier, om de inwendige druk te verminderen zonder dat het histolyzed vet in het gewenste weefsel in de borstkas en het hoofd. Knip voorzichtig langs de dorsale mediaan, het vermijden van de vleugels en het voorste oog-brein complex. Verwijder de pop voorzichtig uit het popstadiumgeval door grijpen de achterste rand van het popstadium opperhuid en naar buiten te trekken van het popstadium (figuur 1D). Poke een klein gaatje in de cuticula juist voor de eye-brain complex met een pincet. Met behulp van een glas Pasteur pipet met een rubberen bol, voorzichtig te wassen PBS dissectie oplossing door de gedeeltelijk ontleed pop te histolyzed vet en alle resterende darm weefsel te verwijderen. Dit ook effectief smeert de glazen pipet met lipiden en eiwitten, waarbij de incidentie van ontleed weefsel vermindert plakken aan de binnenkant van het glazen pipet later.
- Om pupal vleugels te verkrijgen, de cuticula omhult de vleugel en de vleugel zelf moet worden peuterde uit de pop (figuur 1E). Dit kan gedaan worden door het houden van de pop door het hoofd met een pincet tijdens het gebruik van een andere pincet om ofwel vatten de meest achterste punt van de vleugel nagelriem en uit te trekken of manoeuvreren de pincet onder de vleugel in de buurt van het scharnier voordat loskomen van het van de kant van het karkas (Figure 1E). De vleugel kan dan worden geknipt of gescheurd bij het scharnier om het te verwijderen uit het lichaam en zet in een stapel weg van de kadavers en ander materiaal.
- Om pupal ogen of hersenen krijgen, wast de pop tot aan de eye-brain complex wordt verdreven en vrij van de pop (Figuur 1F, 1H). Met behulp van een tang, trek de popstadium oog weg van de hersenen en het opslaan van de gewenste weefsel.
- Niet langer duren dan 45 minuten aan elk monster ontleden, als resultaat minder nauwkeurig de langere cellen worden achtergelaten in PBS na de dieren openen.
3. Tissue Dissociatie en DNA kleuring
- Met behulp van een gesmeerde Pasteur pipet voorzichtig overdracht van de ontleed weefsel in 0,5 ml Levende DNA Stain Solution in een ml polystyreen buis 5 (figuur 1G). Verlaging in PBS weinig mogelijk (minder dan 300 pl) in het DNA Stain Solution, zoals verdunning van trypsine zal weefsel dissociatie remmen.
- Incubeer buizen met shaking bij 23 ° C bij 500 rpm (gebruiken we een Eppendorf Thermomixer).
- Incubeer gedurende 70 min, daarna vortex zachtjes gedurende 5 seconden bij een gemiddelde snelheid (instelling van 5). Overmatige vortexen zal leiden celdisruptie en vorm puin, terwijl onder-vortexen zal leiden tot cel klonten. Stuur de monsters schudden bij 23 ° C bij 500 rpm gedurende nog eens 15 tot 20 minuten voordat ze opnieuw vortexen gedurende 5 seconden op snelheid 5.
- Voor hersenen en pupal ogen ouder dan 36hAPF, wordt een aangepast protocol vereist. Dissociate weefsels in DNA Stain oplossing bij 23 ° C bij 500 rpm gedurende 45-60 min in 1,7 ml microcentrifuge buizen. Vervolgens een voor een handmatig grote stukjes weefsel dissociëren door over te ontleden schotel met ongeveer 50 pi DNA Stain Solution en snel op en neer pipetteren met een handmatig getrokken Pasteur pipet 16 (van ongeveer 100-150 micrometer opening). Breng elk exemplaar met gedissocieerd de overige 0,5 ml DNA Stain oplossing in een 5 ml buisje. Incubeer een extra 45-30 Min (tot 90 min totale incubatietijd) bij 23 ° C onder schudden bij 500 rpm totdat het ijs niet langer zichtbaar.
- Volledig gescheiden monsters moeten hebben zeer weinig grote zichtbare stukjes weefsel, hoewel er rekening mee dat de acellulaire transparante popstadium vleugel cuticula zal niet distantiëren.
4. Flowcytometrie
- Zet de Attune cytometer en open de Attune software. De cytometer lasers moet worden ingeschakeld via het opstartmenu, en een dagelijkse performance test moet worden uitgevoerd met een optreden Tracking Kralen met voldoende punten voor elke dag van data-acquisitie. Vloeistofniveaus moet ten minste de helft vol en afval geleegd voordat het verrichtingsonderzoek. Details voor het opstarten, de juiste kalibratie en de werking van de Attune kan worden gevonden in de Attune Gebruikershandleiding ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
- Ontwerp een nieuw template door het creëren van 4 puntdiagrammen en 2 histogrammen in een lege werkruimte met de parameters aangegeven in 4.3, of selecteer een eerder ontworpen template geschikt voor het experiment, en geef het aantal te nemen monsters. We hebben Attune templates (bestanden in. Krijg formaat) voor levende Drosophila celcyclusanalyse met Vybrant DyeCycle Violet en GFP of RFP expressie in Bijlage I.
- De sjablonen omvatten vier puntdiagrammen en twee histogrammen met de parameters aangegeven in Figuur 2. Kanalen voor detectie zijn: FSC en SSC - voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing aangeeft celgrootte en membraan complexiteit, VL1 hoogte (H), breedte (W) en het gebied (A) - aangeeft Violet laser excitatie van DyeCycle Violet kleuring van het DNA, en BL1 -A - Blue laser Kanaal 1 Area, met vermelding van GFP-fluorescentie. De template voor RFP analyse is identiek aan het model voor GFP analyse, behalve dat het de blauwe laser kanaal 3 (BL3-A), dat optimaliseringzed voor RFP detectie.
- De dot plots in de sjablonen poorten analyse te beperken tot de gewenste populaties en puin en celklonten beperken van de analyse (figuur 2). Gate 1 uitsluit puin en bosjes op basis van SSC vs FSC (Figuur 2A). Gate 2 uitsluit ongekleurde cellen, sub G1 apoptotische cellen en celklonten gebaseerd op de identificatie van singlets (VL1Area vs VL1Width) (Figuur 2B). Poort 3 is een afgeleide poort, omvat cellen in poorten 1 en 2, en identificeert GFP (of RFP) negatieve cellen tegen DNA inhoud op basis VL1Height (figuur 2C). Gate 4 is een afgeleide poort, omvat cellen in poorten 1 en 2, en identificeert GFP (of RFP) positieve cellen tegen DNA gehalte (figuur 2C). Puntdiagrammen van celgrootte gemeten GFP (of RFP) versus voorwaartse verstrooiing (FSC) worden gebruikt om poorten 5 en 6 (figuur 2D) te genereren. De twee histogrammen plot DNA inhoud van de X-as en het aantal cellen op de Y-axis voor de door Gate 3 en Gate 4 populaties. (Figuur 2E en 2F) histogrammen zijn mogelijk voor celgrootte indien gewenst (niet weergegeven). Voor celgrootte histogrammen moet populaties worden ingesteld Gates 5 en 6, plotten FSC op de X-as en rekent op de y-as.
- Stel de opname te stoppen bij 10.000 GFP of RFP positieve gebeurtenissen (dit zal Gate 4, de afgeleide Poort van Poort 1, Gate 2 en de GFP of RFP positieve gate). Varieert van 6.000 - 10.000 GFP positieve gebeurtenissen zijn van oudsher de doelstelling voor publicatie kwaliteit profielen 9,11. We raden het gebruik van een minimum van 15 vleugels of ogen, dat zijn ongeveer 50% GFP-positieve voldoende Gate 4 evenementen 10 voor hoge kwaliteit profielen te verkrijgen. Wij hebben echter succes duidelijke gegevens voorlopige celcyclus analyse verkregen van zo weinig als 6 vleugels (figuur 3A). Stel de overname volume van 300 ul, zal dit gebruiken ongeveer 460 ul van de totale 0,5 ml monster. Table 2 toont passende drempel spanning en instellingen die in het model voor het voorbeeld in figuur 2.
- Run monsters bij standaard gevoeligheid of hoge gevoeligheid 100 pl / min en opnemen. We vinden weinig tot geen verschil in onze analyse met de verschillende gevoeligheidsniveaus. Door de akoestische concentratie van cellen, kan deze cytometer nauwkeurig monsters bij zeer hoge stroomsnelheden. In tegenstelling tot traditionele cytometers, vinden we geen gegevens compromis door de overname met snelheden tot 1500 gebeurtenissen per seconde. De opgenomen bestanden gegenereerd door de Attune software zijn in. Fcs-formaat, die compatibel is met de meeste celcyclus modeling software is.
5. Data Analysis
- Histogrammen van celgrootte en DNA content voor GFP (of RFP) positieve en negatieve populaties kunnen worden vergeleken. Ze kunnen handmatig worden gelaagd door kopiëren en plakken met behulp van Adobe Photoshop-software. Als de y-as is ingesteld op automatisch, zal de Y-as te schalen met de highest tellen voor elk monster. Overlappen twee grafieken met de Y-as ingesteld op autoscale een overlay gemaakt van histogrammen met de voor het globaal maximum voor elke populatie assen. Dit maakt een eenvoudige visuele vergelijking van de relatieve veranderingen in de celcyclus fasering, zelfs als totale aantal cellen van GFP positieve en negatieve GFP bevolking niet gelijkwaardig zijn (voorbeeld in figuur 3B). Als alternatief, een aangepaste y-as (y-as handmatige optie) kan worden ingesteld op een vaste waarde voor de histogrammen. In dit geval is het relatieve aantal cellen voor twee populaties worden vergeleken. Zoals de Attune maakt gebruik van een bepaald volume van het monster per run, absolute kwantificering van de cellen voor elke run, in elke poort met percentages van de totale bevolking, kan worden verkregen uit de tabel met statistieken automatisch gegenereerd tijdens de vlucht in de werkruimte (voorbeeld in figuur 3F ). Puntdiagrammen en histogrammen kunnen ook gemakkelijk worden gelaagd in de Attune software, door simpelweg te slepen en verschillende monsters van the voorbeeld menu bestand tegen rechtsaf de gewenste grafiek van een open monster voor vergelijking. Maar om subpopulaties bedekken vanuit een enkel monster (dwz GFP positieve en negatieve GFP binnen hetzelfde monster), maken we gebruik van Photoshop.
- Twee methoden kunnen worden gebruikt om de relatieve percentages vinden in verschillende fasen van de celcyclus voor de populatie. De onderlinge methode berust op door de gebruiker gedefinieerde regio's om de grenzen van G1, S, G2 en> G2 pieken af te bakenen. Deze methode maakt het mogelijk snel en eenvoudig schattingen van percentages binnen de door de gebruiker gedefinieerde gebieden (figuur 3E). We zetten onze regio op basis van een directe test met Drosophila Kc cellen, gelabeld voor de S-fase met Ethynyl-deoxyuridine (EDU) incorporatie. De tweede methode maakt gebruik van derden modeling software voor de schatting van de celcyclus distributie. We gebruikten ModFitLT (Verity Software House) software bijvoorbeeld, in figuur 3F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont representatieve resultaten voor een larvale vleugel steekproef, die GFP in de achterste helft van het weefsel, met behulp van de meegeleverde GFP template. Soortgelijke resultaten worden verkregen met hetzelfde weefseltype en het expressiepatroon van RFP met de bijgeleverde RFP template (Figuur 3A). De templates en voltages (tabel 2) zijn geschikt voor analyse van larvale ogen (figuur 3B), hersenen en vleugels, evenals pupal ogen, hersenen (Figuur 3D) en vleugels. Histogrammen van relatieve celgrootte door plotten FSC van populaties in Gates 5 en 6 kunnen ook worden gegenereerd (Figuur 3C). Gates enigszins aan te passen als gevolg van verschillen in celgrootte voor verschillende weefsels of verschillen in fluorescentie-intensiteit voor verschillende GFP of RFP transgenen. Dit kan gedaan worden tijdens het uitvoeren van een kleine test volume van het monster (50-100 pi), alvorens naar record.
Eenllowing de y-as (tellingen) van de celcyclus of celgrootte histogrammen om auto-schaal (schaal y-as op automatisch) in de Attune software, resulteert in histogrammen tonen de globale maximum voor elke populatie. Figuur 3B-3D shows representatieve resultaten met GFP positieve en GFP negatieve histogrammen met y-as ingesteld op het globaal maximum voor elke populatie. Een bepaalde maximale y-as (schaal y-as ingesteld op handmatig met een door de gebruiker gedefinieerde waarde), het instellen van maakt voor de vergelijking van de absolute aantallen tussen populaties, die nuttig kan zijn voor het vergelijken van proliferatie tarieven, maar maakt het moeilijk om te vergelijken celcyclus geleidelijke invoering bevolkingen wanneer nummers van GFP positieve cellen versus GFP negatieve cellen zijn enorm verschillend.
Figuur 3B toont de celcyclus profielen voor GFP positieve en negatieve cellen in larvale ogen, die GFP in de achterste met de GMR-Gal4, UAS-GFP transgenen. De overlay toont de verschillen in celcyclus pKetil van de achterste GFP tot expressie brengen. Figuur 3C toont de relatieve verandering in cel grootte tussen GFP positieve en negatieve cellen in B, door het plotten celgrootte zoals gemeten door FSC. Figuur 3D toont een celcyclus profiel van pupal hersenen bij 46h APF. GFP-positieve cellen zijn lineage tracing klonen die de G1-S toezichthouders Cyclin D en E2F die rust verstoren en leiden tot de S-fase ingang, aangegeven met de rode pijl en bevestigd door S-fase-labeling met incorporatie van Edu (figuur 3D inzet). Dit in tegenstelling tot de niet-GFP negatieve cellen, die in dit stadium gewoonlijk gearresteerd in G1 (zwart spoor, figuur 3D).
De meeste celcyclus profielen worden gebruikt om informatie over procenten van een populatie in verschillende fasen van de celcyclus te verkrijgen. Dit kan in de Attune software worden benaderd door het creëren van door de gebruiker gedefinieerde gebieden op de histogrammen afbakening G1, S en G2-fase (<strong> Figuur 3E). De Attune software genereert automatisch een tabel met statistieken voor elke run, waardoor de absolute tellingen van cellen in de gebruiker gedefinieerde gebieden en percentages (figuur 3F). Deze methode werkt goed bij vergelijking van relatieve veranderingen in fase verdeling tussen controle en experimentele populatie. Alternatief kan modeling software worden gebruikt om percentages schatten in elke fase en apoptotische cellen. We gebruikten ModFitLT (Verity Software House) in figuur 3G, die direct het. Fcs data bestanden die door de Attune software kan openen.
Figuur 1. Dissectie en enscenering van larvale en popstadium weefsels. A. Ontleding van larven (van genotype w 1118 getoond) bij 110hr ontwikkeling met het voorste derde vóór (boven) en na (onder) inversie. White pijlpunt geeft een vleugel aan de larvale cuticula en een rode pijlpunt geeft de positie van de hersenen B. Wings (witte pijl, note vleugel aan linker is bevestigd aan een been disc wordt vleugel rechts gescheurd de dorsale notum), ogen (geel) en de hersenen (rood) van de larven verwijderd. C. Dissectie van pop van de posities van de sneden met een tang geplaatst op het luchtruim juist voor de kop (rode stippellijnen) D. Pupa verwijderd uit cuticula vóór het wassen te verwijderen vet en darmen . E. Schoongemaakt pop toont proces van opheffing van vleugels voor verwijdering F. schoongemaakt pop met vleugels (gestippeld) en gedeeltelijk verwijderd eye-brain complex (rood en geel pijlpunten). G. Ontleed larvale vleugels en ogen tonen pipet voor overdracht. H. Ontlede post-mitotische pupal eye-brain complex. I. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Vertegenwoordiger celcyclus analyse van weefsels die GFP behulp Vybrant DyeCycle Violet en de Attune. Een representatieve werkruimte, met daarin 4 puntdiagrammen en 2 histogrammen wordt getoond voor een larvale vleugel steekproef die GFP en cycline D in het achterste vleugel, aangedreven door een uitschulpened-Gal4 transgen. A. Dot perceel van celgrootte met Gate 1 tot puin en bosjes sluiten. B. Dot complot om singlets discrimineren met Gate 2 tot ongekleurde cellen, sub-G1 DNA-gehalte (apoptose), en bosjes sluiten. C. dot plot van GFP vs DNA inhoud. GFP negatieve (Gate 3) en positieve (Gate 4) cellen kunnen onderscheiden en 2N zijn en 4N DNA-inhoud is duidelijk gebaseerd op de positie langs D. Dot perceel van celgrootte x-as. Zoals gemeten door GFP versus voorwaartse verstrooiing (FSC) Gates 5 en 6 te genereren. Merk op dat de cellen binnen Gate1 zijn rood gekleurd voor visuele hulp bij het bepalen van Gates 5 en 6 van dit scatterplot. E. Histogram van DNA-gehalte vs telt voor GFP of RFP negatief (bevolking ingesteld op Gate 3). F. Histogram van DNA-gehalte vs telt voor GFP of RFP positieve (bevolking ingesteld op Gate 4). Histogrammen kan ook opgenomen worden voor celgrootte indien gewenst. Voor celgrootte histogrammen, bevolkingen schouderd worden ingesteld op Gates 5 en 6. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Vertegenwoordiger histogrammen van celcyclus en celgrootte-analyse voor verschillende ontwikkelingsstadia en weefsels. (A) Representatieve histogramgegevens wordt getoond voor het vergelijken van de celcyclus in specifieke celtypen met RFP expressie met DyeCycle Violet (inzet shows spreidingsdiagram van RFP fluorescentie versus DNA-inhoud ). Dit voorbeeld bevat larvale vleugels uitdrukken RFP in het achterste, aangedreven door een engrailed-Gal4 transgen. (B) Overlays van GFP positieve versus GFP-negatieve DNA-gehalte histogrammen in larvale ogen met GFP expressie gedreven door de GMR-gal4 promoter 17, met meest GFP positieve cellen in G1. (C) Kleinere relatieve celgrootte van GMR driven GFP + cellen vergeleken met GFP-controles, zoals gemeten door voorwaartse verstrooiing met poorten 5 en 6. (D) In het popstadium hersenen, GFP positieve cellen geven warmte-shock geïnduceerde lineage tracing klonen via flp-out methode 5 geïnduceerd tijdens de 2 e larvale instar, over-uiting van de G1-S celcyclus regulatoren Cyclin D en E2F, waardoor afwijkende S-fase-ingang (rode pijl) in de normaal postmitotische G1 gearresteerd weefsel. De afwijkende S-fase ingang waargenomen door flowcytometrie werd bevestigd door incorporatie van Edu, welke cellen labelt in S-fase (inzet). (E) Voorbeeld van de regio's gebruikt om het relatieve percentages in G1, S en G2 fasen te schatten. Grenzen werden geschat op basis van de S-fase incorporatie van Edu in Drosophila cellen in een afzonderlijk experiment. (F) Voorbeeld van een tabel met statistieken gegenereerd door Attune software toont relatieve percentages in de gedefinieerde gebieden. (G) Voorbeeld van celcyclus modellering van representatieve Attune gegevens met behulp ModFitLT. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol maakt voor de analyse van celcyclus, relatieve celgrootte en relatieve aantal cellen in levende Drosophila weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia. Bij deze analyse wordt gekoppeld aan cel-type-specifieke fluorescente eiwit expressie of lineage tracing, kan gedetailleerde informatie worden verkregen over cellulaire reacties op discrete celcyclus of groei van verstoringen. Als proof of principle, we verstoorde rust in het popstadium fly hersenen met het uitspreken van G1-S celcyclus regulatoren in GFP-gelabelde cel klonen, die leiden tot afwijkende DNA-replicatie in een ontwikkelingsstadium wanneer hersencellen zijn doorgaans meer dan 90% G1 gearresteerd (Figuur 3D) .
Er zijn echter enkele belangrijke beperkingen aan deze levende celcyclusanalyse methode. Ten eerste kan men onderscheid maken tussen cellen in de verschillende fasen van mitose via het protocol beschreven. Daarom moet de hier beschreven analyse aangevuld met immunofluorescence kleuring voor mitotische marker, zoals SER10-gefosforyleerd histon H3 18 om mitotische index kwantificeren in de weefsels van belang. Naast de hier beschreven methode kan geen onderscheid maken tussen cellen in G1 versus een G0 arrestatie, aangezien beide landen hebben hetzelfde DNA inhoud. Aangezien DyeCycle Violet wordt opgenomen door levende cellen, identificatie van apoptotische cellen in latere stadia wordt beperkt. Tot slot is het belangrijk op te merken dat de metingen van celgrootte op basis van voorwaartse verstrooiing zijn relatieve cel grootte metingen in plaats van absolute kwantificering van de omvang. Voor absolute kwantificering van celgrootte adviseren wij een volumetrische benadering, zoals die gebruikt worden in een Coulter Counter (Beckman Coulter).
Wanneer celcyclus fase en groottedata is gekoppeld lineage tracing cel-verdubbelingstijd, gedetailleerde informatie over de celcyclus en meet groei kan worden berekend, zoals de lengte van de G1, S en G2 fasen en celgroei 9,11 in vivo kan geven gedetailleerde informatie over de celcyclus en groei regelgeving voor kwantitatieve celcyclus, celgroei en weefsel morfogenese modelleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Aida de la Cruz voor het ontwikkelen en onderwijzen van het oorspronkelijke protocol waarop deze versie is gebaseerd 10. Werk in de Buttitta Lab wordt ondersteund door NIH subsidie GM086517.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
||||||||||||||||||
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
