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Biology

Live Cell Cycle Analysis von doi: 10.3791/50239 Published: May 19, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Ein Protokoll für die Zellzyklus-Analyse lebender

Abstract

Durchflusszytometrie wurde in großem Umfang verwendet, um Informationen über DNA-Gehalt in einer Population von Zellen zu erhalten, um die relative Prozentsätze in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu schließen. Diese Technik wurde erfolgreich in den mitotischen Gewebe des Modellorganismus Drosophila melanogaster für genetische Studien von Zellzyklus-Regulation in vivo erweitert. Wenn mit Zelltyp-spezifische fluoreszierende Protein Expression und genetische Manipulationen gekoppelt, kann man detaillierte Informationen über Auswirkungen auf die Zellzahl, Zellgröße und Zellzyklus Phasing in vivo. Doch diese lebenden Zellen-Methode wurde für die Verwendung der Zellen durchlässig Hoechst 33342 DNA-interkalierenden Farbstoffes verlassen, Begrenzen Benutzer Durchflusszytometer mit einem UV-Laser ausgestattet. Wir haben dieses Protokoll geändert werden, um eine neuere lebenden Zellen DNA-Farbstoff, Vybrant DyeCycle Violet, kompatibel mit den häufigeren violett 405nm Laser verwenden. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht eine effiziente Zellzyklusanalyse mit Zelle gekoppeltTyps, der relativen Zellgröße und Zellzahl Informationen in einer Vielzahl von Drosophila Gewebe. Dieses Protokoll verlängert die Nutzungsdauer Zellzyklusanalyse Technik für Live Drosophila Gewebe auf einen kleinen Tisch-Analysator, der Attune akustischen Fokussiervorrichtung Zytometer, die ausgeführt werden und kann auf einem einzelnen-Labormaßstab gehalten werden.

Introduction

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Durchflusszytometrie können für Messungen der Lebensfähigkeit der Zellen, bezogen Zellgröße, DNA-Gehalt und fluoreszierende Protein-Expression in lebenden Zellpopulationen verwendet werden. Durch die Replikation von Kern-DNA während der S-Phase, über DNA-Gehalt in einer Population von Zellen, die den relativen Prozentsätze der verschiedenen Phasen des Zellzyklus 1-3 abzuleiten. Diese Methode hat sich zu einem Eckpfeiler der Zellzyklus-Analyse in Modellsystemen von Hefe bis zu den Säugetieren.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat sich ein hervorragendes Modell für genetische Analysen in vivo Regulation des Zellzyklus. Die umfangreiche genetische Werkzeuge zur Verfügung, in den Fliegen ermöglichen elegant gewebespezifische und zeitlich geregelt Manipulationen Zellzyklusregulatoren zusammen mit in vivo Fluoreszenz-Protein-basierten Linie Tracing 4-6. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um DNA-Gehalt in einer Reihe von Drosophila Zelltypen zu untersuchen, einschließlich endoreplicating Zellen und kultivierten Mitosezellen 7,8. Ein wichtiger Fortschritt in vivo Zellzyklusstudien wurde von de la Cruz und Edgar, mit der Entwicklung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse lebender diploiden Drosophila Imaginalscheiben 9,10, ein Protokoll, das verwendet wurde, und von vielen Labors geeignet. Diese Technik, wenn sie mit in vivo genetische Abstammung gekoppelt Tracing über induzierbare fluoreszierende Protein Expression und Gewebe spezifische Etikettierung, ermöglicht es, Informationen über Genmanipulation Auswirkungen auf die allgemeine Zellverdopplungszeit, Zellgröße zu erhalten und präzises Timing von Zellzyklus-Phasen bestimmen in vivo 9 , 11. Allerdings ist diese Methode bisher auf die Verwendung der Zellen durchlässig Hoechst 33342 DNA-interkalierenden Farbstoffs zu färben und zu quantifizieren, DNA in lebenden Zellen, die begrenzt Benutzer Zytometer mit einem UV-Laser, der Anregung der Hoechst Farbstoff fließen gestützt hat. Diese werden in der Regel nur in Sorter (dh BD FACS Vanta gefundenge, BD FACSAria) oder teure multicolor benchtop Systemen (zB BD LSR), in der Regel erfordern die Unterstützung durch institutionelle Flow Core Facilities.

Wir haben die Hoechst-basiertes Protokoll modifiziert, um eine neue Live-Zell-DNA-Farbstoff von Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet verwenden. Dieser Farbstoff ist kompatibel mit einem violetten 405 nm Laser, häufiger in kleineren Tisch-Analysatoren und in der kleinen Selbstversorger-Tisch-Analysator, der Attune Acoustic Fokussierung Cytometer. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Protokoll für Zellzyklus-Analyse, mit Zelltyp Zellgröße, Zahl und Abstammung Analyse in einer Vielzahl von Geweben Drosophila während der verschiedenen Phasen der Entwicklung mit DyeCycle Violet und die Attune gekoppelt werden kann. Dieses Protokoll erweitert die Anzahl der Zytometern geeignet für eine solche Analyse mit Drosophila Gewebe und gibt Beispiele, wie diese Art von Live-Zellzyklus-Analyse kann für weitere Gewebetypen und Entwicklungsstadien geändert werden.

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Protocol

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1. Fly Tierhaltung

  1. Kreuz fliegt der gewünschten Genotypen in schmalen Plastikröhrchen mit 10 ml Hefe-Glucose Medium 3 oder anderen eiweißreichen Medien Ihrer Wahl. Die umfangreichen Drosophila transgenen Tools für gewebespezifische Expression und Abstammung Tracing mit in vivo Fluoreszenz-Protein-Expression sind an anderer Stelle ausführlich beschrieben 4,5. Übertragen Eltern an die frische Fläschchen täglich Serie von 24 hr Nachkommen Sammlungen zu erhalten, oder für genauere Inszenierung, sammeln Embryonen auf Agar-Platten übertragen und frisch geschlüpfte Larve Fläschchen wie beschrieben 10. Um einheitliche Bedingungen für Experimente zu gewährleisten und vermeiden Überbelegung, sollte die Gesamtzahl der F1-Nachkommen in einem einzigen Fläschchen nicht mehr als 100 sein. Je nach dem genetischen Aufbau des Experiments halten Fläschchen in einem geeigneten Inkubator bis die gewünschte Entwicklungsstadium.
  2. Sammle Versuchstiere: Sie reifen Larven im 3. Larvenstadium müssenLarvenstadium (L3) bei etwa 110-120 Stunden der Entwicklung für Larven Dissektionen oder weiß Vorpuppe (WPP) für eine genaue pupal Inszenierung. Dramatische Zellzyklus Änderungen, einschließlich eines Schalters zu einem nicht-proliferativen Zustand treten an verschiedenen Zeitpunkten während der Metamorphose 12,13. Daher richtige Inszenierung Puppe (innerhalb 1 Stunde der Entwicklung) ist wichtig für reproduzierbare Zellzyklus Daten während der Metamorphose. WKA entspricht 0 h nach der Bildung Puppe (0 h APF), wie in 1 gezeigt,-I. Sammeln WPP in einer 35 mm Petrischale auf einem gefalteten Kimwipe nass mit 2,5 ml Wasser, etwas Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Alter Puppe, bis die gewünschte Stufe (Stunden APF) bei entsprechender Temperatur. Beachten Sie, dass das 1,2-fache schneller Entwicklung bei 29 ° C abläuft und 2,2 mal langsamer bei 18 ° C als bei der Standard-25 ° C 14.
  3. Hitze-Schock-Tiere Hitzeschock-flipase (hs-FLP)-induzierte Rekombination zur Abstammungslinie-Tracing-Klone bei Bedarf 9,11 aktivieren. Für die Wärme-Schock der Larve, tauchenRöhrchen in ein Wasserbad (eingestellt auf 37 ° C) und ermöglicht Larven vollständig untergetaucht. Für die Wärme-Schock der Puppe, Siegel der Petrischale mit Parafilm und voll eintauchen in das Wasserbad. Achten Sie darauf, Parafilm nach der Hitze-Schock zu entfernen, um genügend Sauerstoff Austausch für das Überleben der Tiere zu ermöglichen. Dauer des Hitzeschock-je nach Leistung des flipase Transgen verwendet und die Anzahl der Klone Wunsch. Wir verwenden routinemäßig 7-8 min zur Induktion "flipout" Linie Tracing Klone 15 in Larven mit dem hs-FLP Transgen auf dem ersten Chromosom und 2-4 min für Hitzeschock von Puppen in 35 mm Gerichte, während der hs-FLP Transgens auf das zweite Chromosom erfordert eine 20 min. Hitzeschock ähnliche Zahlen der Klone zu erhalten.

Die Rate der Zellteilung und der Zeitpunkt der Präparation bestimmt Klongröße in jedem Gewebe. Unter normalen Bedingungen, so finden wir, dass die Klone in der Larven-Flügel mit einem 20 min Hitzeschock (mit dem hs-FLP Transgen auf dem zweiten Chromosom) und induziert dissected 48 Stunden später, enthalten etwa 20-30 gut getrennt Klone mit Größen von 10 Zellen pro Klon zu zwei Zellen pro Klon, mit einem Durchschnitt rund vier Zellen pro Klon. Im Gegensatz dazu seziert ein 7 min Hitze-Schock mit der gleichen hs-FLP Transgen Puppen in einer Petrischale bei 0 hr APF 36 Stunden später, Renditen gut getrennt Klone (ca. 15-25) von einem bis zu vier Zellen mit einer durchschnittlichen von 2,2 Zellen pro Klon. Diese Daten können verwendet werden, um die durchschnittliche Zellverdopplungszeit für das Gewebe in Untersuchung zu bestimmen.

2. Dissection

  1. Sanft übertragen die Larven / Puppen auf ein Klarglas Dissektion Schale mit 1X PBS.
  2. Mit einem Binokular und viel Licht, sanft erfassen eine Larve durch den Bauch mit einem scharfen Inox # 5 forcep, schneiden Sie die vordere Drittel mit Mikro-Schere, und invertieren die vorderen Drittel, indem Sie die Mund-Bereich nach innen in Richtung der hinteren, während die Larven Nagelhaut konstant (Abbildung 1A). Entfernen Sie vorsichtig opaque fetten Körper und der verbleibende Darm, um die Sichtbarkeit der gewünschten Geweben, wie Flügel, Augen oder Gehirn zu erhöhen. Präparieren Sie die gewünschten Gewebe; sauber entfernen Flügel von Luftröhre und Nagelhaut mit einer Pinzette, die Augen von Mund-Haken, oder das Gehirn von den Augen (1G).
  3. Für Sezieren Puppe, verwenden Sie einen forcep sanft erfassen eine Puppe von der vorderen Spitze des pupal Fall, wo es eine Luftblase, um eine Beschädigung der Puppe innen (Abbildung 1C). Zange oder Mikro-Schere in der gegnerischen Hand kann verwendet werden, um die Position schwimmende Puppe für die richtige Greifen werden. Sauber durch die hintere Spitze der Puppe mit Mikro-Schere geschnitten. Dieser Querschnitt Schnitt sollte in einem leichten Winkel in Richtung der dorsalen Teil des Tieres getroffen werden, um den inneren Druck, ohne dass der histolyzed Fett in die gewünschten Gewebe in der Brust und den Kopf frei. Schneiden Sie vorsichtig entlang der dorsalen Median, die Vermeidung der Flügel und das vordere Auge-Gehirn-Komplex. Entfernen Sie vorsichtig die Puppe aus der PuppenFall durch das Greifen der hinteren Kante des pupal Epidermis und Herausziehen des Puppenhülle (1D). Stoßen Sie ein kleines Loch in der Kutikula anterior der Auge-Gehirn-Komplex mit einer Pinzette. Mit einem Glas Pasteurpipette mit einem Gummiball, vorsichtig waschen PBS Dissektion Lösung durch die teilweise zerlegt Puppe zu histolyzed Fett und alle verbleibenden Darmgewebe zu entfernen. Diese auch wirksam zur Schmierung der Glaspipette mit Lipiden und Proteinen, die das Auftreten von Gewebe seziert reduziert Kleben an der Einrichtung der Glaspipette später.
  4. Um pupal Flügel erhalten, Kuvertierung die Kutikula der Flügel und die Flügel selbst muss aus der Puppe (1E) aufgebrochen werden. Dies kann durch Halten der Puppe, die von der Kopf mit einer Zange, während mit einem anderen forcep entweder greifen die meisten hinteren Spitze des Flügels Kutikula und Herausziehen oder Rangieren des forcep unter dem Flügel der Nähe des Scharniers vor verdrängen es von der Seite erfolgen die Karkasse (Fild 1E). Die Flügel können dann geschnitten oder gerissen am Scharnier, um es von dem Körper zu entfernen und in einem Stapel von den Tierkörpern und anderen Materialien.
  5. Um pupal Augen oder Gehirn zu erhalten, waschen Sie die Puppe bis zum Auge-Gehirn-Komplex verdrängt wird und frei von der Puppe (1F, 1H). Mit einer Zange, ziehen Sie den pupal Auge vom Gehirn und speichern Sie das gewünschte Gewebe.
  6. Nicht länger als 45 Minuten, um jede Probe sezieren, wie Ergebnisse wird weniger genau, je länger die Zellen in PBS nach dem Öffnen die Tiere verlassen.

3. Gewebedissoziation und DNA-Färbung

  1. Mit einem geschmierten Pasteur Pipette vorsichtig seziert die Gewebe in 0,5 ml der Live-DNA Stain-Lösung in einem 5 ml Polystyrol Rohr (1G). Transfer so wenig wie möglich PBS (weniger als 300 ul) in die DNA Stain Solution wird als Verdünnung von Trypsin hemmen Gewebedissoziation.
  2. Die Röhrchen mit shaking bei 23 ° C bei 500 rpm (wir verwenden einen Eppendorf Thermomixer).
  3. Inkubieren für 70 min, dann vortexen für 5 sec bei einer mittleren Geschwindigkeit (Einstellung 5). Übermäßige Verwirbelung bewirkt Zellaufschluss und Form Schutt, während unter-Vortex zu Zellklumpen führen wird. Bringen Sie die Proben Schütteln bei 23 ° C bei 500 rpm für weitere 15 bis 20 Minuten vor dem Vortexen sie noch einmal für 5 Sekunden bei einer Geschwindigkeit 5.
  4. Für Gehirn und Augen pupal älter als 36hAPF wird ein modifiziertes Protokoll erforderlich. Dissociate Gewebe in DNA Stain-Lösung bei 23 ° C bei 500 rpm für 45-60 min in 1,7 ml Reaktionsgefäße. Dann one-by-one manuell distanzieren große Teile des Gewebes durch die Übertragung zu sezieren Gericht zusammen mit etwa 50 ul DNA Stain Solution und schnellen Auf-und Abpipettieren mit einer manuell gezeichnet Pasteurpipette 16 (von etwa 100-150 um Öffnung). Übertragen Sie jede dissoziierten Probe mit dem Rest der 0,5 ml DNA Stain-Lösung in ein 5-ml-Tube. Inkubieren eine zusätzliche 45-30 Min (bis zu 90 min der gesamten Inkubationszeit) bei 23 ° C unter Schütteln bei 500 rpm bis Klumpen sind nicht mehr sichtbar.
  5. Völlig losgelöst Proben sollten nur sehr wenige große Brocken von Gewebe sichtbar, obwohl beachten Sie, dass die acellular transparent pupal Flügel Nagelhaut nicht distanzieren wird.

4. Durchflusszytometrie

  1. Schalten Sie den Attune cytometer und öffnen Sie die Attune Software. Die cytometer Laser sollte über das Start-Menü eingeschaltet werden, und eine tägliche Performance-Test sollte mit Performance-Tracking Beads mit ausreichender Partituren vor jedem Tag der Datenerfassung durchgeführt werden. Flüssigkeitsstände sollte mindestens halb voll und Abfall vor dem Leistungstest entleert. Details zum Start, die ordnungsgemäße Kalibrierung und Betrieb des Attune können im Attune Handbuch (gefunden werden http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
  2. Entwerfen Sie ein neues template indem 4 Dot-Plots und 2 Histogramme in einem leeren Arbeitsbereich mit den angegebenen Parametern in 4.3, oder wählen Sie eine bereits gestaltete Vorlage für das Experiment geeigneten und geben die Anzahl der Proben gesammelt werden. Wir haben Attune Vorlagen (Dateien in. Bekommen Format) für Live-Drosophila Zellzyklusanalyse versehen mit Vybrant DyeCycle Violet und GFP oder RFP Expression in Anhang I.
  3. Die Vorlagen bereitgestellt werden, umfassen vier Punktplots und zwei Histogramme mit den Parametern in Abbildung 2 angegeben. Kanäle zur Erfassung gehören: FSC und SSC - Vorwärtsstreulicht und Seitwärtsstreuung anzeigt Zellgröße und Membran Komplexität VL1 Höhe (H), Breite (B) und die Fläche (A) - was Violet Laser-Anregung von DyeCycle Violet Färbung der DNA, und BL1 -A - Blau Laser Kanal 1 Area, der angibt, GFP-Fluoreszenz. Die mitgelieferte Schablone für RFP-Analyse ist identisch mit der Vorlage für die GFP-Analyse, außer dass es die Blaue Laser Kanal 3 (BL3-A), die Optimierung ist verwendetzed für RFP-Erkennung.
  4. Die Dot-Plots in den Templates haben Tore zu Analyse, um den gewünschten Populationen zu beschränken und Schutt und Zellklumpen aus der Analyse (Abbildung 2) zu begrenzen. Gate 1 schließt Schmutz und Klumpen auf SSC gegen FSC (2A) basiert. Gate 2 schließt ungefärbte Zellen, sub G1 apoptotischen Zellen und Zellklumpen nach der Identifizierung von Singuletts (VL1Area vs VL1Width) (2B) basiert. Gate 3 ist eine abgeleitete Tor, umfassend Zellen innerhalb Toren 1 und 2, und identifiziert GFP (oder RFP) negative Zellen gegen DNA-Gehalt auf VL1Height (Abbildung 2C) basiert. Gate 4 ist eine abgeleitete Tor, umfassend Zellen innerhalb Toren 1 und 2, und identifiziert GFP (oder RFP) positive Zellen gegen DNA-Gehalt (Abbildung 2C). Dot Plots der Größe der einzelnen Zellen durch GFP (oder RFP) vs forward scatter (FSC) gemessen werden verwendet, um Tore 5 und 6 (2D) zu erzeugen. Die beiden Histogramme Grundstück DNA-Gehalt auf der X-Achse und Zellzahl auf dem Y-axis für die Bevölkerung durch Tor 3 und Tor 4 definiert. (2E und 2F) Histogramme können auch für Zellgröße einbezogen werden, wenn gewünscht wird (nicht dargestellt). Für Zellgröße Histogramme sollte Populationen Gatter 5 und 6 eingestellt werden, Plotten FSC auf der X-Achse und setzt auf die y-Achse.
  5. Set Aufnahme bei 10.000 GFP oder RFP positive Ereignisse (dies wird Gate 4, das abgeleitete Gate of Gate 1, Tor 2 und der GFP oder RFP positive Gate sein) zu stoppen. Messbereiche von 6.000 - 10.000 GFP positive Ereignisse haben traditionell das Ziel für die Veröffentlichung Qualitätsprofile 9,11. Wir schlagen vor, mit einem Minimum von 15 Flügel oder Augen, dass ca. 50% GFP positiv sind, um eine ausreichende Gate 4 Veranstaltungen 10 für hochwertige Profile erhalten. Allerdings haben wir erfolgreich klare Daten nur für vorläufige Zellzyklusanalyse aus nur 6 Flügel (3A) erhalten. Stellen Sie die Lautstärke für Erwerb 300 ul, wird dies etwa 460 ul der insgesamt 0,5 ml Probe zu verwenden. Tabelle 2 zeigt die entsprechenden Schwellen-und Spannungs-Einstellungen in der Vorlage für das Beispiel in Abbildung 2 vorgesehen.
  6. Führen Proben bei Standard-Empfindlichkeit oder hohe Empfindlichkeit 100 ul / min und aufzeichnen. Wir finden wenig bis gar keinen Unterschied in unsere Analyse mit den verschiedenen Empfindlichkeitsstufen. Durch die akustische Fokussierung der Zellen, kann dies cytometer genau messen Proben bei sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Zytometern, finden wir keinen Kompromiss Daten durch den Erwerb einer Geschwindigkeit von bis zu 1.500 Ereignisse pro Sekunde. Die aufgezeichneten Daten Dateien von der Software generiert Attune sind. FCS-Format, das kompatibel mit den meisten Zellzyklus-Modellierungs-Software ist.

5. Data Analysis

  1. Histogramme von Zellgröße und DNA-Gehalt für GFP (oder RFP) positive und negative Population verglichen werden kann. Sie können manuell durch Kopieren und Einfügen mit Hilfe von Adobe Photoshop-Software geschichtet werden. Wenn die y-Achse auf automatisch gesetzt ist, wird der Y-Achse mit der h skalierenighest Zählung für jede Probe. Überlagern von zwei Graphen mit der Y-Achse eingestellt, um autoscale erzeugt eine Überlagerung der Histogramme mit den Achsen für das globale Maximum für jede Population eingestellt. Dies ermöglicht eine einfache visuelle Vergleich der relativen Veränderungen in Zellzyklus Ausstieg, auch wenn insgesamt Zellzahlen von GFP positiven und negativen GFP Populationen nicht gleichwertig sind (Beispiel in Abbildung 3B). Alternativ kann eine individuelle y-Achse (y-Achse manuell Option) auf einen festen Wert für den Histogrammen eingestellt werden. In diesem Fall werden die relativen Zellzahlen zwei Populationen verglichen werden können. Da die Attune verwendet ein definiertes Volumen der Probe pro Lauf, absolute Quantifizierung von Zellen für jeden Lauf, in jedem Tor mit Prozentsätzen der gesamten Bevölkerung, aus der Statistik-Tabelle automatisch generiert während der Fahrt in den Arbeitsbereich (zB in 3F erhalten ). Dot Plots und Histogramme können auch einfach in der Software Attune geschichtet werden, durch einfaches Drag & Drop verschiedene Proben von the Probe Datei-Menü auf der rechten Seite auf den gewünschten Graphen einer offenen Probe zum Vergleich. Doch um Subpopulationen aus einer einzigen Probe (dh GFP positiven und negativen GFP innerhalb der gleichen Probe) überlagern, verwenden wir Photoshop.
  2. Zwei Methoden können zur relativen Prozentsätze der verschiedenen Phasen des Zellzyklus für eine Bevölkerung zu finden. Die Annäherung Verfahren beruht auf Benutzer definierte Bereiche, Grenzen der G1, S, G2 und> G2 Gipfel abzugrenzen. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle und einfache Schätzungen der Werte innerhalb der benutzerdefinierten Regionen (3E). Wir setzen unseren Regionen basierend auf einer direkten Test mit Drosophila Kc Zellen, zum S-Phase markiert mit Ethynyl-desoxyuridin (EdU) Einarbeitung. Das zweite Verfahren verwendet Dritten Modellierungs-Software für die Abschätzung der Zellzyklus-Verteilung. Wir verwendeten ModFitLT (Verity Software House)-Software zum Beispiel in 3F.

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Representative Results

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Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse für ein Larven Flügel Probe, die GFP in der hinteren Hälfte des Gewebes mit dem mitgelieferten GFP-Vorlage. Ähnliche Ergebnisse werden mit der gleichen Gewebetyp und Expressionsmuster für RFP RFP mit dem mitgelieferten Schablone (3A) erhalten. Die zur Verfügung gestellten Vorlagen und Spannungen (Tabelle 2) sind geeignet für die Analyse von Larven Augen (3B), Gehirn und Flügel, sowie Puppen Augen, Gehirn (3D) und Flügel. Histogramme der relativen Größe der Zellen durch Auftragen FSC für die Bevölkerung in Tore 5 und 6 kann auch generiert werden (Abbildung 3C) werden. Gates eventuell leicht aufgrund von Unterschieden in der Zellgröße für unterschiedliche Gewebe oder Unterschiede in der Fluoreszenzintensität für verschiedene GFP oder RFP Transgene eingestellt werden. Dies kann während der Ausführung einen kleinen Test Volumen der Probe (50-100 ul) werden, bevor er Rekord.

Allowing die y-Achse (Counts) für den Zellzyklus oder Zellgröße Histogramme, um die automatische Waage (y-Achsen-Skala auf automatisch gesetzt) ​​in der Attune Software führt Histogramme das globale Maximum für jede Population. 3B bis 3D zeigt Repräsentative Ergebnisse mit GFP positiven und negativen GFP Histogramme mit y-Achse auf dem globalen Maximum für jede Population eingestellt. Festlegen eines bestimmten y-Achse maximal (y-Achse lassen sich manuell mit einem vom Benutzer definierten Wert gesetzt), ermöglicht einen Vergleich der absoluten Zahlen zwischen den Populationen, die nützlich sein können für den Vergleich von Proliferation, aber macht es schwierig, Zellzyklus Phasing in Vergleichen Populationen, wenn Zahlen von GFP-positiven Zellen vs GFP-negativen Zellen stark unterschiedlich sind.

3B zeigt Zellzyklus-Profile für GFP positiven und negativen Zellen in Larven Augen, die GFP in den hinteren mit den GMR-Gal4, UAS-GFP Transgene. Das Overlay zeigt die Unterschiede in den Zellzyklus pHäsing der hinteren GFP exprimierenden Zellen. 3C zeigt die relative Änderung der Zellgröße zwischen GFP positiven und negativen Zellen in B, die durch Auftragen Zellgröße durch FSC gemessen. 3D zeigt einen Zellzyklus-Profil von pupal Gehirne bei 46h APF. GFP positive Zellen sind Abstammungslinie Tracing Klone, die G1-S Regulatoren Cyclin D und E2F, die Ruhe zu stören und dazu führen, dass die S-Phase Eintrag, angedeutet durch den roten Pfeil und bestätigt durch die S-Phase Kennzeichnung mit dem Einbau von Edu (Abbildung 3D Einschub). Dies steht im Gegensatz zu den nicht-GFP-negativen Zellen, die in diesem Stadium in der Regel in G1 (schwarze Kurve, Figur 3d) verhaftet.

Die meisten Zellzyklus-Profile werden verwendet, um Informationen über die Prozentsätze der Bevölkerung in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu erhalten. Dies kann in der Attune Software durch Erstellen benutzerdefinierter Regionen auf der Histogramme Abgrenzung G1, S und G2-Phase (<angenähert werdenstrong> 3E). Die Attune Software generiert automatisch eine Statistik-Tabelle für jeden Lauf, so dass die absolute Zählungen von Zellen innerhalb der Benutzer definierte Bereiche und Prozentangaben (3F). Diese Methode funktioniert gut bei einem Vergleich relativen Veränderungen in der Phase Verteilung zwischen einer Steuerung und experimentellen Bevölkerung. Alternativ kann Modellierung Software zur Prozentangaben in jeder Phase sowie apoptotischen Zellen abzuschätzen. Wir verwendeten ModFitLT (Verity Software House) in Abbildung 3G, die direkt öffnen kann, die. Fcs Dateien, die vom Attune Software generiert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Dissection und Inszenierung von Larven und Puppen Gewebe. A. Präparation der Larven (von Genotyp w 1118 gezeigt) bei 110hr der Entwicklung, die die vordere Drittel vor (oben) und nach (unten) Inversion. Weiß Pfeilspitze zeigt einen Flügel, der an der Larvencuticula und einem roten Pfeilspitze gibt die Position des Gehirns B. Flügel (weiße Pfeilspitze; beachten Flügel links ist an einem Bein Scheibe befestigt ist, im rechten Flügel an der dorsalen notum gerissen), Augen (gelb) und Gehirn (rot) von der Larven entfernt. C. Präparation der Puppe, welche die Positionen der Schnitte mit einer Pinzette an der vorderen Luftraum auf den Kopf (rot gestrichelte Linien) D. Pupa von Nagelhaut vor dem Waschen zu entfernen entfernt platziert Fett und gut . E. Gereinigt Puppe zeigt Prozess der Aufhebung Flügel zur Entfernung F. Gereinigt Puppe zeigt Flügel (punktiert) und teilweise entfernt Auge-Gehirn-Komplex (rote und gelbe Pfeile). G. Dissected Larven Flügel und Augen zeigt Pipette für die Übertragung. H. Dissected postmitotischen pupal Auge-Gehirn-Komplex. I. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative Zellzyklus Analyse von Geweben, die GFP mit Vybrant DyeCycle Violet und die Attune. Ein Vertreter Arbeitsbereich, mit 4-Dot-Plots und 2 Histogramme für ein Larven Flügel Probe, die GFP und Cyclin D in der hinteren Flügel gezeigt, angetrieben von einer engrailed-Gal4 Transgen. A. Dot Grundstück von Zellgröße mit Gate 1 ausschließen Schutt und Klumpen. B. Dot Plot Singuletts mit Gate 2 zu diskriminieren ungefärbte Zellen, sub-G1-DNA-Gehalt (Apoptose) und Klumpen auszuschließen. C. Dot Grundstück von GFP vs DNA-Gehalt. GFP negativ (Gate 3) und positive (Tor 4) Zellen unterschieden werden und 2N und 4N DNA-Gehalt ist offensichtlich, basierend auf Position entlang der x-Achse. D. Dot Plot der Größe der einzelnen Zellen durch GFP vs forward scatter (FSC) gemessen Gates 5 und 6 zu erzeugen. Beachten Sie, dass Zellen innerhalb Gate1 rot gefärbt sind für die visuelle Unterstützung bei der Bestimmung Tore 5 und 6 für diese Punktwolke. E. Histogramm der DNA-Gehalt gegen die Zählungen für GFP oder RFP negativ (Bevölkerung auf Gate 3). F. Histogramm der DNA-Gehalt gegen die Zählungen für GFP oder RFP positive (Bevölkerung auf Gate 4). Histogramme können auch für Zellgröße aufgenommen werden, falls gewünscht. Für Zellgröße Histogramme, Schulter Populationend Gates 5 und 6 eingestellt werden. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Repräsentative Histogramme von Zellzyklus und Größe Analyse für verschiedene Entwicklungsstadien und Geweben. (A) Repräsentative Histogramm-Daten zum Vergleichen Zellzyklus in spezifischen Zelltypen mit RFP Expression mit DyeCycle Violet (Einschub zeigt Streudiagramm RFP Fluoreszenz vs DNA-Gehalt gezeigt ). Dieses Beispiel enthält Larven Flügel Ausdruck RFP in der hinteren, durch eine engrailed-Gal4 Transgen angetrieben. (B) Overlays von GFP positive vs GFP negativen DNA-Gehalt Histogramme in Larven Augen mit GFP-Expression durch den GMR-Gal4 pr angetriebenomoter 17, zeigt die meisten GFP positiven Zellen in G1. (C) Kleinere relativen Zellgröße von GMR angetriebenen GFP + Zellen GFP-Kontrollen verglichen, wie Vorwärtsstreulicht Verwendung Tore 5 und 6 gemessen. (D) Im Puppenstadium Gehirn, GFP positive Zellen zeigen Hitzeschock-Linie Tracing Klone über FLP-out Verfahren 5 in der 2. Larvenstadium induziert wird, Überexpression des G1-S Zellzyklusregulatoren Cyclin D und E2F, wodurch aberrante S-Phasen-Eintrag (rot Pfeilspitze) in der normalerweise postmitotischen G1 verhaftet Gewebe. Die abnorme S-Phase Eintrag mittels Durchflusszytometrie beobachtet wurde durch den Einbau von EDU, welche Zellen markiert in S-Phase (Einschub) bestätigt. (E) Beispiel von Regionen verwendet werden, um relativ Prozentsätze in G1, S und G2 Phasen schätzen. Grenzen wurden basierend auf S-Phase Einbau EdU in Drosophila-Zellen in einem getrennten Experiment bestimmt. (F) Beispiel Statistiktabelle durch Attun erzeugte Software zeigt relativen Prozentangaben in den Regionen definiert. (G) Beispiel Zellzyklus Modellierung Vertreter Attune Daten mit ModFitLT. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

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Das hier beschriebene Protokoll erlaubt die Analyse von Zellzyklus, bezogen Zellgröße und relative Zellzahl in Live Drosophila Gewebe bei verschiedenen Entwicklungsstadien. Wenn bei dieser Analyse Zelltyp-spezifische fluoreszierende Protein-Expression oder Linie Tracing gekoppelt ist, können detaillierte Informationen über die zellulären Reaktionen auf diskrete Zellzyklus oder Störungen Wachstum erhalten werden. Als proof of principle, gestört wir Ruhe im Puppenstadium fly Gehirn durch Expression G1-S Zellzyklusregulatoren in GFP-markierten Zell-Klone, die zu abweichenden DNA-Replikation in einem Entwicklungsstadium, wenn Gehirnzellen sind normalerweise mehr als 90% G1 verhaftet (3D) .

Es gibt jedoch einige wichtige Einschränkungen zu dieser Live-Zellzyklus-Analyse-Methode. Erstens kann man nicht zwischen Zellen zu unterscheiden in den verschiedenen Phasen der Mitose unter Verwendung des hier beschriebenen Protokoll. Somit sollte die Analyse hier beschriebenen mit imm ergänztunofluorescence Färbung für eine mitotische Marker, wie Ser10-phosphoryliertes Histon H3 18 bis Mitoseindex in den Geweben von Interesse zu quantifizieren. Neben dem hier beschriebenen Verfahren kann nicht zwischen Zellen zu unterscheiden in G1 vs einem G0 Verhaftung, da beide Staaten die gleichen DNA-Gehalt haben. Seit DyeCycle Violet wird von lebenden Zellen aufgenommen Identifizierung von Zellen, in späteren Stadien apoptotischen ist ebenfalls begrenzt. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Messungen der Größe der Zellen auf Vorwärtsstreulicht basierend relativen Zellgröße Messungen anstatt absolute Quantifizierung der Größe sind. Für absolute Quantifizierung der Größe der Zellen empfehlen wir eine volumetrische Ansatz, wie sie in einem Coulter Counter (Beckman Coulter) verwendet.

Wenn Zellzyklus Phase und Größendaten mit Linie Tracing Zellverdopplungszeit, detaillierte Informationen über den Zellzyklus und messen gekoppeltes Wachstum berechnet werden, wie die Länge der G1, S und G2-Phase und Zeilwachstumsrate 9,11 in vivo kann detaillierte Informationen über Zellzyklus und Wachstum Regelung für quantitative Zellzyklus, Zellwachstum und Gewebemorphogenese Modellierung.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Aida de la Cruz für die Entwicklung und Vermittlung der Original-Protokoll, auf dem diese Version 10 basiert. Die Arbeit in der Buttitta Lab wird von NIH GM086517 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube BD Falcon 352058 5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer Life Technologies/ Applied Biosystems 4445315 Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5) Life Technologies/ Applied Biosystems Free PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) Life Technologies/ Applied Biosystems 4449754 For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15003-08 Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain Life Technologies/ Invitrogen V35003
Table 1. Required reagents and instruments.

Live DNA Stain Solution (10 ml):

1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2)
9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma)
5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)

10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2

FSC SSC BL1 VL1
Threshold (x1000) 100 10 10 10
Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150

Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain
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Flegel, K., Sun, D., Grushko, O., Ma, Y., Buttitta, L. Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain. J. Vis. Exp. (75), e50239, doi:10.3791/50239 (2013).More

Flegel, K., Sun, D., Grushko, O., Ma, Y., Buttitta, L. Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain. J. Vis. Exp. (75), e50239, doi:10.3791/50239 (2013).

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