Live cellcykelanalys av Published: May 19, 2013 doi: 10.3791/50239

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kerry Flegel*¹, Dan Sun*¹, Olga Grushko*¹, Yiqin Ma¹, Laura Buttitta¹

¹Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll för cellcykeln analys av levande

Abstract

Flödescytometri har i stor utsträckning använts för att få information om DNA-innehåll i en population av celler, för att härleda relativa procentandelar i olika cellcykelfaserna. Denna teknik har framgångsrikt utvidgats till de mitotiska vävnaderna i modellen organismen Drosophila melanogaster för genetiska studier av cellcykelreglering in vivo. När den kombineras med celltypsspecifik fluorescerande protein expression och genetiska manipulationer, kan man få detaljerad information om effekterna på antalet celler, cellstorlek och cellcykeln fasa in vivo. Men denna live-cell metoden har förlitat sig på användningen av cellpermeabla Hoechst 33342 DNA-interkalerande färg, begränsa användarna till flödescytometrar utrustade med en UV-laser. Vi har modifierat detta protokoll för att använda en nyare live-cell DNA färgämne, Vybrant DyeCycle Violet, förenlig med den vanligare violett 405nm laser. Protokollet presenteras här möjliggör effektiv cellcykelanalys tillsammans med celltyp, relativ cellstorlek och cell nummerinformation, i en mängd av Drosophila vävnader. Detta protokoll förlänger användbar cellen tekniken livscykelanalys för levande Drosophila vävnader till en liten bänk analysator, den Attune Acoustic Fokusering Cytometer, som kan köras och underhållas på ett enda laboratorieskala.

Introduction

Flödescytometri kan användas för mätning av cellviabilitet, relativ cellstorlek, DNA-innehåll och fluorescerande protein uttryck i levande cellpopulationer. På grund av replikation av kärn-DNA under S-fas, information om DNA-halten i en population av celler kan användas för att härleda relativa procentandelar i olika cellcykelfaserna ^1-3. Denna metod har blivit en hörnsten i cellcykelanalys i modellsystem från jäst till däggdjur.

Bananflugan Drosophila melanogaster har blivit ett utmärkt modellsystem för genetisk in vivo analyser av cellcykelreglering. De omfattande genetiska verktyg som finns i flugor möjliggöra elegant vävnad specifika och tidsmässigt reglerade manipulationer av regulatorer cellcykeln tillsammans med in vivo fluorescerande protein-baserade härstamning spårning ^4-6. Flödescytometri har använts för att studera DNA-halten i ett antal Drosophila celltyper, inklusive endoreplicating celler och odlade celler mitotiska ^7,8. Ett viktigt framsteg för in vivo cellcykeln studier gjordes av de la Cruz och Edgar, med utvecklingen av ett protokoll för flödescytometrianalyser av levande diploida Drosophila imaginal skivor ^9,10, ett protokoll som har använts och anpassats av många laboratorier. Denna teknik, när den kombineras med genetisk in vivo härstamning spåra via inducerbar fluorescerande protein uttryck och vävnad specifik märkning, gör att man kan få information om effekterna genmodifieringstekniker på totala cell fördubbling tid, cellstorlek och att fastställa exakta tidpunkten för cellcykelfaserna in vivo ^{9 , 11.} Men denna metod har hittills förlitat sig på användningen av cellpermeabla Hoechst 33342 DNA-interkalerande färg för att färga och kvantifiera DNA i levande celler, vilket har begränsat användare att flödescytometrar med en UV-laser med förmåga att excitera Hoechst färgämne. Dessa är i allmänhet finns endast i sorterare (dvs. BD FACS VantaGE, BD FACSAria) eller dyra multicolor bänk system (dvs. BD LSR), vanligtvis kräver stöd av institutionella anläggningar flöde kärna.

Vi har modifierat Hoechst-baserat protokoll för att använda en ny live-cell-DNA färgämne från Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Detta färgämne är kompatibel med en violett 405 nm laser, vanligare i mindre stationärmaskiner analysatorer och finns i den lilla fristående bänk analysator, den Attune Acoustic Fokusera Cytometer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för cellcykelanalys som kan kopplas med celltyp, cellstorlek, mobilnummer och härstamning analys i olika Drosophila vävnader under olika stadier av utveckling med hjälp DyeCycle Violet och Attune. Detta protokoll utökar antalet cytometrar lämpliga för sådan analys med Drosophila vävnader och ger exempel på hur denna typ av levande cellcykelanalys kan modifieras för ytterligare vävnadstyper och utvecklingsstadier.

Protocol

Ett. Fly Husbandry

1. Cross flyger av önskade genotyper i trånga plastflaskor med 10 ml jäst-glukosmedium ³ eller andra proteinrika media som du väljer. De omfattande Drosophila transgena verktyg tillgängliga för vävnad uttryck och härstamning spårning med in vivo fluorescerande protein uttryck beskrivs i detalj någon annanstans ^4,5. Överför föräldrar till friska flaskor dagligen för att få serier av 24 kollektioner hr avkomma, eller mer exakt stadieindelning, samla embryon på agarplattor och överföra nykläckta larven till flaskor som beskrivits ^10. För att säkerställa enhetliga villkor mellan experiment och undvika överbeläggning, bör det totala antalet F1 avkomma i en injektionsflaska inte vara mer än 100. Beroende på den genetiska utformningen av experimentet, hålla flaskorna i en lämplig inkubator tills den önskade utvecklingsstadiet.
2. Samla försöksdjur: du kommer att behöva mogna larver vid ^{3: e} larvstadietinstar (L3) vid ca 110-120 h om utvecklingen för larver dissektioner eller vit prepupa (WPP) för exakt PUPP iscensättning. Dramatiska cellcykelhändelser förändringar, bland annat en övergång till en icke-proliferativ tillstånd sker vid skilda tidpunkter under metamorfos ^12,13. Därför korrekt stadieindelning av puppa (inom 1 timme av utvecklingen) är avgörande för reproducerbara uppgifter cellcykeln under metamorfos. WPP motsvarar 0 h efter puppa formation (0 hr APF) såsom visas i fig 1, panel I. Samla WPP i en 35 mm petriskål på ett vikt Kimwipe våt med 2,5 ml vatten för att upprätthålla en del fukt. Ålder puppa tills önskad scen (timmar APF) vid lämplig temperatur. Observera att utvecklingen fortskrider 1,2 gånger snabbare vid 29 ° C och 2,2 gånger mer långsamt vid 18 ° C än vid standard 25 ° C ^14.
3. Värmechock djur att aktivera värmechock flipase (hs-FLP)-inducerad rekombination för härstamning-spårning kloner om det behövs ^9,11. För värmechock av larv, dopparören i ett vattenbad (inställd på 37 ° C) och säkerställa larver helt under vatten. För värmechock av puppa, försegla petriskål med Parafilm och fullständigt dränka in den i vattenbadet. Var noga med att ta bort Parafilm efter värme-chock, för att ge tillräckligt syre utbyte för djurens överlevnad. Varaktighet för den värme-chock beror på aktiviteten hos den använda flipase transgenen och antalet önskade kloner. Vi använder rutinmässigt 7-8 min för att framkalla "flipout" lineage tracing kloner ¹⁵ i larver med HS-FLP transgen den första kromosomen och 2-4 min för värmechock av puppor i 35 mm skålar, medan HS-FLP transgen på den andra kromosomen kräver en 20 min. värmechock att erhålla liknande antal kloner.

Hastigheten för celldelning och tidpunkten för dissektion avgör klonstorlek i varje vävnad. Under normala förhållanden, finner vi att de kloner som induceras i larver vingen med en 20 min värmechock (med HS-FLP transgen på den andra kromosomen) och dissecTed 48 timmar senare, innehåller cirka 20-30 väl separerade kloner med storlekar från 10 celler per klon till två celler per klon, med ett genomsnitt cirka fyra celler per klon. Däremot en 7 min värmechock med samma hs-flp transgen av puppor i en petriskål vid 0 hr APF dissekerade 36 h senare, avkastning väl separerade kloner (cirka 15 till 25) som sträcker sig från en till fyra celler med en genomsnittlig 2,2 celler per klon. Sådana data kan användas för att fastställa den genomsnittliga tid cellen fördubbling för vävnaden som studeras.

2. Dissektion

1. Försiktigt överföra larver / puppor till ett klart glas dissektion maträtt som innehåller 1X PBS.
2. Med hjälp av en dissekera mikroskop och gott om ljus, försiktigt tag en larv av buken med en skarp Inox # 5 forcep, skär den bakre tredjedelen med mikro-sax, och invertera den främre tredjedel genom att trycka inåt mun mot den bakre medan du håller larver nagelband stadig (Figur 1A). Ta försiktigt bort opaque fett kroppen och eventuellt kvarvarande tarmen för att öka synligheten av önskade vävnader såsom vinge, ögon eller hjärna. Dissekera de önskade vävnaderna, snyggt bort vingarna från luftstrupen och nagelband med pincett, ögon från munnen krokar, eller hjärnan från ögon (figur 1G).
3. För dissekera puppa, använda en tång för att försiktigt gripa en puppa av den främre spetsen av PUPP fall där det finns en luftbubbla, för att undvika skador på puppan insidan (Figur 1C). Pincett eller mikro-sax i den motsatta sidan kan användas för att hjälpa till att placera flytande puppa för korrekt greppa. Renskuren genom den bakre spetsen av puppan med mikro-sax. Detta tvärsnitt snitt bör göras i en liten vinkel mot den dorsala delen av djuret, för att frigöra den inre tryck utan att tvinga den histolyzed fettet till de önskade vävnaderna i bröstkorgen och huvudet. Skär försiktigt längs ryggens medianen, undviker vingarna och den främre öga-hjärna komplex. Ta försiktigt bort puppan från PUPPfall genom att greppa den bakre kanten av PUPP epidermis och dra ut det ur PUPP fallet (figur 1D). Gör ett litet hål i nagelband främre till öga-hjärna komplex med pincett. Använda ett glas Pasteur pipett med en gummi glödlampa, försiktigt tvätta PBS dissektion lösningen genom den delvis dissekerade puppa till avlägsna histolyzed fett och eventuellt kvarvarande tarmen vävnad. Detta också effektivt smörjer glaspipett med lipider och proteiner, vilket minskar förekomsten av dissekerade vävnader från att fastna vid det inre av glaspipett senare.
4. För att få PUPP vingar, nagelband kuvertering vingen och vingen själv måste bändas ur puppan (figur 1E). Detta kan göras genom att hålla puppan ned av huvudet med en tång när du använder en annan forcep att antingen ta tag i de bakre spetsen av vingen nagelband och dra ut eller manövrering av forcep under vingen nära gångjärnet innan lossnar den från sidan av stommen (Figure 1E). Vingen kan sedan skäras eller rivas vid gångjärnen för att ta bort det från kroppen och sätta i en stapel bort från kadaver och annat material.
5. För att erhålla PUPP ögon eller hjärnan, tvätta puppa tills ögat-hjärnan komplex blir lösgjorda och fri från puppa (figur 1F, 1 H). Med hjälp av en pincett, försiktigt dra PUPP ögat bort från hjärnan och spara den önskade vävnaden.
6. Ta inte mer än 45 minuter att dissekera varje prov, eftersom resultaten blir mindre exakt de längre cellerna kvar i PBS öppnar efter djuren.

Tre. Vävnadsdissociering och DNA färgning

1. Använda en smord Pasteur pipett försiktigt överföra dissekerade vävnaderna i 0,5 ml Live DNA färglösning i en 5 ml polystyren rör (figur 1G). Överföring så lite PBS som möjligt (mindre än 300 | il) i DNA färglösning, såsom kommer utspädning av trypsin hämmar vävnadsdissociering.
2. Inkubera rören med Shaking vid 23 ° C vid 500 rpm (vi använder en Eppendorf Thermomixer).
3. Inkubera i 70 minuter, sedan vortex försiktigt i 5 sek vid en medelhastighet (inställning av 5). Överdriven vortexblandning orsakar cellsönderdelning och bildar skräp, medan under-virvling leder till cell klumpar. Återgå proverna att skaka vid 23 ° C vid 500 rpm för ytterligare 15 till 20 min innan vortexa dem en gång för 5 sek vid hastighet 5.
4. För hjärna och PUPP ögon äldre än 36hAPF, är ett modifierat protokoll krävs. Dissociera vävnader i DNA färglösning vid 23 ° C vid 500 rpm under 45 till 60 min i 1,7 ml mikrocentrifugrör. Sedan en efter en dissocierar manuellt stora bitar av vävnad genom överföring till dissekera skålen tillsammans med ca 50 l DNA färglösning och snabb pipettera upp och ned med en manuellt dragen Pasteurpipett ¹⁶ (cirka 100-150 nm öppning). Överför varje dissocierade prov med resten av 0,5 ml av DNA färglösning till ett 5 ml rör. Inkubera ytterligare 45-30 Min (upp till 90 min av total inkubationstid) vid 23 ° C med skakning vid 500 rpm tills klumpar inte längre syns.
5. Helt dissocierade prover bör ha mycket få stora synliga bitar av vävnad, även notera att acellulärt transparent PUPP vinge nagelband inte dissociera.

4. Flödescytometri

1. Slå på Attune cytometer och öppna Attune programvaran. Cytometern lasrar bör slås på via startmenyn, och daglig prestanda testet ska utföras med pärlor Spårning med tillräckliga resultat före varje dag för datainsamling. Vätskenivåer bör vara minst halvfullt och avfall töms innan bruksprov. Detaljer för idrifttagning, korrekt kalibrering och drift av Attune kan hittas i Attune User Guide ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
2. Designa en ny template genom att skapa 4 punktdiagrammen och 2 histogram i en tom arbetsyta med de parametrar som anges i 4.3, eller välj en tidigare utformad mall är lämplig för experiment, och anger antalet prover som skall samlas in. Vi har gett attune mallar (filer i. Få format) för levande Drosophila cellcykelanalys med Vybrant DyeCycle Violet och GFP eller RFP uttryck i tillägg I.
3. De medföljande mallarna innehåller fyra punktdiagrammen och två histogram med de parametrar som anges i figur 2. Kanaler för detektion innefattar: FSC och SSC - framåtspridning och side scatter anger cellens storlek och membran komplexitet, VL1 höjd (H), bredd (W) och område (A) - indikerar Violet laserexcitation av DyeCycle Violet färgning av DNA, och BL1 -A - Blå laser Kanal 1 Area, vilket indikerar GFP fluorescens. Den tillhandahållna mall för RFP analys är identisk med mallen för GFP analys, förutom att den använder den blå laser kanal 3 (BL3-A), som är optimeringzed för RFP upptäckt.
4. De punktdiagrammen i mallarna har portar för att begränsa analysen till de önskade befolkningen och att begränsa skräp och cell klumpar från analys (figur 2). Gate 1 exkluderar skräp och klumpar baserade på SSC vs FSC (Figur 2A). Gate 2 utesluter ofärgade celler, sub G1 apoptotiska celler och klumpar cell baserat på identifiering av undertröjor (VL1Area vs VL1Width) (Figur 2B). Gate 3 är en härledd grind, som omfattar celler inom grindarna 1 och 2, och identifierar GFP (eller RFP) negativa celler vs DNA innehåll baserat på VL1Height (figur 2C). Gate 4 är en härledd grind, som omfattar celler inom grindarna 1 och 2, och identifierar GFP (eller RFP) positiva celler vs DNA-innehåll (figur 2C). Dot tomter av cellstorlek enligt vad som mäts av GFP (eller RFP) vs framåtspridning (FSC) används för att generera Gates 5 och 6 (figur 2D). De två histogram plot DNA innehåll på X-axeln och celltal på Y-axis för de befolkningar som definieras av Gate 3 och Gate 4. (Figur 2E och 2F) Histogram kan också inkluderas för cellstorlek om så önskas (ej visat). För histogram cellstorlek bör populationer sättas till Gates 5 och 6, konspirera FSC på X-axeln och räknar på y-axeln.
5. Ställ inspelningen att stanna vid 10.000 GFP eller RFP positiva händelser (detta kommer att bli Gate 4, den härledda Gate Gate 1, Gate 2 och GFP eller RFP positiv gate). Varierar från 6.000 - 10.000 GFP positiva händelser har traditionellt varit målet för profiler publiceringskvalitet ^9,11. Vi föreslår att du använder ett minimum av 15 vingar eller ögon, som är cirka 50% GFP positiva att erhålla tillräcklig Gate 4 evenemang ¹⁰ för högkvalitativa profiler. Däremot har vi fått framgångsrikt tydliga uppgifter om preliminär cellcykelanalys från så få som sex vingar (Figur 3A). Ställ förvärvet volymen 300 ^, kommer detta att använda ca 460 pl av den totala 0,5 ml prov. Table 2 visar det lämpliga tröskelvärdet och spänningen inställningar som i mallen för exemplet i figur 2.
6. Kör prover på standard känslighet eller hög känslighet 100 l / min och rekord. Vi finner liten eller ingen skillnad i vår analys med olika känslighet nivåer. På grund av den akustiska fokusering av celler, kan denna cytometer mäta exakt prover vid mycket höga flöden. Till skillnad från traditionella cytometrar, finner vi inga uppgifter kompromiss genom att förvärva i hastigheter upp till 1500 händelser per sekund. De inspelade datafiler som genereras av Attune mjukvaran är i. FCS-format, som är kompatibelt med de flesta cellcykeln modellering programvara.

Fem. Data Analysis

1. Histogram över cellstorlek, DNA-innehåll för GFP (eller RFP) positiva och negativa populationer kan jämföras. De kan manuellt skiktad genom att kopiera och klistra in med hjälp av Adobe Photoshop. Om y-axeln är inställd på automatisk, kommer Y-axeln skala med highest räknas för varje prov. Blanda två grafer med Y-axeln set till autoscale skapar en överlagring av histogram med de axlar som fastställts för det globala maximala för varje population. Detta möjliggör enkel visuell jämförelse för relativa förändringar i cellcykeln fasa, även om det totala cellantal av GFP positiva och GFP negativa populationer inte är likvärdiga (exempel i Figur 3B). Alternativt en anpassad y-axeln (y-axel manuell tillval) kan ställas in på ett fast värde för histogrammen. I detta fall de relativa cellantal för två populationer kan jämföras. Som Attune använder en definierad volym av prov per körning,, absolut kvantifiering av celler för varje körning, i varje grind med procentandelar av den totala befolkningen kan erhållas från statistiken tabellen genereras automatiskt under körningen i arbetsytan (exemplet i figur 3F ). Punktdiagrammen och histogram kan också enkelt skiktas i Attune mjukvara, genom att helt enkelt dra och släppa olika prover från the exempelfil menyn till höger på den önskade grafen av ett öppet prov för jämförelse. Men att överlagra subpopulationer inifrån ett enda prov (dvs. GFP positiva och GFP negativt inom samma prov), använder vi Photoshop.
2. Två metoder kan användas för att hitta relativa procentandelar i olika faser av cellcykeln för en population. Den approximationsmetod bygger på användardefinierade regioner att avgränsa gränserna för G1, S, G2 och> G2 toppar. Denna metod möjliggör snabba och enkla procenttals inom användardefinierade regioner (figur 3E). Vi sätter våra regioner baseras på en direkt test med Drosophila Kc celler, märkta för S-fas med Etynyl-deoxiuridin (EDU) inkorporering. Den andra metoden använder programvara från tredje part modellering för skattning av cellcykeln distributionen. Vi använde ModFitLT (Verity Software House) programvara till exempel i fig. 3F.

Representative Results

Figur 2 visar representativa resultat för en larval vinge prov, som uttrycker GFP i den bakre hälften av vävnaden, med den medföljande GFP mallen. Liknande resultat erhålls med samma vävnadstyp och uttryck mönster för RFP med den medföljande RFP mallen (Figur 3A). De tillhandahållna mallar och spänningar (tabell 2) är lämpliga för analys av larval ögon (figur 3B), hjärna och vingar, samt PUPP ögon, hjärna (figur 3D) och vingar. Histogram över relativ cellstorlek tillhandahålls genom plottning FSC för befolkningar i Gates 5 och 6 kan också genereras (figur 3C). Gates kan behöva justeras något på grund av skillnader i cellstorlek för olika vävnader eller skillnader i fluorescensintensitet för olika GFP eller RFP transgener. Detta kan göras medan du kör ett litet test provvolym (50-100 l), innan du slår rekord.

ETTllowing y-axeln (räknas) för cellcykeln eller cell histogram storlek för att auto-skala (y-axel skala inställd på automatiskt) i Attune programvara, resulterar i histogram som visar den globala maximum för varje population. fig. 3B-3D visar representativa resultat med GFP positiva och GFP negativa histogram med y-axeln satt till den globala maximum för varje population. Ställa en särskild y-axel max (y-axeln skalan inställd på manuell med ett användardefinierat värde), möjliggör jämförelser av absoluta tal mellan populationer, vilket kan vara användbart för att jämföra förökningshastigheter, men gör det svårt att jämföra cellcykeln infasning populationer när antalet GFP-positiva celler vs GFP negativa celler är väldigt olika.

Figur 3B visar profiler cellcykeln för GFP positiva och negativa celler i larver ögon, uttrycker GFP i den bakre med GMR-Gal4, UAS-GFP transgener. Den överlagring avslöjar skillnader i cellcykeln phasing av den bakre GFP-uttryckande celler. Figur 3c visar den relativa förändringen i cellstorlek mellan GFP-positiva och negativa celler i B, genom att rita cellstorlek mätt med FSC. Fig. 3D visar en profil cellcykeln från PUPP hjärnor vid 46h APF. GFP-positiva celler är härstamning spårning kloner som uttrycker G1-S-regulatorer Cyklin D och E2F som stör inaktivitet och leda till S-fas inträde, som indikeras av den röda pilen och bekräftats av S-fas märkning med inkorporering av EDU (Fig. 3D infälld). Detta står i kontrast till de icke uttryckande GFP negativa celler, som i detta skede normalt greps i G1 (svart spår, figur 3D).

De flesta cellcykelstudier profiler används för att få information om procentandelar av en befolkning i olika cellcykelfaserna. Detta kan approximeras i Attune programvaran genom att skapa användardefinierade områden på histogram avgränsar G1, S och G2 faser (<strong> Figur 3E). Den Attune programvara genererar automatiskt en statistik tabell för varje körning, vilket ger absoluttal av celler inom användardefinierade regioner och procentsatser (Fig. 3F). Denna metod fungerar bra när man jämför relativa förändringar i fas fördelning mellan en kontroll och experimentell befolkningen. Alternativt kan modellering programvara kan användas för att uppskatta procentsatser i varje fas samt apoptotiska celler. Vi använde ModFitLT (Verity Software House) i figur 3G, vilket direkt kan öppna. Fcs datafiler som genereras av Attune programvaran.

Figur 1. Dissektion och iscensättning av larver och puppa vävnader. A. Dissektion av larver (av genotyp w ¹¹¹⁸ visat) vid 110h av utveckling som visar den bakre tredjedelen före (överst) och efter (nederst) inversion. Vit pilspets indikerar en vinge fäst till larver nagelband och en röd pilhuvud indikerar positionen för hjärnan B. Wings (vit pilspets, note vinge till vänster är fäst vid ett ben skiva, är vingen till höger slits vid den dorsala notum), ögon (gul) och hjärnan (röd) avlägsnas från larverna. C. Dissektion av puppa visar positioner nedskärningar med pincett placerade i luftrummet anterior till huvudet (röda streckade linjer) D. Pupa bort från nagelbanden innan tvättning för att avlägsna fett och tarm . E. Städat puppa som visar processen att lyfta vingarna för borttagning F. Städat puppa visar vingar (streckad) och delvis avlägsnas öga-hjärna komplex (röda och gula pilar). G. dissekerade larver vingar och ögon visar pipett för överföring. H. dissekerade postmitotiska PUPP öga-hjärna komplex. I. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Representant cellcykeln analys av vävnader som uttrycker GFP hjälp Vybrant DyeCycle Violet och Attune. Ett representativt arbetsyta, innehållande 4 punktdiagrammen och 2 histogram visas för en larver vinge prov uttrycker GFP och cyklin D i den bakre flygeln, som drivs av en engrailed-Gal4 transgen. A. Dot tomt på cellstorlek med Gate 1 för att utesluta skräp och klumpar. B. plotten att diskriminera undertröjor med Gate 2 för att utesluta ofärgade celler, sub-G1 DNA innehåll (apoptos), och klumpar. C. plot av GFP vs DNA-innehåll. GFP negativa (Gate 3) och positiva (Gate 4) celler kan urskiljas och 2N och 4N DNA-innehåll är uppenbart baserat på position längs x-axeln. D. plot av cellens storlek mätt med GFP vs framåtspridning (FSC) att generera Gates 5 och 6. Notera att celler inom Gate1 är rödfärgade för visuell hjälp med att avgöra Gates 5 och 6 för detta spridningsdiagram. E. Histogram av DNA-innehållet vs räknas för GFP eller RFP negativ (befolkning satt till Gate 3). F. Histogram av DNA-innehåll vs räknar för GFP eller RFP positiva (befolkning satt till Gate 4). Histogram kan också inkluderas om cellstorlek om så önskas. För histogram cellstorlek, populationerna should sättas till Gates 5 och 6. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Representativa histogram av cellcykeln och cellstorlek analys för olika utvecklingsstadier och vävnader. (A) Representativa histogramdata visas för jämförelse cellcykeln i specifika celltyper med RFP uttryck med DyeCycle Violet (infällda bilden visar punktdiagram av RFP fluorescens mot DNA-innehåll ). Exemplet innehåller larver vingar uttrycker RFP i den bakre, driven av en engrailed-Gal4 transgen. (B) Överlägg av GFP-positiva vs GFP negativa histogram DNA-innehåll i larver ögon med GFP uttryck drivna av GMR-gal4 promoter ^17, visar de flesta GFP-positiva celler i G1. (C) Mindre relativ cellstorlek av GMR driven GFP + celler jämfört med GFP-kontroller, mätt med spridning framåt med Gates 5 och 6. (D) I pupal hjärnan, GFP positiva celler indikerar värmechock inducerade härstamning spåra kloner via FLP-ut-metoden ⁵ induceras under ^{2: a} larver instar, överuttryck av G1-S cellcykeln regulatorer cyklin D och E2F, orsakar avvikande S-fasinträde (röd pil) i normalt postmitotisk G1 greps vävnad. Den onormala S-fasinträde observerades av flödescytometri bekräftades genom inkorporering av edu, som märker celler i S-fas (infälld). (E) Exempel på områden som används för att uppskatta relativa procentandelar i G1, S och G2 faser. Gränser uppskattades baserat på S-fas inkorporering av EDU i Drosophila-celler i ett separat experiment. (F) Exempel på statistiktabellen genereras av Attune programvara som visar relativa procentandelar i de definierade regionerna. (G) Exempel på cellcykeln modellering av representativa attune data med ModFitLT. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Protokollet som beskrivs här tillåter analys av cellcykeln, relativ cell storlek och relativa antalet celler i levande Drosophila vävnader vid olika utvecklingsstadier. När denna analys är kopplad med celltypsspecifik fluorescerande protein expression eller härstamning spårning, kan detaljerad information erhållas om cellulära svar på diskret cellcykeln eller störningar tillväxt. Som bevis på princip störs vi quiescence i PUPP flyga hjärnan genom att uttrycka G1-S regulatorer cellcykeln i GFP märkta cellkloner, vilket leder till avvikande DNA-replikation i en utvecklingsfas när hjärnceller är normalt över 90% greps G1 (Figur 3D) .

Men det finns några viktiga begränsningar i denna levande cellcykeln analysmetod. Det första kan man inte skilja mellan celler i de olika stadierna av mitos som använder protokollet beskrivs här. Därför bör analysen beskrivs här kompletteras med immunofluorescence färgning för en mitotic markör, såsom Ser10-fosforylerad Histone H3 ¹⁸ att kvantifiera mitotiska indexet i vävnaderna av intresse. Utöver den här beskrivna metoden kan inte skilja mellan celler i G1 vs en G0 gripande, eftersom båda länderna har samma DNA-innehåll. Eftersom DyeCycle Violet tas upp av levande celler, identifiering av celler i senare apoptotiska stadier är också begränsad. Slutligen är det viktigt att notera att mätningar av cellstorlek baserade på ljusspridning framåt är relativa cellstorlek mätningar snarare än absolut kvantifiering av storlek. För absolut kvantifiering av cellstorlek vi rekommenderar en volymetrisk metod såsom den som används i en Coulter Counter (Beckman Coulter).

När cellcykeln fas och storlek uppgifter är kopplad med härstamning spårning för att mäta tid cell fördubbling, detaljerad information om cellcykeln och tillväxt kan beräknas, t.ex. längd G1, S och G2 faser och celltillväxthastigheten ^9,11 in vivo kan ge detaljerad information om cellcykeln och tillväxt reglering för kvantitativ cellcykeln, celltillväxt och vävnadsmorfogenes modellering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube	BD Falcon	352058	5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps	Fine Science Tools	11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Life Technologies/ Invitrogen	V35003
Table 1. Required reagents and instruments.
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Threshold (x1000) 100 10 10 10 Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150 Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.