Summary
活细胞周期分析的一种协议
Abstract
流式细胞术已被广泛用来获得的细胞群体中的DNA含量的相关信息，推断出在不同的细胞周期的各个阶段的相对百分比。此技术已成功地扩展模式生物果蝇体内的细胞周期调控的遗传研究有丝分裂组织。当加上细胞类型特异性荧光蛋白表达和遗传操作，可以得到对细胞数，细胞大小和细胞周期的相位在体内的详细信息。活细胞的方法，然而，这依赖于细胞渗透性的Hoechst 33342 DNA嵌入染料的使用，限制用户配备UV激光器的流式细胞仪。我们已经修改了协议，使用一个新的活细胞DNA染料，紫Vybrant DyeCycle，兼容比较常见的紫405nm的激光。这里介绍的协议允许高效加上细胞的细胞周期分析类型，电池的相对大小和细胞数的信息，在各种果蝇组织。此协议扩展有用的细胞周期分析技术在活果蝇组织中的一个小的台式分析仪，调到声波聚焦流式细胞仪，一个单一的实验室规模上可以运行和维护。
Introduction
可用于测量细胞活力，电池的相对大小，DNA含量在活的细胞群的荧光蛋白表达的流式细胞仪。由于核DNA复制在S阶段，人口细胞DNA含量的信息可以用来推断相对百分比，在不同的细胞周期1-3。这种方法已经成为模型系统从酵母到哺乳动物细胞周期分析的基石。
果蝇基因在体内的细胞周期调控的分析已经成为一个很好的模型系统。苍蝇提供广泛的遗传工具允许优雅的组织特异性和时间调节细胞周期调控操作一起在体内的荧光蛋白质为基础的谱系跟踪4-6。流式细胞仪已被用于研究果蝇的一些类型的细胞中DNA的含量，包括endorepl指令，这是通过将细胞和培养的细胞有丝分裂专用7,8。德拉克鲁兹和埃德加是由体内细胞周期研究的一个重要进展，现场二倍体果蝇成虫盘9,10流式细胞仪分析，协议已经被许多实验室使用和修改的协议的发展。该技术中，加上通过诱导荧光蛋白表达和组织特异性标记基因在体内的谱系追踪，允许一个取得整体细胞倍增时间，细胞大小的基因操作的影响的信息，并确定细胞周期的各个阶段的精确的定时， 在体内 9 ，11。然而，这种方法迄今依赖于使用的细胞可渗透的Hoechst 33342 DNA嵌入染料染色和定量活细胞中的DNA，这限制了用户流能够令人兴奋的Hoechst染料的UV激光器的流式细胞仪。这些通常是发现，只有在分拣机（ 即 BD FACS宏达GE，BD FACSAria）或昂贵的多色台式系统（ 即 BD LSR），通常需要支持机构流动的核心设施。
我们已经修改了赫斯特为基础的协议，使用新的活细胞DNA染料从Invitrogen公司，Vybrant DyeCycle紫。这种染料是带有紫罗兰的405 nm激光，多见于较小的台式分析仪，可在小自足的台式分析仪，Attune的声波聚焦流式细胞仪兼容。在这里，我们提出了一个详细的协议分析细胞周期，细胞类型，细胞大小，细胞数量和谱系分析在各种果蝇组织在不同的发展阶段使用DyeCycle紫上调，可以配上。该协议扩大了流式细胞仪适合进行这种分析与果蝇组织和提供这种类型的活细胞周期分析如何可以修改为其他组织类型和发展阶段的例子。
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Protocol
1。飞畜牧
- 交叉飞行所需的基因型在狭窄的塑料小瓶10毫升酵母葡萄糖培养基或其他富含蛋白质的媒体你的选择。详细4,5中描述的果蝇基因的广泛的工具可用于组织特异性表达和体内荧光蛋白表达的谱系追踪。父母每天获得24小时后代集合一系列新鲜小瓶，或更精确的分期，收集胚胎琼脂平板上，新孵出的幼虫转移到小瓶描述了10位。为了确保跨实验和统一的条件，避免过度拥挤，F1代单瓶总数应不超过100。根据遗传的实验设计，在适当的孵化器，直到所需的发育阶段保持小瓶。
- 收集实验动物：您将需要在第三幼虫老熟幼虫龄幼虫解剖准确的蛹分期或白色前蛹（WPP）（L3）约110-120小时的发展。戏剧细胞周期的变化，包括非增殖状态切换到发生在不同的时间点，在变态12,13。因此，正确分期蛹（1小时内的发展）重现的细胞周期的蜕变过程中的数据是必不可少的。 WPP对应为0小时后蛹的形成（0小时APF）在图1中所示，面板I采集WPP在一个35毫米的培养皿上的折叠的湿Kimwipe用2.5毫升水，以保持一定的湿度。年龄蛹，直到所需的阶段（小时APF）在适当的温度。需要注意的是发展收益1.2倍的速度在29°C和2.2倍，更慢，在18°C比标准的25°C 14。
- 热休克动物谱系追踪克隆，如果需要9,11激活热休克flipase，（HS-FLP）诱导重组。对于幼虫，浸泡热休克完全浸没在水浴中（在37℃下），并确保幼虫的小瓶。热休克蛹，用封口膜密封的培养皿中，完全淹没到水浴。请务必除去封口膜的热休克后，动物的生存，以便有足够的氧气交换。热休克的持续时间依赖于活性flipase使用的转基因和所需的克隆数。我们经常使用诱导“FLIPOUT”谱系追踪克隆15，HS-FLP第一号染色体上的基因和2-4分钟的热休克蛹在35 mm培养皿幼虫7-8分钟，而HS-FLP转基因的第二染色体需要20分钟。热休克克隆获得类似的数字。
细胞分裂的速度和清扫时机决定在每个组织中克隆大小。在正常条件下，我们发现，克隆幼虫翼诱导热休克20分钟（hs-FLP的第二染色体上的转基因）和dissec泰德48小时后，包含约20-30大小不等，从每10个细胞克隆两个单元，每个克隆的分离克隆，平均大约每四个单元克隆。相比之下，7分钟0小时APF同一HS-FLP转基因蛹在培养皿中的热休克36小时后解剖，很好的分离克隆（约15-25）介乎一至四个单元的平均收益率2.2每个克隆细胞。这样的数据可以被用于确定所研究的组织的平均细胞倍增时间。
2。解剖
- 轻轻的幼虫/蛹转移到一个透明的玻璃夹层菜含有1X PBS。
- 使用解剖显微镜和充足的光，轻轻抓住幼虫腹部用锋利的INOX＃5镊子，微型剪刀剪前三分之一，并反转前三分之一推口区向后路向内按住幼虫角质层稳定（ 图1A）。小心删除opaqu时É脂肪体和任何剩余肠道所需翼，眼或脑组织，如提高知名度。解剖所需的组织;干净去除气管和角质层的翅膀从口钩，镊子，眼睛或脑眼（ 图1G）。
- 解剖蛹;使用镊子轻轻抓住蛹的蛹壳的前尖那里是一个气泡，以避免损坏的蛹内（ 图1C）。中的相对的手钳或微型剪刀可以用来帮助定位浮动蛹进行适当的抓。干净微型剪刀划破后尖蛹。这种横截面的切应在一个很小的角度朝向动物的背侧部分，释放内部压力而不迫使histolyzed的脂肪转化为所需的组织中的胸部和头部。小心剪下沿背正中，避免机翼和前眼脑复杂。小心取出蛹，从蛹情况下抓住蛹表皮后缘，然后将其拉出的蛹的情况下（ 图1D）。角质层前眼脑复用钳子戳一个小洞。使用玻璃巴斯德吸管带有橡胶球，轻轻洗PBS解剖的解决方案，通过局部解剖蛹，删除histolyzed脂肪和任何剩余的肠道组织。这也有效地润滑与脂质和蛋白质的解剖组织的发生率，从而降低了从粘的玻璃移液管的内部购买的玻璃吸管。
- 要取得蛹翅膀，角质层包围机翼和翼本身必须撬开从蛹（ 图1E）。这是可以做到保持蛹由磁头与镊子，同时使用另一种的镊子可以掌握翼角质层的最后的小费和拉出或机翼下的在铰链附近的操纵镊子从侧面撞出之前胴体（FIGURE 1E）。机翼可以在铰链处被剪开或撕开，从体内取出，并把在一堆远离屠体及其他材料。
- 为了获得蛹的眼睛或脑部，洗蛹，直到眼脑复从蛹（ 图1F，1H）脱落和免费。使用镊子，轻轻一拉蛹的眼睛远离大脑和保存所需的组织。
- 不要长于45分钟，每个样品解剖，结果变得不那么准确较长的细胞后，留在PBS开放的动物。
3。组织分离和DNA染色
- 使用润滑巴斯德吸管，仔细解剖组织转移到0.5毫升现场DNA染色溶液5毫升聚苯乙烯管（ 图1G）。转移到DNA染色溶液作为小PBS尽可能（小于300微升），会抑制胰蛋白酶的稀释组织分离。
- 孵育管夏奇吴先生在23°C在500转（我们使用的Eppendorf恒温）。
- 孵育70分钟，然后轻轻地，持续5秒，在中等速度（设定5）涡。过度的震荡会导致细胞破坏和碎片形式，而下的震荡会导致细胞团块。返回样品摇晃在23°C在500转一个额外的15至20分钟涡旋前一次的速度，持续5秒5。
- 对于的头脑和蛹的眼睛比36hAPF旧的，修改协议是必需的。在23°C在500转游离组织中DNA染色溶液1.7毫升离心管中的45-60分钟。然后一个接一个手动分离大块组织转移到解剖盘，连同约50微升的DNA染色解决方案和快速上下吹打手工绘制的巴斯德吸管16（约100-150微米开口）。每个分离的试样转移到5ml的管0.5毫升的DNA染色溶液的其余部分。孵育45-30分钟（总孵化时间高达90分钟），在23℃以500rpm振荡，直到不再是可见的团块。
- 完全分离的样品应该有极少数的大可见大块的组织，虽然注意到脱细胞透明蛹翼角质层不会分解。
4。流式细胞仪
- 打开Attune的流式细胞仪，并打开Attune的软件。流式细胞仪激光器应通过启动菜单中打开，应该有足够的分数进行绩效跟踪珠每一天前的数据采集和日常表现测试。液体水平应该是至少半满和废物的性能测试之前清空。启动，适当上调校准和操作的详情，可以发现在Attune的用户指南（ http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf ）
- 设计一个新的TEmplate设置的参数在4.3中创建一个空白工作区中的4点图2直方图，或选择预先设计好的模板，适合进行试验，并表示要收集的样本数。我们已经提供了活果蝇细胞周期分析与Vybrant DyeCycle紫罗兰和GFP或RFP表达的附录一Attune的模板（。格式的文件）
- 提供的模板包括四个点的情节和两个直方图如图2所示的参数。检测渠道包括：FSC和SSC - 向散射和侧向散射，表明细胞的大小和膜的复杂性，VL1高度（H），宽度（W）和面积（A） - 表明紫激光激发紫DyeCycle染色的DNA，和BL1 - 蓝色激光通道1区，表明绿色荧光。本RFP的分析提供了模板GFP分析的模板是相同的，只是它使用蓝激光通道3（BL3-A），这是优化作业捷思RFP检测。
- 在模板中的点图的大门，以限制到所需的种群分析和分析（ 图2），以限制碎片和细胞团块。 1号门不包括碎片和SSC与FSC（ 图2A）的基础上的团块。门2不包括未染色细胞，亚G1期的凋亡细胞和根据识别汗衫（VL1Area与VL1Width的）（ 图2B）的细胞团块。栅极3是一个派生的栅极，包含门1和2的细胞内，并识别绿色荧光蛋白（RFP）与阴性细胞DNA含量根据对VL1Height（ 图2C）。门4是一个派生的栅极，包含门1和2的细胞内，并确定了绿色荧光蛋白（RFP）与DNA含量的阳性细胞（ 图2C）。绿色荧光蛋白（RFP）与前向散射（FSC）所测得的细胞的大小的点图被用于产生门5和6（ 图2D）。这两个直方图的情节上的X轴和细胞计数在Y的轴的DNA含量s的定义的人口由3号门和4号门。直方图（ 图2E和2F）也可以被包含用于细胞的大小，如果需要的话（图中未示出）。对于细胞的大小的直方图，人口应设置门5和6，在X-轴和y-轴的计数绘制FSC。
- 设置录音停止在10,000 GFP或RFP积极的事件（这将是4号门，派生门1号门，2号门和GFP或RFP积极的门）。范围从6,000 - 10,000 GFP阳性事件历来出版优质型材9,11的目标。我们建议使用最小的15翅膀或眼睛，约50％的GFP阳性获得足够的高品质型材10 4门事件。然而，我们已经成功地获得清晰的数据进行初步分析细胞周期从6翅膀（ 图3A）。设置采集量为300微升，这将使用总数的0.5毫升样品约460微升。 大表2显示了模板中所提供的例子在图2中的合适的阈值电压设置。
- 运行样品在标准灵敏度或高灵敏度100微升/分钟和记录。我们发现几乎没有在我们的分析中差异与不同的灵敏度水平。由于的声聚焦细胞，流式细胞仪可以准确地测量样品在非常高的流速。不同于传统的流式细胞仪，我们发现没有数据通过收购速度高达每秒1500事件妥协。 Attune的软件所产生的数据文件记录。FCS格式，这是与大多数细胞周期建模软件兼容。
5。数据分析
- 绿色荧光蛋白（RFP）的细胞大小和DNA含量的直方图可以比较正面和负面的人群。他们可以手动分层，通过复制和粘贴使用Adobe Photoshop软件。如果在y轴被设定为自动，则在Y轴扩展的h每个样品计数ighest。叠加两个图的Y轴设置为自动定标，建立一个覆盖每个种群的全局最大值设置为与轴的直方图。这使得很容易在细胞周期的相位的相对变化的视觉比较，即使当GFP阳性细胞总数和GFP阴性群体是不等价的（例如，在图3B中）。另外，自定义y轴（y轴手动选项）可以被设定为一个固定值的直方图。在这种情况下，对两个群体的相对细胞数进行比较。由于上调样品每运行使用定义的体积，绝对量化为每个运行的细胞，在每个门与总人口的百分比，可以得到自动生成的统计信息表在运行过程中在工作区中（例如在图3F ）。点图和柱状图，也可以很容易地在分层Attune的软件，通过简单的拖放不同的样品从日E样品文件菜单右侧一个开放的样品到所需的图形进行比较。然而，覆盖亚群内单个样品（ 即 GFP阳性和GFP在同一样品阴性），我们使用Photoshop。
- 两种方法都可以用来寻找人口的细胞周期的不同阶段的相对百分比。近似方法依赖于用户定义的区域划定边界的G1，S，G2和G2峰>。这种方法允许快速和容易的百分比估计用户定义的区域内（ 图3E）。我们设定的区域，根据直接测试与果蝇 KC细胞S期，标记使用乙炔基-脱氧尿苷（EDU）注册成立。第二种方法是使用第三方建模软件，细胞周期分布的估计。例如，在图3F我们使用ModFitLT的软件（Verity的软件楼）。
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Representative Results
图2所示为一个幼虫翼样本的代表性的结果，组织的后半部，表达绿色荧光蛋白GFP模板。得到类似的结果具有相同的组织的类型和使用所提供的RFP模板（ 图3A）为RFP的表达模式。提供的模板和电压（表2）适合幼虫的眼睛（ 图3B），大脑和翅膀，以及蛹的眼睛，大脑（ 图3D）和翅膀的分析。盖茨5和6的人口密谋FSC提供相对单元尺寸也可以生成柱状图（ 图3C）。盖茨可能需要进行调整，而略有差异，细胞的大小为不同的组织或为不同的GFP或RFP转基因的荧光强度差异。这是可以做到同时运行一个小的测试样品（体积50-100微升），创下之前。
一在同调软件llowing细胞周期或细胞大小的直方图进行自动放大，y轴（计数）（Y轴比例设置为自动），结果在每个种群的全局最大值的直方图，显示图3B-3D显示代表性的结果与GFP阳性和GFP阴性直方图与y轴设置为全局最大为每个人口。设置一个特定的y轴的最大值（Y轴比例与用户定义的值）设置为手动，可以比较绝对数量种群之间的增殖率进行比较，它可以是有用的，但使得它很难比较细胞周期的相位在人口数字时GFP阳性细胞与GFP阴性细胞有很大的不同。
图3B示出在幼虫的眼睛的GFP阳性和阴性细胞的细胞周期的档案，在后部使用GMR-Gal4的UAS-GFP转基因的表达绿色荧光蛋白。叠加显示在细胞周期P的差异换言之，后表达GFP的细胞。 图3C显示了在B细胞的大小之间的GFP阳性和阴性细胞的相对变化，通过绘制由FSC测定细胞的大小。 图3D示出一种细胞周期从蛹的大脑46h的APF的档案。 GFP阳性细胞谱系追踪克隆表达，用红色箭头表示G1-S蛋白cyclin D和E2F破坏静止，导致S期进入S-相标记注册成立EDU（ 图3D插图），并确认。在非表达GFP阴性细胞，在此阶段通常G1（黑色迹线， 图3D）被捕相反。
大多数细胞周期的配置文件用于获取有关在细胞周期的不同阶段的人口百分比。这可以近似调到软件中创建用户定义的区域直方图划定G1，S和G2期（<强图3E）。 Attune的软件会自动生成一个统计表每次运行，给用户定义的区域和百分比（ 图3F）内的细胞绝对计数。控制和实验种群之间的相位分布相对变化比较时，这种方法效果很好。另外，建模软件可用于估计在每个阶段，以及凋亡细胞的百分比。我们用图3G ModFitLT（Verity的软件楼），它可以直接打开。FCS由Attune的软件生成的数据文件。
图1。幼虫和蛹的组织解剖和分期。A.解剖幼虫（基因型所示为1118瓦特 ），在110发展呈现前三分之一小时前（上）后（下）反转。白色箭头表示一个的机翼连接到幼虫表皮和一个红色的箭头表示脑B.翼（白箭头，注意左侧翼附着一条腿盘的位置，右机翼被撕裂在背notum），眼睛（黄色）和脑（红色），从幼虫中删除。C.解剖蛹表示在空域前方D.蛹洗涤除去之前，从角质层除去头部（红色虚线）下的切口的位置与钳脂肪和肠E.清理蛹起重翅膀搬迁过程楼清理蛹翅膀（点）和部分去除眼脑复（红色和黄色箭头）。H. G.解剖幼虫的翅膀，眼神中流露出转让吸管。解剖有丝分裂后蛹眼脑的复杂。 点击这里查看大图 。
图2。代表细胞周期分析组织表达GFP使用Vybrant DyeCycle紫上调。一位代表工作区，包含4点图2直方图显示为幼虫翼样表达GFP和Cyclinď的后翼，带动锯齿状ED-Gal4的转基因细胞大小A.点图1门排除碎片和团块。B.点图歧视汗衫与2号门，以排除未染色的细胞，亚G1 DNA含量（细胞凋亡），团块。C.绿色荧光蛋白与DNA含量的积点。 GFP阴性（3号门）和阳性（4号门）细胞可尊敬和2N和4N DNA含量的是显而易见的，根据位置沿x轴D.点图细胞大小作为衡量GFP与正向散射（FSC）产生门5和6。注意GATE1细胞内是红色的，在确定盖茨5日和6这个散点图。E. DNA含量与计数GFP或RFP负（人口为3号门）的直方图的视觉援助。F. DNA含量直方图与计数GFP或RFP积极的（人口4号门）。柱状图也可以包含用于细胞的大小，如果需要的话。对于细胞体积直方图，人口shoulD是设置盖茨5和6。 点击这里查看大图 。
图3。细胞周期和细胞大小分析各个发育阶段和组织的代表直方图（A）代表直方图数据显示为特定的细胞类型与：紫DyeCycle（RFP荧光与DNA含量的插图显示散点图使用RFP表达细胞周期的比较）。这个例子包含幼虫翅膀表达RFP的后路，带动一个GAL4 ENGRAILED的转基因。（B）覆盖GFP阳性与GFP负DNA含量直方图由GMR-GAL4公关的驱动与绿色荧光蛋白表达在幼虫的眼睛（C）omoter 17，显示在G1最GFP积极的细胞。较小的相对细胞大小GMR驱动GFP +细胞相比，GFP-控制，向前分散使用5和6盖茨作为衡量。（D）在蛹的大脑，GFP积极格表示谱系追踪克隆通过诱导FLP出法5在2 届龄幼虫诱导热休克，造成异常项（红色箭头）在S期，G1-S过表达细胞周期蛋白cyclin D和E2F通常有丝分裂后G1被捕的组织。异常S期项目流式细胞仪观察证实了成立EDU，标记细胞S期（插图）（E）的例子用来估计在G1，S和G2期的相对百分比的地区。边界估计根据在另一项实验将埃杜在果蝇细胞S期（F）的统计示例表所产生的AttunE软件定义的区域表现出相对的百分比。（G）示例代表Attune的数据使用ModFitLT细胞周期的建模。 点击此处查看大图 。
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Discussion
这里描述的协议可以分析细胞周期，细胞相对大小和相对活果蝇在不同的发育阶段组织细胞数量。当这种分析是细胞类型特异性荧光蛋白表达谱系追踪再加上详细的信息，可以得到谨慎细胞周期或增长的扰动有关的细胞反应。作为证据的原则，我们在蛹飞脑扰乱了静止在GFP标记的细胞克隆表达G1-S细胞周期调控，导致异常的DNA复制处于发展阶段时，脑细胞通常超过90％的G1被捕（ 图3D） 。
但是，有一些重要的限制这个活的细胞周期分析方法。首先，一个人不能区分细胞在有丝分裂的不同阶段，使用这里描述的协议。因此，这里描述的分析中应补充IMM有丝分裂的标记，如Ser10磷酸化组蛋白H3 18在组织中感兴趣的有丝分裂指数量化的unofluorescence染色。除了这里介绍的方法不能区分细胞在G1 G0逮捕主场迎战，两个国家有相同的DNA含量。由于DyeCycle紫是采取了由活细胞，识别细胞后凋亡阶段也是有限的。最后，重要的是要注意，根据前向散射测量细胞的大小是相对于细胞的大小的测量，而不是绝对定量的大小。对于绝对定量细胞大小，我们建议体积的方法，如使用Coulter计数器（Beckman Coulter公司）。
当细胞周期的相位和大小的数据加上谱系追踪测量细胞倍增时间，细胞周期有关的详细信息，可以计算出生长，如长度的G1，S和G2期，细胞的生长速度9,11 在体内的遗传操作，可以提供定量细胞周期，细胞生长和组织形态建模的细胞周期和细胞生长调控的详细信息。
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Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢阿依德拉克鲁兹的开发和教学的原始协议，这个版本是基于10。工作在Buttitta实验室是由美国国立卫生研究院授予GM086517支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
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Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
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References
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