Summary
פרוטוקול לניתוח של מחזור תא חי
Abstract
cytometry הזרימה כבר בשימוש נרחב כדי להשיג מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים, כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים. טכניקה זו הורחבה בהצלחה לרקמות mitotic של מודל אורגניזם תסיסנית למחקרים גנטיים של ויסות מחזור תא בגוף חי. בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי ומניפולציות גנטיות, ניתן לקבל מידע מפורט על השפעות על מספר תאים, גודל תא ומחזור תא הדרגת in vivo. עם זאת שיטה לחיות תאים זו הסתמכה על השימוש בצבע התא חדיר Hoechst 33342-DNA intercalating, הגבלת משתמשי cytometers זרימה המצוידים בלייזר UV. יש לנו שונה בפרוטוקול זה כדי להשתמש בצבע חדש יותר לחיות תאי ה-DNA, ויולט DyeCycle Vybrant, תואם עם לייזר 405nm הסגול הנפוץ יותר. הפרוטוקול המובא כאן מאפשר ניתוח מחזור תא יעיל בשילוב עם תאסוג, גודלו היחסי של תאים ומידע מספר תא, במגוון רחב של רקמות תסיסנית. פרוטוקול זה מרחיב את הטכניקה שימושית במחזור תא הניתוח לרקמות תסיסנית למנתח benchtop קטן, Cytometer ההתמקדות אקוסטית לכוונן, אשר ניתן להפעיל ומתוחזק בקנה מידת מעבדה אחת.
Introduction
cytometry הזרימה יכול לשמש למדידות של כדאיות תא, גודל תא יחסי, תוכן ה-DNA וביטוי חלבון פלואורסצנטי באוכלוסיות תאים חיים. עקב השכפול של ה-DNA הגרעיני במהלך השלב-S, מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים יכולים לשמש כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים 1-3. שיטה זו הפכה לאבן פינה של ניתוח מחזור תא במערכות מודל משמרים ליונקים.
זבוב פירות תסיסנית הפכה מערכת מודל מצוינת לניתוחים גנטיים בvivo של ויסות מחזור תא. הכלים הגנטיים הנרחבים הזמינים בזבובים לאפשר למניפולציות רקמה אלגנטית ספציפיות ומוסדרות באופן זמני של רגולטורים מחזור תא יחד עם בשושלת מבוססת חלבון פלואורסצנטי vivo התחקות 4-6. cytometry הזרימה נעשה שימוש כדי ללמוד תוכן ה-DNA במספר סוגי תאים תסיסנית, כולל endoreplicating תאים ותאים בתרבית mitotic 7,8. מקדמה חשובה במחקרי vivo מחזור התא נעשתה על ידי דה לה קרוז ואדגר, עם הפיתוח של פרוטוקול לניתוח תזרים cytometric של חיות דיפלואידים תסיסנית דיסקים דמותי 9,10, פרוטוקול בו נעשה שימוש והותאם על ידי מעבדות רבות. טכניקה זו, כאשר בשילוב עם גנטי בשושלת vivo מעקב דרך ביטוי חלבון פלואורסצנטי מושרה וסימון רקמות ספציפי, מאפשרת לאדם לקבל מידע על השפעות המניפולציה גנטיות בזמן הכפלת תא כללי, גודל תא ולקבוע את עיתוי מדויק של שלבי מחזור תא in vivo 9 , 11. אולם שיטה זו הסתמכה עד כה על השימוש בצבע תא ה-DNA intercalating החדיר Hoechst 33342 להכתים ולכמת-DNA בתאים חיים, שהגביל את המשתמשים לזרום cytometers עם לייזר UV מסוגל המרגש לצבוע Hoechst. אלה נמצאים בדרך כלל רק בממיינים (כלומר BD FACS VantaGE, BD FACSAria) או יקרות ססגוניות benchtop מערכות (כלומר BD LSR), תמיכה בדרך כלל המחייב ידי מתקני גרעין זרימה מוסדיים.
יש לנו שונה בפרוטוקול מבוסס Hoechst להשתמש לצבוע DNA לחיות תאים חדשים מInvitrogen, Vybrant DyeCycle יולט. צבע זה תואם לייזר ננומטר 405 סגול, נפוץ יותר בנתחים קטנים יותר המעבדתיים וזמין במנתח benchtop עצמאי הקטן, אקוסטית לכוונן התמקדות Cytometer. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח מחזור תא שיכול להיות בשילוב עם סוג התא, גודל תא, מספר תאים וניתוח שושלת במגוון רחב של רקמות דרוזופילה במהלך שלבים שונים של פיתוח באמצעות יולט DyeCycle ולכוונן. פרוטוקול זה מרחיב את מספר cytometers המתאים לניתוח כזה עם רקמות תסיסנית ומספק דוגמאות כיצד ניתן לשנות סוג של ניתוח מחזור תא חי זה לסוגי רקמות נוספים ושלבי התפתחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טוס גידול בעלי
- קרוס זבובים של גנוטיפים רצויים בבקבוקוני פלסטיק צרים עם 10 מיליליטר שמרים-גלוקוז בינוני 3 או מדיה עשירה בחלבון אחר על פי בחירתך. הכלים הנרחבים תסיסנית המהונדס הזמינים לביטוי ספציפי רקמות ושושלת התחקות עם בביטוי חלבון פלואורסצנטי vivo מתוארים בפירוט במקומות אחרים 4,5. העבר את ההורים לבקבוקונים טריים מדי יום כדי לקבל סדרה של 24 אוספי צאצאי משאבים אנושים, או לבימוי מדויק יותר, לאסוף עובר על צלחות אגר ולהעביר זחל בקע זה עתה לבקבוקוני 10 כפי שתואר. על מנת להבטיח תנאים אחידים על פני ניסויים ולהימנע מצפיפות יתר, המספר הכולל של צאצאי F1 בבקבוקון אחד צריך להיות לא יותר מ 100. בהתאם לעיצוב הגנטי של הניסוי, לשמור בקבוקונים בחממה מתאימה עד השלב ההתפתחותי הרצוי.
- איסוף חיות ניסוי: תצטרך זחלים בוגרים ב-3 הזחלinstar (L3) בכ 110-120 שעות של פיתוח ולניתוחי זחל או לבן prepupa (WPP) לאחסון זמני גלמי מדויקים. שינויים דרמטיים מחזור תא, כוללים מתג למצב שאינו שגשוג מתרחשים בנקודתי זמן שונות במהלך המטמורפוזה 12,13. לכן היערכות נכונה של גולם (בשעה 1 של פיתוח) היא חיונית לנתונים בזמן מחזור תא לשעתק מטמורפוזה. WPP מתאים ל0 שעות לאחר היווצרות גולם (0 שעה APF) כפי שמוצג באיור 1, פנלי. לאסוף את WPP בצלחת פטרי 35 מ"מ בKimwipe מקופל רטוב עם 2.5 מ"ל של מים כדי לשמור על לחות מסוימת. גיל גולם עד שלב רצוי (שעות APF) בטמפרטורה מתאימה. שים לב שהפיתוח ממשיך 1.2 פעמים מהר יותר ב -29 מעלות צלזיוס, ופי 2.2 יותר לאט על 18 מעלות צלזיוס מאשר ב25 סטנדרטי ° C 14.
- בעלי חיים בחום הלם כדי להפעיל חום הלם flipase (HS-FLP) הנגרמת רקומבינציה לשושלת התחקות-שיבוטים במידת צורך 9,11. לחום ההלם של זחל, לטבולבקבוקונים באמבט מים (שנקבע על 37 מעלות צלזיוס) ולהבטיח זחלים שקועים באופן מלא. לחום ההלם של גולם, לאטום את צלחת פטרי עם Parafilm ומלואו להטביע אותו למי האמבטיה. הקפד להסיר Parafilm לאחר חום ההלם, כדי לאפשר חילופי מספיק חמצן להישרדות של בעלי החיים. משך חום ההלם תלוי בפעילות של transgene flipase שימוש, ומספר השיבוטים הרצויים. אנו משתמשים באופן שגרתי 7-8 דקות לגרימה "Flipout" שושלת התחקות שיבוטים 15 בזחלים עם transgene HS-FLP על כרומוזום הראשון ו2-4 דקות להלם חום של גלמים ב35 מנות מ"מ, ואילו transgene HS-FLP על כרומוזום השני דורש 20 דקות. הלם חום להשיג מספרים דומים של שיבוטים.
קצב חלוקת תאים והעיתוי של נתיחה קובע גודל שיבוט בכל רקמות. בתנאים רגילים, אנו מוצאים כי שיבוטים מושרה באגף הזחל עם הלם 20 דקות בחום (באמצעות transgene HS-FLP על כרומוזום השני) וdissecשעה טד 48 מאוחר יותר, מכיל כ 20-30 שיבוטים מופרדים היטב עם גדלים הנעים בין 10 תאים לשיבוט לשני תאים לשיבוט, עם ממוצע סביב ארבעה תאים לכל שיבוט. לעומת זאת, 7 דקות בחום הלם עם אותו HS-FLP transgene של גלמים בצלחת פטרי ב0 שעות APF גזורים 36 שעות מאוחר יותר, תשואות מופרדות שיבוטים היטב (כ 15-25) החל מאחד עד ארבעה תאים עם ממוצע של 2.2 תאים לכל שיבוט. נתונים כאלה יכולים לשמש כדי לקבוע את זמן הכפלת התא הממוצע לרקמות תחת מחקר.
2. בתור
- בעדינות להעביר את הזחלים / גלמים לצלחת לנתיחה זכוכית שקופה המכילה 1X PBS.
- השימוש במיקרוסקופ אור והשפע לנתח, בעדינות לתפוס זחל על ידי הבטן עם Inox חד # 5 מלקחיים, לחתוך שלישי הקדמי עם מיקרו מספריים, ולהפוך את השליש הקדמי על ידי לחיצה על מפסק אזור הפה לכיוון האחורי תוך החזקת הזחל ציפורן יציבה (איור 1 א). מוציא בזהירות opaquשומן בגוף דואר וכל שנותרה בטן כדי להגדיל את הנראות של רקמות רצויות, כגון כנף, העין או מוח. לנתח את הרקמות הרצויות; נקיה הסרת כנפיים מקנה הנשימה וציפורן עם מלקחיים, עיניים מהפה קרסים, או מוח מעיניים (איור 1G).
- ללנתח גולם; להשתמש מלקחיים לתפוס בעדינות גולם על ידי הקצה הקדמי של המקרה גלמי שבו יש בועת אוויר, כדי למנוע פגיעה בבתוך הגולם (איור 1 ג). מלקחיים או מיקרו מספריים ביד הנגדית יכולים לשמש כדי לעזור עמדת הגולם צף לאחיזה נכונה. לחתוך צורה נקיה דרך הקצה האחורי של הגולם עם מיקרו מספריים. לחתוך חתך זה צריך להיעשות בזווית קלה כלפי החלק הגבי של החיה, כדי לשחרר את הלחץ הפנימי מבלי לאלץ את שומן histolyzed לתוך הרקמות הרצויות בבית החזה והראש. לחתוך בזהירות לאורך החציון הגבי, הימנעות מהאגפים ומורכבים העין למוח הקדמי. להסיר בזהירות מגולם גלמימקרה על ידי אחיזה בקצה האחורי של האפידרמיס גלמי ומושכים אותו מהמקרה גלמי (1D איור). נקוב חור קטן בציפורן הקדמית למתחם העין למוח עם מלקחיים. שימוש בזכוכית פיפטה פסטר עם הנורה גומי, לשטוף בעדינות פתרון נתיחת PBS באמצעות הגולם גזור באופן חלקי כדי להסיר שומן histolyzed וכל רקמת מעי הנותרת. זה גם משמן את פיפטה הזכוכית עם שומנים וחלבונים, אשר מפחית את השכיחות של רקמות גזורים מלהידבק לחלק הפנימי של זכוכית פיפטה מאוחר יותר ביעילות.
- כדי להשיג כנפיים גלמי, הציפורן עוטפת האגף והאגף עצמו חייב להיות עקר מהגולם (איור 1E). ניתן לעשות זאת על ידי לחיצה רצוף על הגולם על ידי הראש עם מלקחיים אחד, תוך שימוש במלקחיים או אחר לתפוס את הקצה האחורי ביותר של ציפורן הכנף ותלישה או תמרון המלקחיים תחת חסותו בסמוך לצירים לפני פירוקו מהצד הפגר (Figure 1E). לאחר מכן ניתן לחתוך את הכנף או קרועה בציר כדי להסיר אותו מהגוף ולשים בערימה הרחק מהפגרים והחומר אחר.
- כדי להשיג את עיני גלמים או במוח, לשטוף את הגולם עד מתחם העין המוח הופך חלץ וחופשי מהגולם (איור 1F, 1H). באמצעות מלקחיים, בעדינות למשוך את העין גלמי מן המוח ולשמור את הרקמה הרצויה.
- אל תיקח יותר מ -45 דקות כדי לנתח כל מדגם, כפי שהתוצאות הופכת להיות פחות מדויקות התאים הארוכים יותר הם עזבו ב PBS לאחר שפתח את בעלי החיים.
3. רקמת דיסוציאציה ומכתים DNA
- באמצעות משומן פיפטה פסטר, להעביר את הרקמות גזורים בזהירות לתוך 0.5 מ"ל של פתרון כתם חי DNA בצינור קלקר 5 מ"ל (איור 1G). העברה כקטן PBS ככל האפשר (פחות מ 300 μl) לפתרון כתם ה-DNA, כדילול של טריפסין ימנע ניתוק רקמות.
- דגירה צינורות עם שאקיng ב 23 ° C ב 500 סל"ד (אנו משתמשים Thermomixer אפנדורף).
- דגירה במשך 70 דקות, ואז מערבולת בעדינות במשך 5 שניות במהירות בינונית (הגדרה של 5). vortexing המופרז יגרום שיבוש תא וצורה פסולות, ואילו תחת vortexing יוביל לגושי תאים. להחזיר את הדגימות לרעד ב23 ° C ב 500 סל"ד עבור 15 עד 20 דקות נוספות לפני vortexing עוד פעם אחת למשך 5 שניות במהירות 5.
- למוח ועיני גלמים מבוגרים יותר מאשר 36hAPF, נדרש פרוטוקול שונה. לנתק את הרקמות בפתרון כתם DNA ב 23 ° C ב 500 סל"ד במשך 45-60 דקות ב1.7 צינורות microcentrifuge מ"ל. ואז אחד על אחד לנתק באופן ידני נתחים גדולים של רקמה על ידי העברה לצלחת לנתח יחד עם כ -50 פתרון כתם DNA μl ומהיר pipetting למעלה ולמטה עם צוירה ידני פיפטה פסטר 16 (בסך של כ 100-150 פתיחת מיקרומטר). העבר את כל דגימה ניתקה עם שאר 0.5 מ"ל של פתרון כתם דנ"א לתוך צינור 5 מ"ל. דגירה 45 נוספים-30 דקות (עד 90 דקות של זמן דגירה סך הכל) בשעה 23 ° C עם הרועד בסל"ד עד 500 גושים כבר אינן נראים לעין.
- מלאות דגימות ניתק צריכים מעט מאוד נתחים גלויים גדולים של רקמה, אם כי שים לב שציפורן אגף גלמי השקוף acellular לא לנתק.
4. הזרימה cytometry
- הפעל cytometer לכוונן ולפתוח את התוכנה לכוונן. צריכים להיות מופעלים לייזרי cytometer על דרך תפריט האתחול, ומבחן ביצועים יומי צריכה להתבצע עם חרוזים מעקב אחר ביצועים עם ציונים נאותים לפני כל יום רכישת נתונים. מפלס הנוזל צריך להיות לפחות חצי מלא ופסולת התרוקנה לפני מבחן ביצועים. ניתן למצוא את פרטים לכיול אתחול, נכון ותפעול של לכוונן במדריך למשתמש של לכוונן (http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf)
- עיצוב טה חדשmplate על ידי יצירת 4 חלקות נקודה ו -2 histograms בסביבת עבודה ריקה עם הפרמטרים שצוינו ב4.3, או לבחור תבנית תוכננה בעבר מתאימה לניסוי, ולציין את מספר הדגימות שנאספו. אנו מספקים תבניות לכוונן (קבצים ב. פורמט מקבל) לניתוח מחזור תא תסיסנית לחיות עם Vybrant DyeCycle יולט וGFP או ביטוי RFP בנספח ט
- את התבניות שסופקו כוללות ארבע חלקות נקודה ושתי histograms עם הפרמטרים שצוינו באיור 2. ערוצים לאיתור כוללים: FSC וSSC - פיזור קדימה ופיזור בצד המציין גודל תא ומורכבות קרום, VL1 גובה (H), רוחב (W) ואזור () - עירור לייזר יולט המציין של מכתים יולט DyeCycle ה-DNA, וBL1 -- שטח כחול לייזר ערוץ 1, המציין GFP פלואורסצנטי. התבנית סיפק לניתוח RFP היא זהה לתבנית לניתוח ה-GFP, פרט לכך שהוא משתמש בערוץ הכחול לייזר 3 (BL3-), שהוא optimized לגילוי RFP.
- חלקות נקודה בתבניות יש שערים למגבילים את הניתוח לאוכלוסיות הרצויות ולהגביל את הגושים ופסולת מתא הניתוח (איור 2). שער 1 אינו כולל פסולת וגושים המבוססים על SSC לעומת FSC (איור 2 א). שער 2 לא כולל תאים בלא כתם, תאים אפופטוטיים תת G1 וגושים סלולריים המבוססים על זיהוי של גופיות (VL1Area לעומת VL1Width) (איור 2). שער 3 הוא שער נגזר, המקיף את התאים בתוך שערי 1 ו -2, ומזהה את ה-GFP (או RFP) תאים שליליים לעומת תוכן ה-DNA המבוסס על VL1Height (איור 2 ג). שער 4 הוא שער נגזר, המקיף את התאים בתוך שערי 1 ו -2, ומזהה את ה-GFP (או RFP) תאים חיוביים לעומת תוכן ה-DNA (איור 2 ג). חלקות נקודה של גודל תא כפי שנמדד על ידי ה-GFP (או RFP) לעומת פיזור קדימה (FSC) משמשות ליצירת גייטס 5 ו -6 (איור 2 ד). תוכן ה-DNA עלילת היסטוגרמות שתיים על ציר ה-X ותא הספירה על Y-AXIים לאוכלוסיות שהוגדרו על ידי שער 3 ושער 4. (איור 2E ו2F) יכול להיכלל גם Histograms לגודל תא אם תרצה בכך (לא מוצג). להיסטוגרמות גודל תא, צריכה להיות מוגדרות לאוכלוסיות גייטס 5 ו -6, FSC זוממות על ספירה על ציר y ציר ה-X ו.
- הגדרת הקלטה לעצור ב10,000 אירועי GFP חיוביים או RFP (זה יהיה 4 שער, השער הנגזר של שער 1, שער 2 והשער החיובי GFP או RFP). נע בין 6,000 - 10,000 אירועי GFP חיוביים היה באופן מסורתי במטרה לפרופילים באיכות פרסום 9,11. אנו מציעים להשתמש במינימום של 15 כנפיים או עיניים, שהם כ 50% GFP החיובי כדי להשיג מספיק שער 4 אירועים 10 לפרופילים באיכות גבוהות. עם זאת, השגנו בהצלחה נתונים ברורים לניתוח מחזור תא ראשוני מכמה כמו 6 כנפיים (איור 3 א). הגדר את עוצמת הקול לרכישת 300 μl, זה יהיה להשתמש בכ 460 μl בסך הכל דגימת 0.5 מ"ל. טאble 2 מציג את הגדרות סף ומתח המתאימות הניתנות בתבנית לדוגמא באיור 2.
- הפעל דגימות ברגישות רגילה או 100 μl / דקות ושיא רגישות. אנו מוצאים לא מעט הבדל בניתוח שלנו עם רמות הרגישות השונות. בשל התמקדות אקוסטית של תאים, cytometer זה יכול למדוד במדויק דגימות בספיקות גבוהות מאוד. שלא כמו cytometers המסורתי, אנו מוצאים שום פשרה נתונים על ידי רכישה במהירויות של עד 1,500 אירועים לשנייה. את קבצי הנתונים שנרשמו נוצרו על ידי התוכנה לכוונן נמצאים ב. פורמט FCS, שהוא תואם את רוב תוכנת מודלים מחזור התא.
5. ניתוח נתונים
- Histograms של גודל תא ואת תוכן ה-DNA של ה-GFP (או RFP) אוכלוסיות חיוביות ושליליות ניתן להשוות. הם יכולים להיות מרובד באופן ידני על ידי העתקה והדבקה באמצעות תוכנת Adobe Photoshop. אם ציר y מוגדר אוטומטי, ציר ה-Y יהיה בקנה מידה עם hספירת ighest עבור כל דגימה. כיסה שני גרפים עם סט ציר Y לautoscale יוצר שכבה של היסטוגרמות עם הצירים שנקבעו למקסימום הגלובלי עבור כל אוכלוסייה. זה מאפשר השוואה ויזואלית קלה לשינויים יחסיים במחזור התא בהדרגה, גם כאשר מספרים סלולריים כולל של ה-GFP החיובי ושליליות אוכלוסיות GFP הם לא שווי ערך (לדוגמה באיור 3). לחלופין, מותאם אישית ניתן להגדיר ציר ה-Y (אופציה ידנית ציר y) לערך קבוע עבור היסטוגרמות. במקרה זה ניתן להשוות את המספרים הסלולריים ביחס לשתי אוכלוסיות. כלכוונן משתמש בנפח מוגדר של מדגם לריצה, כימות מוחלטת של תאים לכל סיבוב, בכל שער עם אחוז האוכלוסייה הכוללת, ניתן לקבל מטבלת הנתונים הסטטיסטיים שנוצרה באופן אוטומטי בזמן הריצה בסביבת העבודה (לדוגמה באיור 3F ). ניתן גם מגרשים ושכבתיים histograms דוט בקלות בתוכנה לכוונן, פשוט על ידי גרירה ושחרור של מדגמים שונים מהתפריט קובץ בדואר דגימה ימינה לרחוב הגרף הרצוי של מדגם פתוח להשוואה. עם זאת לכיסוי אוכלוסיות מתוך מדגם יחיד (כלומר ה-GFP חיובי ושלילי GFP באותו המדגם), אנו משתמשים בפוטושופ.
- ניתן להשתמש בשתי שיטות כדי למצוא האחוזים יחסיים בשלבים שונים של מחזור התא לאוכלוסייה. שיטת הקירוב מסתמכת על אזורי הגדרת משתמש להתוות גבולות G1, S, G2 ופסגות G2>. שיטה זו מאפשרת הערכות מהירות וקלה של אחוזים בתוך האזורים המוגדרים על ידי משתמש (איור 3E). אנו קובעים אזורינו מבוססים על בדיקה ישירה עם תאי KC תסיסנית, שכותרתו לשלב-S באמצעות התאגדות Ethynyl-deoxyuridine (edu). השיטה השנייה משתמשת תוכנת מודלים צד שלישית להערכת חלוקת מחזור תא. אנחנו השתמשנו בתוכנת ModFitLT (ריטי בית תוכנה) למשל, באיור 3F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים 2 מציג תוצאות עבור נציג אגף מדגם הזחל, להביע GFP במחצית האחורית של הרקמה, תוך שימוש בתבנית ה-GFP סיפק. תוצאות דומות מתקבלות עם אותו סוג הרקמה ודפוס ביטוי למכרז באמצעות סיפק RFP התבנית (איור 3 א). את התבניות שסופקו והמתחים (טבלה 2) מתאימות לניתוח עיני זחל (איור 3), מוח וכנפיים, כמו גם עיניים גלמי, מוח (איור 3D) וכנפיים. Histograms של גודל תא יחסי הניתן על ידי קשירת קשר FSC לאוכלוסיות בשערי 5 ו 6 גם יכול להיות שנוצר (איור 3 ג). גייטס ייתכן שיצטרך להיות מותאם במקצת עקב הבדלים בגודל תא לרקמות או הבדלים בעוצמת הקרינה של ה-GFP שונה או transgenes RFP שונים. ניתן לעשות זאת תוך כדי ריצת נפח מבחן קטן של מדגם (50-100 μl), לפני שפגע שיא.
llowing ציר ה-Y (ספירות) למחזור התא או היסטוגרמות גודל תא לאוטומטי בקנה מידה (בסולם ציר y מוגדר אוטומטית) בתוכנה לכוונן, תוצאות בהיסטוגרמות מראות את המקסימום הגלובלי עבור כל אוכלוסייה. מופעי 3B-3D איור תוצאות נציג עם GFP החיובי ושליליים היסטוגרמות GFP עם ציר y מוגדר למקסימום הגלובלי עבור כל אוכלוסייה. הגדרת מקסימום ציר y ספציפי (בסולם ציר y מוגדר לשימוש עם ערך מוגדר על ידי משתמש), מאפשרת השוואה של מספרים מוחלטים בין אוכלוסיות, שיכול להיות שימושית להשוואת מחירי הפצה, אבל עושה את זה קשה להשוות בין מחזור התא בהדרגה כאשר מספרים של אוכלוסיות תאי GFP חיוביים לעומת שלילי תאי GFP הם שונים בהרבה.
איור 3 ב מציג פרופילי מחזור תא בתאים חיוביים ושליליים GFP בעיני זחל, להביע GFP באחורי באמצעות-Gal4 GMR, transgenes כטב"מ-GFP. הכיסוי חושף את ההבדלים בעמ מחזור התאhasing של GFP האחורי לבטא בתאים. איור 3C מראה את השינוי היחסי בגודל תא בין תאים חיוביים ושליליים GFP בב ', על ידי התוויית גודל תא, כפי שנמדד על ידי FSC. איור 3D מציג פרופיל מחזור תא ממוח של גלמים ב46h APF. תאי GFP חיוביים הם שיבוטים שושלת התחקות מבטאים את הרגולטורים G1-S cyclin D ו E2F שישבש קפאון ולהוביל לכניסת ה-S-שלב, שמסומן על ידי החץ האדום ואושרו על ידי תיוג שלב-S עם שילוב של EDU (איור 3D הבלעה). זאת בניגוד לתאים שאינם השליליים מבטא-GFP, אשר בשלב זה בדרך כלל נעצרו בG1 (זכר שחור, איור 3D).
רוב פרופילי מחזור תא נמצאים בשימוש כדי להשיג מידע על האחוזים של אוכלוסייה בשלבי מחזור תא שונים. זה יכול להיות מקורב בתוכנה לכוונן על ידי יצירת אזורי הגדרת משתמש ביסטוגרמות המתארים G1, S ו-G2 שלבים (<חזק> איור 3E). התוכנה לכוונן באופן אוטומטי טבלת הנתונים הסטטיסטיים עבור כל ריצה, נותנת את הספירה מוחלטת של תאים בתוך אזורים מוגדרים המשתמש ואחוזים (איור 3F). שיטה זו פועלת היטב כאשר משווה את השינויים יחסיים בשלב החלוקה בין אוכלוסיית ניסוי ובקרה. לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנת מודלים להעריך אחוזים בכל שלב, כמו גם תאים אפופטוטיים. אנחנו השתמשנו ModFitLT (ריטי בית תוכנה) באיור 3G, אשר יכול ישירות לפתוח את קבצי הנתונים של FCS. נוצרו על ידי התוכנה לכוונן.
איור 1. נתיחה ובימוי של רקמות זחל וגלמים. Dissection א 'של זחלים (גנוטיפ של W 1118 מוצג) ב 110שעות של פיתוח מראים השלישית הקדמי לפני (למעלה) ואחרי (למטה) היפוך. ראש החץ לבן מצביע על כנף הצמודה לציפורן הזחל וראש חץ אדום מציינת את המיקום של כנפי B. המוח (ראש החץ לבן; אגף שמאלי בלבך מצורף לדיסק רגל, כנף בימין קרועה בnotum הגב), עיניים (צהוב) והמוח (אדום) הוסר מהזחלים. Dissection ג גולם מראה עמדות של קיצוצים עם מלקחיים שהוצבו במרחב האווירי הקדמי לראש (קווים מקווקווים אדומים) ד פופה הוסרה מציפורן לפני הכביסה כדי להסיר שומן ומעיים . א ניקה גולם מראה תהליך של הרמת כנפיים להסרת פ ניקה גולם מראה כנפיים (מנוקד) באופן חלקי והוציא את העין למוח מורכב (ראשי חץ אדומים וצהובים). ג'גזור כנפיים ועיניים מראות פיפטה להעברת זחל. ח'גזור לאחר mitotic גלמי העין למוח מורכב. I. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. ניתוח נציג מחזור תא של רקמות להביע GFP באמצעות יולט DyeCycle Vybrant ולכוונן. סביבת עבודה של נציג, המכיל 4 מגרשי נקודה ו -2 histograms מוצג למדגם כנף הזחל להביע GFP וcyclin D בכנף האחורית, מונע על ידי engrailtransgene. עלילת נקודת א 'אד-Gal4 של גודל תא עם שער 1 להוציא פסולת וגושים. עלילת נקודת B. להפלות גופיות עם שער 2 להוציא תאים בלא כתם, תוכן ה-DNA תת G1 (אפופטוזיס), וגושים. ג עלילת נקודה של ה-GFP לעומת תוכן ה-DNA. GFP שלילי (שער 3) והחיוביים (שער 4) תאים יכולים להיות מכובדים ו2N ותוכן ה-DNA 4N ניכר בהתבסס על מיקום לאורך ציר x. עלילת ד דוט של גודל תא כפי שנמדד על ידי ה-GFP לעומת פיזור קדימה (FSC) כדי ליצור גייטס 5 ו -6. שים לב שהתאים בתוך Gate1 הם בצבע אדום לקבלת סיוע ויזואלי בקביעת השערים 5 ו -6 לעלילת פיזור זה. היסטוגרמה ה-DNA של תוכן לעומת ספירה לGFP או RFP שלילי (אוכלוסייה מוגדרת שער 3). היסטוגרמה פ של תוכן ה-DNA לעומת ספירה לGFP או RFP חיובי (אוכלוסייה מוגדרת שער 4). Histograms יכול להיכלל גם לגודל תא אם תרצה בכך. להיסטוגרמות גודל תא, שאול אוכלוסיותד להיות מוגדר גייטס 5 ו -6. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. היסטוגרמות נציג של מחזור תא וניתוח גודל תא לשלבי התפתחות שונים וברקמות. () נתוני היסטוגרמה נציג מוצגים להשוואה בין מחזור תא בתאים מסוגים ספציפיים באמצעות ביטוי RFP עם DyeCycle יולט (עלילת פיזור מופעי הבלעה של תוכן RFP הקרינה לעומת DNA ). דוגמה זו מכילה כנפי זחל להביע RFP באחורי, מונע על ידי transgene engrailed-Gal4. (ב ') בשכבות של היסטוגרמות GFP החיוביות לעומת שליליות GFP DNA של תוכן בעיני זחל עם ביטוי של GFP מונעות על ידי יחסי ציבור GMR-Gal4omoter 17, שהוצג רוב תאי GFP חיוביים בG1. (ג) גודל תא יחסית קטן יותר של GMR מונע GFP בתאים + בהשוואה ל-GFP, בקרות, כפי שהיא נמדדת על ידי פיזור קדימה באמצעות גייטס 5 ו -6. (ד ') במוח גלמי, GFP חיובי תאים מצביעים על חום הלם מושרה שושלת שיבוטים התחקות דרך FLP-out שיטה 5 גרמה במהלך 2 nd הזחל instar, מעל להביע-G1-S במחזור תא הרגולטורים cyclin D ו E2F, גורמים לכניסת ה-S-שלב סוטה (חץ אדום) ב G1 בדרך postmitotic נעצר רקמות. כניסת S-השלב נורמלי שנצפתה על ידי cytometry הזרימה אושרה על ידי שילוב של אדו, המתייג את התאים בשלב-S (הבלעה). (E) דוגמה של אזורים המשמשים לאומדן האחוזים יחסיים בG1, S ו-G2 שלבים. גבולות נאמדו בהתבסס על שילוב ה-S-שלב של edu בתאים תסיסנית בניסוי נפרד. (F) דוגמה לסטטיסטיקה טבלה שנוצרה על ידי Attunתוכנת דואר המציגה האחוזים יחסיים באזורים המוגדרים. (G) דוגמה של מחזור תא דוגמנות של נתונים לכוונן באמצעות נציג ModFitLT. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ניתוח של מחזור התא, גודל תא יחסי ומספר תא היחסי ברקמות חיים תסיסנית בשלבי התפתחות שונים. כאשר ניתוח זה הוא בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי או שושלת התחקות, ניתן לקבל מידע מפורט על תגובות הסלולר מחזור תא דיסקרטי או הפרעות צמיחה. כהוכחה של עיקרון, אנחנו שיבשו קפאון במוח זבוב גלמי בהבעת רגולטורים מחזור תא G1-S בשיבוטי תא שכותרתו GFP, מה שמוביל לשכפול הדנ"א חריג בשלב ההתפתחותי שבי תאי מוח הם בדרך כלל מעל 90% G1 נעצר (איור 3D) .
עם זאת יש כמה מגבלות חשובות לשיטת ניתוח מחזור זה תא חי. ראשית, אף אחד לא יכול להבחין בין תאים בשלבים השונים של מיטוזה באמצעות הפרוטוקול שתואר כאן. כך, הניתוח שתואר כאן יש להשלים עם IMMמכתים unofluorescence לסמן mitotic, כגון H3 18 Ser10-phosphorylated היסטון לכמת מדד mitotic ברקמות של עניין. בנוסף השיטה המתוארת כאן אינו יכול להבחין בין התאים בG1 לעומת מעצר G0, כמו שיש לי שתי המדינות באותו תוכן ה-DNA. מאז ויולט DyeCycle הוא נלקח על ידי תאי חיים, זיהוי של תאים בשלבים מאוחר יותר אפופטוטיים גם הוא מוגבל. לבסוף, חשוב לציין שמדידות של גודל תא המבוססים על פיזור קדימה הן מדידות גודל תא יחסיות ולא מוחלטת כימות של גודל. לכימות מוחלטת של גודל תא אנו ממליצים על גישת נפחית כמו זה המשמש במונה קולטר (Beckman Coulter).
כאשר שלב מחזור התא ונתונים גודל הוא בשילוב עם שושלת התחקות למדוד זמן הכפלת תא, מידע מפורט על מחזור התא וניתן לחשב צמיחה, כגון אורכו של ה-G1, S ו-G2 שלבים ושיעור צמיחת תאים 9,11 in vivo יכול לספק מידע מפורט על מחזור תא ורגולציה צמיחה למחזור, צמיחת תאי תא כמותי ודוגמנות המורפוגנזה רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לאאידה דה לה קרוז לפיתוח והוראת הפרוטוקול המקורי לגרסה זו מבוססת 10. לעבוד במעבדה Buttitta נתמך על ידי מענק NIH GM086517.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
||||||||||||||||||
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
