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Biology

का लाइव सेल चक्र विश्लेषण doi: 10.3791/50239 Published: May 19, 2013
* These authors contributed equally

Summary

जीने की सेल चक्र विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल

Abstract

प्रवाह cytometry व्यापक रूप से अलग सेल चक्र के चरणों में रिश्तेदार प्रतिशत अनुमान करना, कोशिकाओं की आबादी में डीएनए सामग्री के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस तकनीक को सफलतापूर्वक विवो में सेल चक्र विनियमन के आनुवंशिक अध्ययन के लिए मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर mitotic ऊतकों के लिए बढ़ा दिया गया है. सेल प्रकार विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति और आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ युग्मित है, एक सेल नंबर, सेल आकार और इन विवो में चरणबद्ध सेल चक्र पर प्रभाव के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त कर सकते हैं. हालांकि इस रहते सेल पद्धति एक यूवी लेजर के साथ सुसज्जित प्रवाह cytometers करने के लिए उपयोगकर्ताओं को सीमित करने, सेल पारगम्य Hoechst 33342 डीएनए intercalating डाई के प्रयोग पर भरोसा है. हम और अधिक सामान्य बैंगनी 405nm लेजर के साथ संगत एक नए रहने कक्ष डीएनए डाई, Vybrant DyeCycle वायलेट, उपयोग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सेल के साथ मिलकर कुशल सेल चक्र विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैड्रोसोफिला ऊतकों की एक किस्म में टाइप करें, रिश्तेदार सेल आकार और सेल नंबर जानकारी,. इस प्रोटोकॉल एक एकल प्रयोगशाला पैमाने पर चलाने के लिए और बनाए रखा जा सकता है जो एक छोटे से benchtop विश्लेषक के लिए जीना ड्रोसोफिला ऊतकों के लिए उपयोगी सेल चक्र विश्लेषण तकनीक, Attune ध्वनिक केंद्रित cytometer, फैली हुई है.

Introduction

प्रवाह cytometry सेल व्यवहार्यता, रिश्तेदार सेल आकार, डीएनए सामग्री और जीने सेल आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एस चरण, कोशिकाओं की आबादी में डीएनए सामग्री के बारे में जानकारी के दौरान परमाणु डीएनए की प्रतिकृति के कारण अलग सेल चक्र के चरणों में 1-3 के सापेक्ष प्रतिशत अनुमान किया जा सकता है. इस विधि खमीर से स्तनधारियों के लिए मॉडल प्रणाली में सेल चक्र विश्लेषण का एक आधार बन गया है.

फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर कोशिका चक्र विनियमन के vivo विश्लेषण में आनुवंशिक के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली बन गया है. मक्खियों में उपलब्ध व्यापक आनुवंशिक उपकरण विवो फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित वंश में 4-6 ट्रेसिंग के साथ सेल चक्र नियामकों के सुरुचिपूर्ण ऊतक विशिष्ट और अस्थायी विनियमित जोड़तोड़ के लिए अनुमति देते हैं. प्रवाह cytometry endorepl सहित, ड्रोसोफिला सेल प्रकार के एक नंबर में डीएनए सामग्री का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैकोशिकाओं और सुसंस्कृत mitotic कोशिकाओं 7,8 icating. विवो कोशिका चक्र के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण अग्रिम रहते द्विगुणित ड्रोसोफिला imaginal डिस्क 9,10 के प्रवाह cytometric विश्लेषण, कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया और अनुकूलित किया गया है जो एक प्रोटोकॉल के लिए एक प्रोटोकॉल के विकास के साथ, डी ला क्रूज़ और एडगर द्वारा किया गया था. Inducible फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति और ऊतक विशिष्ट लेबलिंग के माध्यम से अनुरेखण विवो वंश में आनुवंशिक के साथ मिलकर जब इस तकनीक, विवो 9 में एक समग्र सेल दुगनी होने का समय, सेल आकार पर जीन हेरफेर के प्रभाव के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए और सेल चक्र के चरणों की सटीक समय निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है , 11. हालांकि इस विधि इस प्रकार अब तक उपयोगकर्ताओं को रोमांचक Hoechst डाई करने में सक्षम एक यूवी लेजर के साथ cytometers प्रवाह को सीमित कर दिया है जो जीवित कोशिकाओं में डीएनए दाग और यों के लिए सेल का उपयोग पारगम्य Hoechst 33342 डीएनए intercalating डाई पर भरोसा है. ये आम तौर पर केवल sorters (यानी बी.डी. FACS Vanta में पाए जाते हैंजीई, बी.डी. FACSAria) या महंगा बहुरंगा benchtop सिस्टम (यानी बी.डी. एलएसआर), संस्थागत प्रवाह कोर सुविधाओं से आम तौर पर की आवश्यकता का समर्थन है.

हम Invitrogen, Vybrant DyeCycle वायलेट से एक नई रहने कक्ष डीएनए डाई का उपयोग करने Hoechst आधारित प्रोटोकॉल को संशोधित किया है. यह डाई अधिक छोटे benchtop analyzers में आम और छोटे घुन्ना benchtop विश्लेषक, cytometer केंद्रित Attune ध्वनिक में उपलब्ध एक बैंगनी 405 एनएम लेजर, के साथ संगत है. यहाँ हम DyeCycle वायलेट और Attune उपयोग कर विकास के विभिन्न चरणों के दौरान सेल प्रकार, सेल आकार, सेल नंबर और ड्रोसोफिला ऊतकों की एक किस्म में वंश विश्लेषण के साथ मिलकर किया जा सकता है कि सेल चक्र विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला ऊतकों के साथ इस तरह के विश्लेषण के लिए उपयुक्त cytometers की संख्या बढ़ती है और जीवित कोशिका चक्र विश्लेषण के इस प्रकार के अतिरिक्त प्रकार के ऊतकों और विकास के चरणों के लिए संशोधित किया जा सकता है के उदाहरण प्रदान करता है.

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Protocol

1. पशुपालन फ्लाई

  1. क्रॉस 10 मिलीलीटर खमीर ग्लुकोज मध्यम 3 या अपनी पसंद की अन्य प्रोटीन युक्त मीडिया के साथ संकीर्ण प्लास्टिक की शीशियों में वांछित जीनोटाइप की मक्खियों. विवो फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ अनुरेखण ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति और वंश के लिए उपलब्ध व्यापक ड्रोसोफिला ट्रांसजेनिक उपकरण कहीं 4,5 विस्तार से वर्णित हैं. 24 घंटा संतान संग्रह की श्रृंखला प्राप्त करने के लिए दैनिक ताजा शीशियों के लिए माता - पिता स्थानांतरण, या अधिक सटीक मंचन के लिए, अगर प्लेटों पर भ्रूण इकट्ठा करने और 10 में वर्णित के रूप में शीशियों को नव रची लार्वा हस्तांतरण. प्रयोगों में समान शर्तों को सुनिश्चित करने और भीड़भाड़ से बचने के लिए एक एकल शीशी में F1 संतान की कुल संख्या से अधिक नहीं 100 से अधिक होना चाहिए. प्रयोग की आनुवंशिक डिजाइन पर निर्भर करता है, वांछित विकास मंच तक एक उपयुक्त इनक्यूबेटर में शीशियों रखना.
  2. प्रायोगिक पशुओं लीजिए: आप 3 लार्वा में परिपक्व लार्वा की आवश्यकता होगीसही पोटा संबंधी मंचन के लिए लार्वा विच्छेदन या सफेद prepupa (WPP) के लिए विकास के 110-120 के बारे घंटा पर instar (L3). एक गैर proliferative राज्य के लिए एक स्विच सहित नाटकीय सेल चक्र परिवर्तन, कायापलट 12,13 दौरान अलग timepoints पर पाए जाते हैं. प्यूपा की इसलिए सही मचान (विकास की 1 घंटा के भीतर) कायापलट दौरान प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल चक्र डेटा के लिए आवश्यक है. चित्र 1 में दिखाया के रूप में WPP (0 घंटा APF) प्यूपा गठन के बाद 0 घंटे से मेल खाती है, पैनल मैं. कुछ नमी बनाए रखने के लिए पानी की 2.5 मिलीलीटर के साथ गीला एक जोड़ Kimwipe पर एक 35 मिमी पेट्री डिश में WPP लीजिए. उम्र प्यूपा तक उचित तापमान पर मंच (घंटे APF) वांछित. विकास 29 में 1.2 गुना तेजी से आगे बढ़ती है कि नोट 18 की उम्र में अधिक धीरे डिग्री सेल्सियस और 2.2 गुना ° मानक 25 डिग्री सेल्सियस 14 में से सी.
  3. 9,11 अगर जरूरत क्लोन वंश अनुरेखण के लिए गर्मी झटका flipase (एच एस-FLP) प्रेरित पुनर्संयोजन सक्रिय करने के लिए गर्मी झटका जानवरों. लार्वा, विसर्जित की गर्मी झटका के लिएएक पानी स्नान (37 डिग्री सेल्सियस पर सेट) और लार्वा सुनिश्चित में शीशियों पूरी तरह से डूबे हुए हैं. प्यूपा की गर्मी झटका के लिए, Parafilm और पूरी तरह से डूब यह पानी के स्नान में साथ पेट्री डिश सील. पशु जीवित रहने के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन विनिमय की अनुमति, गर्मी झटका के बाद Parafilm के दूर करने के लिए सुनिश्चित करें. गर्मी झटका की अवधि flipase इस्तेमाल किया transgene है और वांछित क्लोन की संख्या की गतिविधि पर निर्भर करता है. हम नियमित रूप से एच एस-FLP transgene है जबकि पर, एच एस-FLP पहले गुणसूत्र पर transgene है और 35 मिमी व्यंजन में pupae की गर्मी सदमे के लिए 2-4 मिनट के लार्वा में क्लोन 15 अनुरेखण वंश "FLIPOUT" उत्प्रेरण के लिए 7-8 मिनट का उपयोग दूसरी गुणसूत्र एक 20 मिनट की आवश्यकता है. गर्मी झटका क्लोन के समान संख्या प्राप्त करने के लिए.

कोशिका विभाजन और विच्छेदन के समय की दर प्रत्येक ऊतक में क्लोन आकार निर्धारित करता है. सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत, हम क्लोन एक 20 मिनट गर्मी झटका (दूसरे गुणसूत्र पर एच एस-FLP transgene का उपयोग) और dissec साथ लार्वा विंग में प्रेरित लगता है किटेड 48 घंटे बाद, क्लोन प्रति चार कोशिकाओं के चारों ओर एक औसत के साथ, क्लोन प्रति 10 सेल से क्लोन प्रति दो कोशिकाओं से लेकर आकार के साथ लगभग 20-30 अच्छी तरह से अलग क्लोन होते हैं. इसके विपरीत, 0 घंटा APF पर एक पेट्री डिश में pupae से ही एच एस-FLP transgene के साथ एक 7 मिनट गर्मी झटका 36 घंटा बाद विच्छेदित, पैदावार अच्छी तरह से एक औसत के साथ एक से चार कोशिकाओं से लेकर (लगभग 15-25) क्लोन अलग क्लोन प्रति 2.2 कोशिकाओं की. इस तरह के डेटा का अध्ययन किया जा ऊतक के लिए औसत सेल दुगनी होने का समय निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. विच्छेदन

  1. धीरे 1X पीबीएस युक्त एक स्पष्ट गिलास विच्छेदन पकवान लार्वा / pupae हस्तांतरण.
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप और पर्याप्त प्रकाश का प्रयोग, धीरे, एक तेज आईनॉक्स # 5 forcep के साथ पेट से एक लार्वा समझ सूक्ष्म कैंची के साथ पूर्वकाल तिहाई कटौती, और लार्वा धारण करते हुए पीछे की ओर मुंह क्षेत्र अंदर की ओर धक्का द्वारा पूर्वकाल तीसरे पलटना छल्ली स्थिर (चित्रा 1 ए). ध्यान opaqu हटानेई वसा शरीर और इस तरह के पंख, आँख या मस्तिष्क के रूप में वांछित ऊतकों की दृश्यता बढ़ाने के लिए किसी भी शेष पेट. वांछित ऊतकों काटना, सफाई से संदंश, मुंह हुक से आँखें, या आँखें (चित्रा 1G) से मस्तिष्क के साथ ट्रेकिआ और छल्ली से पंख हटा.
  3. प्यूपा विदारक के लिए, प्यूपा के अंदर (चित्रा 1C) को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए, एक हवा का बुलबुला है, जहां धीरे पोटा संबंधी मामले की पूर्वकाल टिप द्वारा एक प्यूपा काबू करने के लिए एक forcep का उपयोग करें. विरोध हाथ में चिमटा या सूक्ष्म कैंची उचित लोभी के लिए स्थिति चल प्यूपा में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सफाई से सूक्ष्म कैंची से प्यूपा के पीछे टिप के माध्यम से काटा. इस पार के अनुभागीय कटौती छाती और सिर में वांछित ऊतकों में histolyzed वसा मजबूर बिना आंतरिक दबाव जारी करने के लिए, जानवर के पृष्ठीय भाग की ओर एक मामूली कोण पर किया जाना चाहिए. पंख और पूर्वकाल आंख मस्तिष्क जटिल से परहेज, पृष्ठीय मंझला साथ सावधानी से काटें. ध्यान से पोटा संबंधी से प्यूपा को दूरपोटा संबंधी epidermis के पीछे बढ़त लोभी और पोटा संबंधी मामले (चित्रा -1) से बाहर खींच कर मामला. संदंश के साथ आंख मस्तिष्क जटिल को छल्ली पूर्वकाल में एक छोटा सा छेद प्रहार. एक रबर बल्ब के साथ एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे histolyzed वसा और किसी भी शेष पेट के ऊतकों को हटाने के लिए आंशिक रूप से विच्छेदित प्यूपा के माध्यम से पीबीएस विच्छेदन समाधान धो लो. यह भी प्रभावी ढंग से बाद में कांच विंदुक के इंटीरियर के लिए चिपके से विच्छेदित ऊतकों की घटनाओं को कम कर देता है जो लिपिड और प्रोटीन के साथ कांच विंदुक lubricates.
  4. पोटा संबंधी पंख प्राप्त करने के लिए, छल्ली विंग घेर और दक्षिणपंथी ही प्यूपा (चित्रा 1E) से pried किया जाना चाहिए. इस की ओर से यह dislodging से पहले या तो विंग छल्ली की सबसे पीछे टिप काबू करने के लिए एक और forcep का उपयोग करने और बाहर खींच या काज के पास पंखों के नीचे forcep maneuvering जबकि एक forcep के साथ सिर से प्यूपा दबाए रख कर किया जा सकता है शव (एफigure 1E). विंग फिर कटौती या शरीर से निकाल और दूर शवों और अन्य सामग्री से एक ढेर में डाल करने काज में फाड़ा जा सकता है.
  5. आंख मस्तिष्क जटिल उखाड़ फेंकना है और प्यूपा (चित्रा 1F, 1h) से मुक्त हो जाता है जब तक पोटा संबंधी आँखें या मस्तिष्क को प्राप्त करने के लिए, प्यूपा धो लो. एक forcep का प्रयोग, धीरे मस्तिष्क से दूर पोटा संबंधी आंख खींचने के लिए और वांछित ऊतक बचा.
  6. परिणाम अब कोशिकाओं जानवरों को खोलने के बाद पीबीएस में छोड़ दिया जाता है कम सटीक हो जाता है, के रूप में प्रत्येक नमूने के टुकड़े करने के लिए 45 मिनट से अधिक समय तक नहीं ले जाते.

3. ऊतक हदबंदी और डीएनए धुंधला

  1. एक चिकनाई पाश्चर विंदुक का प्रयोग, ध्यान से एक 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब (चित्रा 1G) में लाइव डीएनए दाग समाधान के 0.5 मिलीलीटर में विच्छेदित ऊतकों हस्तांतरण. डीएनए दाग समाधान में संभव के रूप में छोटे पीबीएस के रूप में स्थानांतरण (कम से कम 300 μl), trypsin के कमजोर पड़ने के रूप में ऊतक हदबंदी को बाधित करेगा.
  2. Shaki साथ ट्यूब सेतेएनजी 23 से कम 500 आरपीएम (हम एक Eppendorf Thermomixer उपयोग) डिग्री सेल्सियस.
  3. एक मध्यम गति (5 की स्थापना) में 5 सेकंड के लिए धीरे फिर भंवर में 70 मिनट के लिए सेते हैं. अंडर vortexing सेल clumps को बढ़ावा मिलेगा, जबकि अत्यधिक vortexing, सेल विघटन और फार्म मलबे का कारण होगा. 23 में मिलाने के लिए नमूने लौटें ° गति 5 में 5 सेकंड के लिए एक बार फिर उन्हें vortexing से पहले एक अतिरिक्त 15 से 20 मिनट के लिए 500 rpm पर सी.
  4. दिमाग और 36hAPF से अधिक पुराने पोटा संबंधी आंखों के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में 45-60 मिनट के लिए 500 rpm पर 23 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए दाग समाधान में ऊतकों को अलग कर देना. फिर एक ने एक मैन्युअल के बारे में 50 μl डीएनए दाग समाधान और तेजी से एक मैन्युअल तैयार पाश्चर पिपेट 16 (लगभग 100-150 माइक्रोन खोलने के) के साथ ऊपर और नीचे pipetting साथ विदारक पकवान को स्थानांतरित करके ऊतक का बड़ा हिस्सा अलग कर देना. एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में डीएनए दाग समाधान के 0.5 मिलीलीटर के बाकी के साथ एक अलग नमूना स्थानांतरण. एक अतिरिक्त 45 सेते23 -30 मिनट (कुल ऊष्मायन समय के 90 मिनट) ° 500 rpm पर झटकों के साथ सी झुरमुटों तक नहीं रह दिखाई दे रहे हैं.
  5. नोट अकोशिकीय पारदर्शी पोटा संबंधी विंग छल्ली अलग कर देना नहीं होगा कि हालांकि पूरी तरह से अलग नमूने, ऊतक का बहुत कुछ बड़े दिखाई हिस्सा होना चाहिए.

4. फ्लो

  1. Attune cytometer पर मुड़ें और Attune सॉफ्टवेयर खुला. कोशिकामापी लेज़रों स्टार्टअप मेनू के माध्यम से चालू किया जाना चाहिए, और एक दैनिक प्रदर्शन परीक्षण डाटा अधिग्रहण के प्रत्येक दिन के पहले पर्याप्त स्कोर के साथ प्रदर्शन ट्रैकिंग मोती के साथ किया जाना चाहिए. तरल पदार्थ का स्तर कम से कम आधा भरा और प्रदर्शन के परीक्षण से पहले खाली बेकार होना चाहिए. Attune की स्टार्टअप, उचित अंशांकन और ऑपरेशन के लिए विवरण Attune उपयोगकर्ता गाइड (में पाया जा सकता है http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
  2. एक नए ते डिजाइनमापदंडों 4.3 में संकेत के साथ एक खाली कार्यक्षेत्र में 4 डॉट भूखंडों और 2 हिस्टोग्राम बनाकर mplate, या प्रयोग के लिए उपयुक्त एक पहले बनाया गया टेम्पलेट का चयन करें, और एकत्र होने के लिए नमूनों की संख्या से संकेत मिलता है. हम Vybrant DyeCycle वायलेट और GFP या परिशिष्ट मैं में आरएफपी अभिव्यक्ति के साथ रहते ड्रोसोफिला सेल चक्र विश्लेषण के लिए Attune टेम्पलेट (. पाने के प्रारूप में फाइल) प्रदान की है
  3. प्रदान की टेम्पलेट्स चित्रा 2 में संकेत दिया मानकों के साथ चार डॉट भूखंडों और दो ​​हिस्टोग्राम शामिल हैं. पता लगाने के लिए चैनल शामिल हैं: FSC और एसएससी - सेल आकार और झिल्ली जटिलता, VL1 ऊंचाई (एच), चौड़ाई (डब्ल्यू) और क्षेत्र (ए) का संकेत आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर - DyeCycle वायलेट धुंधला का संकेत है वायलेट लेजर उत्तेजना डीएनए, और BL1 ए - GFP प्रतिदीप्ति का संकेत ब्लू लेजर चैनल 1 क्षेत्र,. आरएफपी के विश्लेषण के लिए प्रदान की टेम्पलेट यह optimi है जो ब्लू लेजर चैनल 3 (BL3-ए), का उपयोग करता है, सिवाय इसके कि GFP के विश्लेषण के लिए टेम्पलेट के समान हैआरएफपी का पता लगाने के लिए जेड.
  4. टेम्पलेट्स में डॉट भूखंडों वांछित आबादी के विश्लेषण को प्रतिबंधित करने और विश्लेषण (चित्रा 2) से मलबे और सेल clumps सीमित करने के लिए द्वार है. 1 गेट मलबे और एसएससी बनाम FSC (2A चित्रा) पर आधारित झुरमुटों शामिल नहीं है. गेट 2 singlets (VL1Area बनाम VL1Width) (चित्रा 2 बी) की पहचान पर आधारित बेदाग कोशिकाओं, उप G1 के apoptotic कोशिकाओं और सेल clumps शामिल नहीं है. गेट 3 फाटकों 1 और 2 के भीतर कोशिकाओं को शामिल, एक व्युत्पन्न गेट है, और GFP (या आरएफपी) नकारात्मक कोशिकाओं बनाम VL1Height (चित्रा -2) के आधार पर डीएनए सामग्री को दिखाता है. गेट 4 फाटकों 1 और 2 के भीतर कोशिकाओं को शामिल, एक व्युत्पन्न गेट है, और GFP (या आरएफपी) डीएनए सामग्री (चित्रा -2) बनाम सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान करता है. GFP (या आरएफपी) बनाम आगे तितर बितर (FSC) द्वारा मापा के रूप में सेल आकार की बिंदी भूखंडों गेट्स 5 और 6 (चित्रा 2 डी) उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. वाई AXI पर एक्स अक्ष और कोशिकाओं की संख्या पर दो हिस्टोग्राम साजिश डीएनए सामग्रीगेट 3 और गेट 4 द्वारा परिभाषित आबादी के लिए है. अगर वांछित (चित्रा 2 ई और 2 एफ) Histograms भी () नहीं दिखाया सेल आकार के लिए शामिल किया जा सकता है. सेल आकार हिस्टोग्राम के लिए, आबादी एक्स अक्ष और y-अक्ष पर मोर्चों पर एफएससी की साजिश रचने, गेट्स 5 और 6 के लिए सेट किया जाना चाहिए.
  5. 10,000 GFP या आरएफपी सकारात्मक घटनाओं (इस गेट 4, 1 गेट के व्युत्पन्न गेट, गेट 2 और GFP या आरएफपी सकारात्मक फाटक हो जाएगा) पर रोक रिकॉर्डिंग सेट करें. 6000 से सीमाओं - 10,000 GFP सकारात्मक घटनाओं को पारंपरिक प्रकाशन गुणवत्ता प्रोफाइल के 9,11 के लिए लक्ष्य दिया गया है. हम उच्च गुणवत्ता वाले प्रोफाइल के लिए 4 घटनाओं 10 पर्याप्त गेट प्राप्त करने के लिए सकारात्मक लगभग 50% GFP हैं कि 15 पंखों या आंखों की एक न्यूनतम का उपयोग कर सुझाव देते हैं. हालांकि, हमने 6 पंख (चित्रा 3) के रूप में कुछ से प्रारंभिक सेल चक्र विश्लेषण के लिए स्पष्ट डेटा प्राप्त किया है. 300 μl के लिए अधिग्रहण की मात्रा निर्धारित करें, इस कुल 0.5 मिलीलीटर नमूने के 460 μl के बारे में प्रयोग करेंगे. टाble 2 चित्रा 2 में उदाहरण के लिए टेम्पलेट में प्रदान की उचित सीमा और वोल्टेज सेटिंग्स को दिखाता है.
  6. मानक संवेदनशीलता या 100 μl / मिनट और रिकॉर्ड संवेदनशीलता उच्च पर नमूने चलाएँ. हम अलग अलग संवेदनशीलता के स्तर के साथ हमारे विश्लेषण में कोई अंतर नहीं करने के लिए थोड़ा लगता है. कोशिकाओं का ध्यान केंद्रित ध्वनिक के कारण, इस कोशिकामापी सही बहुत उच्च प्रवाह दरों पर नमूने उपाय कर सकते हैं. पारंपरिक cytometers के विपरीत, हम प्रति सेकंड 1500 की घटनाओं के लिए गति पर प्राप्त करने से कोई डेटा समझौता पाते हैं. Attune सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न दर्ज की गई डेटा फाइलों सबसे सेल चक्र मॉडलिंग सॉफ्टवेयर के साथ संगत है. FCS प्रारूप में हैं.

5. डेटा विश्लेषण

  1. GFP (या आरएफपी) के लिए सेल आकार और डीएनए सामग्री की histograms सकारात्मक और नकारात्मक आबादी की तुलना की जा सकती है. वे स्वयं को कॉपी और एडोब फोटोशॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चिपकाकर स्तरित जा सकता है. शाफ़्ट स्वचालित पर सेट है, शाफ़्ट ज के साथ पैमाने पर होगाप्रत्येक नमूने के लिए ighest गिनती. Autoscale को शाफ़्ट सेट के साथ दो रेखांकन overlaying प्रत्येक आबादी के लिए वैश्विक अधिकतम के लिए सेट कुल्हाड़ियों साथ हिस्टोग्राम के आच्छादन बनाता है. यह (3B चित्रा में उदाहरण) GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक आबादी की कुल सेल संख्या बराबर नहीं कर रहे हैं, तब भी जब चरणबद्ध सेल चक्र में रिश्तेदार परिवर्तन के लिए आसान दृश्य तुलना की अनुमति देता है. वैकल्पिक रूप से, एक कस्टम शाफ़्ट (शाफ़्ट मैनुअल विकल्प) हिस्टोग्राम के लिए एक निश्चित मूल्य पर सेट किया जा सकता है. इस मामले में दो आबादी के सापेक्ष सेल संख्या की तुलना की जा सकती है. Attune रन प्रति नमूना का एक निर्धारित मात्रा का उपयोग करता है के रूप में, कुल आबादी का प्रतिशत के साथ प्रत्येक गेट में प्रत्येक रन के लिए कक्षों की पूर्ण मात्रा का ठहराव, चित्रा 3F में कार्यक्षेत्र में रन (उदाहरण के दौरान स्वतः उत्पन्न आंकड़ा तालिका से प्राप्त किया जा सकता है ). डॉट भूखंडों और हिस्टोग्राम भी आसानी से बस वें से अलग नमूने खींचने और छोड़ने के द्वारा, Attune सॉफ्टवेयर में स्तरित जा सकता हैतुलना के लिए एक खुला नमूना के वांछित ग्राफ पर सही पर ई नमूना फ़ाइल मेनू. हालांकि एक भी नमूना (एक ही नमूना भीतर नकारात्मक यानी GFP सकारात्मक और GFP) के भीतर से subpopulations उपरिशायी करने के लिए, हम फ़ोटोशॉप का उपयोग करें.
  2. दो तरीकों एक बड़ी आबादी के लिए सेल चक्र के विभिन्न चरणों में रिश्तेदार प्रतिशत खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सन्निकटन विधि G1, एस, G2 और> G2 चोटियों की सीमाओं को चित्रित करने के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों पर निर्भर करता है. इस विधि उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों के भीतर प्रतिशत की त्वरित और आसान अनुमानों (चित्रा 3E) की अनुमति देता है. हम Ethynyl-deoxyuridine (शिक्षा) निगमन का उपयोग करते हुए एस चरण के लिए लेबल ड्रोसोफिला सी कोशिकाओं के साथ एक प्रत्यक्ष परीक्षण पर आधारित हमारे क्षेत्रों की स्थापना की. दूसरी विधि सेल चक्र वितरण के आकलन के लिए तीसरे पक्ष मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है. हम चित्रा 3F में, उदाहरण के लिए ModFitLT (सत्य सॉफ्टवेयर हाउस) सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया.

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Representative Results

चित्रा 2 प्रदान की GFP के टेम्पलेट का उपयोग कर, ऊतक के पीछे छमाही में GFP व्यक्त, एक लार्वा विंग नमूना के लिए प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है. इसी तरह के परिणाम एक ही ऊतक प्रकार और प्रदान की आरएफपी टेम्पलेट (चित्रा 3) का उपयोग आरएफपी के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ प्राप्त कर रहे हैं. प्रदान की टेम्पलेट्स और वोल्टेज (तालिका 2) लार्वा आँखें (3B चित्रा), दिमाग और पंख, साथ ही पोटा संबंधी आँखें, दिमाग (चित्रा 3 डी) और पंखों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. गेट्स 5 और 6 में आबादी के लिए एफएससी की साजिश रचने द्वारा प्रदान की रिश्तेदार सेल आकार की histograms भी (चित्रा -3 सी) उत्पन्न किया जा सकता है. गेट्स की वजह से विभिन्न ऊतकों या अलग GFP या आरएफपी transgenes के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर के लिए सेल आकार में अंतर को थोड़ा समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. नमूने के एक छोटे से परीक्षण मात्रा (50-100 μl) चल रहा है, जबकि इस रिकॉर्ड को मारने से पहले किया जा सकता है.

एकAttune सॉफ्टवेयर में ऑटो पैमाने पर करने के लिए सेल चक्र या सेल आकार हिस्टोग्राम के लिए शाफ़्ट (गिनती) (शाफ़्ट पैमाने स्वचालित करने के लिए सेट) llowing, प्रत्येक की आबादी के लिए वैश्विक अधिकतम दिखा हिस्टोग्राम में परिणाम है. 3B चित्रा 3 डी शो शाफ़्ट साथ GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक histograms के साथ प्रतिनिधि परिणाम प्रत्येक आबादी के लिए वैश्विक अधिकतम करने के लिए सेट. एक विशिष्ट शाफ़्ट अधिकतम (y-अक्ष के पैमाने पर एक उपयोगकर्ता निर्धारित मूल्य के साथ मार्गदर्शन करने के लिए सेट), स्थापना प्रसार दरों की तुलना के लिए उपयोगी हो सकता है, जो आबादी के बीच पूर्ण संख्या की तुलना के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह मुश्किल में चरणबद्ध सेल चक्र तुलना करने के लिए बनाता है GFP नकारात्मक कोशिकाओं बनाम GFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या बेहद अलग हैं जब आबादी.

चित्रा 3B जीएमआर Gal4, यूएएस GFP transgenes का उपयोग कर पीछे में GFP व्यक्त लार्वा आंखों में GFP सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं के लिए सेल चक्र प्रोफाइल का पता चलता है. ओवरले सेल चक्र पी में अंतर का पता चलता हैकोशिकाओं को व्यक्त पीछे GFP की hasing. चित्रा -3 सी दिखाता बी में GFP सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं के बीच सेल आकार में रिश्तेदार परिवर्तन, एफएससी द्वारा मापा के रूप में सेल आकार की साजिश रचने के द्वारा. चित्रा 3 डी 46H APF पर पोटा संबंधी दिमाग से एक सेल चक्र प्रोफाइल से पता चलता है. GFP सकारात्मक कोशिकाओं G1-एस नियामकों Cyclin डी और निष्क्रियता को बाधित और एस चरण प्रविष्टि के लिए नेतृत्व कि E2F व्यक्त वंश अनुरेखण क्लोन, लाल तीर द्वारा संकेत दिया है और शिक्षा का समावेश (चित्रा 3 डी इनसेट) के साथ एस चरण लेबलिंग द्वारा पुष्टि कर रहे हैं. यह इस स्तर पर सामान्य रूप से G1 (काला ट्रेस, चित्रा 3 डी) में गिरफ्तार कर रहे हैं जो गैर व्यक्त GFP नकारात्मक कोशिकाओं के विपरीत है.

सबसे सेल चक्र प्रोफाइल को अलग सेल चक्र के चरणों में एक जनसंख्या के प्रतिशत के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस G1, एस और G2 चरणों (<delineating हिस्टोग्राम पर उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों बनाकर Attune सॉफ्टवेयर में approximated किया जा सकता हैमजबूत> चित्रा 3E). Attune सॉफ्टवेयर स्वतः उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों और प्रतिशत (चित्रा 3F) के भीतर कोशिकाओं की निरपेक्ष मायने रखता देने, प्रत्येक रन के लिए एक आंकड़ा तालिका उत्पन्न करता है. एक नियंत्रण और प्रयोगात्मक आबादी के बीच चरण वितरण में रिश्तेदार परिवर्तनों की तुलना करने पर यह विधि अच्छी तरह से काम करता है. वैकल्पिक रूप से, मॉडलिंग सॉफ्टवेयर प्रत्येक चरण के साथ ही apoptotic कोशिकाओं में प्रतिशत का अनुमान किया जा सकता है. हम सीधे Attune सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न की. FCS डेटा फ़ाइलों को खोल सकते हैं जो चित्रा 3 जी में ModFitLT (सत्य सॉफ्टवेयर हाउस) का उपयोग किया था.

चित्रा 1
चित्रा 1. 110 में लार्वा के विच्छेदन और लार्वा और पोटा संबंधी ऊतकों के मंचन. ए विच्छेदन (जीनोटाइप के 1118 डब्ल्यू दिखाया गया है)विकास का घंटा पहले पूर्वकाल तिहाई (ऊपर) और (नीचे) उलटा के बाद. व्हाइट नोक लार्वा छल्ली और एक लाल नोक से जुड़ी एक विंग मस्तिष्क बी पंख की स्थिति को इंगित करता है इंगित करता है (सफेद नोक; छोड़ दिया पर नोट विंग एक पैर डिस्क से जुड़ा हुआ है, सही पर पंख पृष्ठीय notum में फाड़ा है), आंखों (पीला) और मस्तिष्क (लाल) लार्वा से हटा दिया. प्यूपा डी. प्यूपा को हटाने के लिए धोने से पहले छल्ली से हटा सिर (लाल बिंदीदार रेखा) के लिए पूर्वकाल हवाई क्षेत्र पर रखा संदंश के साथ कटौती की स्थिति दिखाने के सी. विच्छेदन वसा और आंत . ई. प्यूपा एफ प्यूपा (लाल और पीले तीर) पंख दिखा (डॉटेड) और आंशिक रूप से आंख मस्तिष्क जटिल हटाया साफ हटाने के लिए पंख उठाने की प्रक्रिया दिखा साफ कर दिया. जी लार्वा पंख और हस्तांतरण के लिए पिपेट दिखा आंखों Dissected. एच. Dissected बाद mitotic पोटा संबंधी आंख मस्तिष्क जटिल. आई. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. Vybrant DyeCycle वायलेट और Attune उपयोग कर GFP व्यक्त ऊतकों के प्रतिनिधि सेल चक्र विश्लेषण. एक प्रतिनिधि कार्यक्षेत्र, 4 डॉट भूखंडों और 2 हिस्टोग्राम युक्त एक दांतेदार बनाना, द्वारा संचालित पीछे विंग में GFP और Cyclin डी व्यक्त लार्वा विंग नमूना के लिए दिखाया गया हैगेट 1 के साथ सेल आकार के एड Gal4 transgene है. डॉट साजिश मलबे और clumps के बाहर करने के लिए. बी डॉट साजिश बेदाग कोशिकाओं, उप G1 के डीएनए सामग्री (apoptosis), और clumps के बाहर करने के लिए 2 गेट के साथ singlets भेदभाव करने के लिए. सी. GFP बनाम डीएनए सामग्री की डॉट साजिश. GFP नकारात्मक (गेट 3) और सकारात्मक (गेट 4) कोशिकाओं प्रतिष्ठित और 2N हो सकता है और 4N डीएनए सामग्री GFP बनाम आगे तितर बितर (FSC) द्वारा मापा के रूप में सेल आकार के x-अक्ष. डी. डॉट साजिश के साथ स्थिति पर आधारित स्पष्ट है गेट्स 5 और 6 उत्पन्न करने के लिए. Gate1 भीतर कोशिकाओं के डीएनए सामग्री बनाम GFP या आरएफपी नकारात्मक (गेट 3 के लिए निर्धारित जनसंख्या) के लिए मायने रखता है. ई. हिस्टोग्राम इस तितर बितर साजिश के लिए गेट्स 5 और 6 के निर्धारण में दृश्य सहायता के लिए रंग लाल कर रहे हैं ध्यान दें. डीएनए सामग्री के एफ हिस्टोग्राम GFP या आरएफपी सकारात्मक (गेट 4 के लिए निर्धारित जनसंख्या) के लिए बनाम मायने रखता है. अगर वांछित histograms भी सेल आकार के लिए शामिल किया जा सकता है. सेल आकार हिस्टोग्राम के लिए, आबादी shoulघ गेट्स 5 और 6 के लिए सेट किया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. सेल चक्र और विभिन्न विकास के चरणों और ऊतकों के लिए सेल आकार विश्लेषण के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम. (ए) प्रतिनिधि हिस्टोग्राम डेटा DyeCycle वायलेट (आरएफपी प्रतिदीप्ति बनाम डीएनए सामग्री का इनसेट शो तितर बितर साजिश के साथ आरएफपी अभिव्यक्ति का उपयोग विशेष प्रकार की कोशिकाओं में कोशिका चक्र की तुलना करने के लिए दिखाया गया है ). यह उदाहरण एक engrailed-Gal4 transgene द्वारा संचालित पीछे में आरएफपी व्यक्त लार्वा पंख होते हैं. (बी) जीएमआर Gal4 जनसंपर्क द्वारा संचालित GFP अभिव्यक्ति के साथ लार्वा आंखों में GFP सकारात्मक बनाम GFP नकारात्मक डीएनए सामग्री हिस्टोग्राम का आच्छादनG1 में सबसे GFP सकारात्मक कोशिकाओं दिखा omoter 17. (सी) जीएमआर संचालित GFP के छोटे रिश्तेदार सेल आकार + कोशिकाओं गेट्स 5 और 6 का उपयोग कर आगे तितर बितर द्वारा मापा के रूप में, GFP-नियंत्रण की तुलना में. (डी) पोटा संबंधी मस्तिष्क में, GFP सकारात्मक कोशिकाओं में न्यायपालिका एस चरण प्रविष्टि (लाल arrowhead) के कारण, पर व्यक्त G1-एस सेल चक्र नियामकों Cyclin डी और E2F, 2 एन डी लार्वा instar दौरान प्रेरित FLP-बाहर विधि 5 के माध्यम से अनुरेखण क्लोन वंश प्रेरित गर्मी झटका संकेत मिलता है सामान्य रूप से postmitotic G1 के ऊतक को गिरफ्तार कर लिया. प्रवाह cytometry द्वारा मनाया असामान्य एस चरण प्रविष्टि एस चरण (इनसेट) में कोशिकाओं लेबल जो edu, का समावेश द्वारा पुष्टि की गई. G1, एस और G2 चरणों में रिश्तेदार प्रतिशत का अनुमान किया क्षेत्रों में से (ई) उदाहरण. सीमाओं को एक अलग प्रयोग में ड्रोसोफिला कोशिकाओं में शिक्षा के एस चरण समावेश पर आधारित अनुमान लगाया गया था. Attun द्वारा उत्पन्न (एफ) के आंकड़े का उदाहरण तालिकाई सॉफ्टवेयर परिभाषित क्षेत्रों में रिश्तेदार प्रतिशत दिखा रहा है. (जी) ModFitLT उपयोग कर प्रतिनिधि Attune डेटा के सेल चक्र मॉडलिंग का उदाहरण है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सेल चक्र, रिश्तेदार सेल आकार और रिश्तेदार सेल संख्या में विभिन्न विकासात्मक चरणों में रहते ड्रोसोफिला ऊतकों में के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. इस विश्लेषण सेल प्रकार विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति या अनुरेखण वंश के साथ मिलकर किया जाता है, विस्तृत जानकारी विचारशील सेल चक्र या विकास perturbations के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बारे में प्राप्त किया जा सकता है. मस्तिष्क की कोशिकाओं को गिरफ्तार कर 90% G1 के अधिक सामान्य रूप से कर रहे हैं जब सिद्धांत का सबूत के रूप में, हम 3 डी (चित्रा) एक विकास के चरण में न्यायपालिका डीएनए प्रतिकृति के लिए अग्रणी, GFP लेबल सेल क्लोन में G1-एस सेल चक्र नियामकों व्यक्त करने से पोटा संबंधी मक्खी के मस्तिष्क में निष्क्रियता बाधित .

हालांकि इस जीवित कोशिका चक्र विश्लेषण विधि के लिए कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. सबसे पहले, एक यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग पिंजरे का बँटवारा के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के बीच भेद नहीं कर सकते. इस प्रकार, यहाँ वर्णित विश्लेषण आई एम एम के साथ पूरक होना चाहिएब्याज के ऊतकों में mitotic सूचकांक यों तो ऐसे Ser10-phosphorylated histone H3 18 के रूप में एक mitotic मार्कर, के लिए unofluorescence धुंधला. इसके अलावा विधि दोनों राज्यों में एक ही डीएनए सामग्री के रूप में, एक G0 गिरफ्तारी बनाम G1 में कोशिकाओं के बीच भेद नहीं कर सकते यहाँ वर्णित है. DyeCycle वायलेट जीवित कोशिकाओं, द्वारा लिया जाता है के बाद से बाद में apoptotic चरणों में कोशिकाओं की पहचान भी सीमित है. अंत में, यह आगे तितर बितर पर आधारित सेल आकार के माप बल्कि आकार की पूर्ण मात्रा का ठहराव से संबंधित कक्ष आकार माप कर रहे हैं कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है. सेल आकार की पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए हम इस तरह के एक कल्टर काउंटर (Beckman कल्टर) में इस्तेमाल किया है कि के रूप में एक बड़ा दृष्टिकोण की सिफारिश.

सेल चक्र चरण और आकार डेटा सेल दुगनी होने का समय, सेल चक्र के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए और उपाय करने के लिए अनुरेखण वंश के साथ युग्मित है जब विकास ऐसे G1 के लंबाई, एस और G2 चरणों और सेल विकास दर 9,11 के रूप में गणना की जा सकती विवो में सेल चक्र नियामकों के विचारशील आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ मिलकर यह सेल चक्र और मात्रात्मक सेल चक्र, सेल के विकास और ऊतक morphogenesis मॉडलिंग के लिए विकास के विनियमन के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम विकासशील और इस संस्करण 10 आधारित है जिस पर मूल प्रोटोकॉल शिक्षण के लिए ऐडा डे ला क्रूज़ धन्यवाद. Buttitta लैब में काम एनआईएच अनुदान GM086517 द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube BD Falcon 352058 5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer Life Technologies/ Applied Biosystems 4445315 Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5) Life Technologies/ Applied Biosystems Free PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) Life Technologies/ Applied Biosystems 4449754 For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15003-08 Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain Life Technologies/ Invitrogen V35003
Table 1. Required reagents and instruments.

Live DNA Stain Solution (10 ml):

1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2)
9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma)
5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)

10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2

FSC SSC BL1 VL1
Threshold (x1000) 100 10 10 10
Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150

Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.

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References

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का लाइव सेल चक्र विश्लेषण<em&gt; ड्रोसोफिला</emAttune ध्वनिक केंद्रित cytometer और Vybrant DyeCycle वायलेट डीएनए दाग का उपयोग कर&gt; टिश्यूज
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Flegel, K., Sun, D., Grushko, O., Ma, Y., Buttitta, L. Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain. J. Vis. Exp. (75), e50239, doi:10.3791/50239 (2013).More

Flegel, K., Sun, D., Grushko, O., Ma, Y., Buttitta, L. Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain. J. Vis. Exp. (75), e50239, doi:10.3791/50239 (2013).

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