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Biology

라이브 세포주기 분석 doi: 10.3791/50239 Published: May 19, 2013
* These authors contributed equally

Summary

라이브의 세포주기 분석을위한 프로토콜

Abstract

유동 세포 계측법은 널리 다른 세포주기 단계에서 상대적 비율을 추론하는 세포의 인구 DNA 함량에 대한 정보를 얻기 위해 사용되었습니다. 이 기술은 성공적으로 생체 내에서 세포주기 조절의 유전 연구의 모델 생물 초파리의 유사 분열 조직으로 확장되었습니다. 셀 타입 특정 형광 단백질 발현과 유전자 조작과 함께 사용할 경우, 하나의 세포 수, 세포의 크기와 생체 내에서 단계적으로 세포주기에 미치는 영향에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나이 살아있는 세포 방법은 UV 레이저가 장착 흐름 cytometers에 사용자를 제한, 세포 투과성 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료의 사용에 의존하고있다. 우리는보다 일반적인 보라색 405nm는 레이저와 호환되는 새로운 살아있는 세포 DNA 염료, Vybrant DyeCycle 바이올렛을 사용하려면이 프로토콜을 수정했습니다. 여기에 제시 프로토콜은 세포와 결합 효율적으로 세포주기 분석 할 수 있습니다초파리 조직의 다양한 유형, 상대 셀 크기와 세포 수 정보. 이 프로토콜은 단일 실험실 수준에서 실행 및 관리 할 수있는 작은 벤치 톱 분석기 라이브 초파리 조직에 대한 유용한 세포주기 분석 기술, 조율 어쿠스틱 초점 cytometer에를 확장합니다.

Introduction

유동 세포 계측법은 세포 생존, 상대 셀 크기, DNA의 콘텐츠 및 라이브 세포 인구의 형광 단백질 발현의 측정에 사용하실 수 있습니다. S 상, 세포의 인구의 DNA 함량에 대한 정보 중에 핵 DNA의 복제로 인해 다른 세포주기 단계 1-3에서 상대 비율을 추론 할 수 있습니다. 이 방법은 효모에서 포유 동물 모델 시스템에서 세포주기 분석의 초석이되고있다.

초파리 초파리 세포주기 조절의 생체 내 분석에서 유전을위한 훌륭한 모델 시스템이되었다. 파리에서 사용할 수있는 광범위한 유전 도구는 생체 내 형광 단백질 기반의 혈통에 4-6 추적과 함께 세포주기 규제의 우아한 조직의 특정한 시간적 규제 조작을 허용합니다. 유동 세포 계측법은 endorepl 포함, 초파리 세포 유형의 숫자에 DNA 함량을 연구하는 데 사용되었습니다세포 배양 유사 분열 세포에게 7,8 icating. 생체 세포주기 연구를위한 중요한 사전은 라이브 배체 초파리 상상의 디스크 9,10의 유세포 분석, 많은 실험실에서 사용 적응 된 프로토콜에 대한 프로토콜의 개발, 데 라 크루스와 에드가에 의해 만들어졌다. 유도 형광 단백질 발현과 조직의 특정 라벨을 통해 추적 생체 혈통의 유전자와 결합 된이 기술은 생체 내 9에 하나의 전체 세포의 배가 시간, 셀 크기에 유전자 조작 효과에 대한 정보를 얻기 위해 세포주기 단계의 정확한 타이밍을 확인할 수 있습니다 11. 그러나이 방법은 지금까지 사용자가 흥미로운 훽스트 염색 할 수있는 UV 레이저 cytometers를 흐름을 제한하고 있습니다 살아있는 세포에서 DNA를 염색하고 정량화하는 세포의 사용을 투과 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료에 의존하고있다. 이들은 일반적으로 단지 분류기 (예 : BD FACS Vanta를에서 발견된다GE, BD FACSAria) 또는 고가의 여러 가지 빛깔의 벤치 탑 시스템 (예 : BD LSR), 기관 흐름의 핵심 시설로 일반적으로 필요로하는 지원을 제공합니다.

우리는 Invitrogen의, Vybrant DyeCycle 바이올렛에서 새로운 라이브 세포 DNA의 염료를 사용하는 훽스트 기반의 프로토콜을 수정했습니다. 이 염료는 더 작은 벤치 탑 분석기의 일반 및 작은 독립적 인 벤치 탑 분석기, cytometer에 집중 조율 어쿠스틱에서 사용할 수있는 보라색 405 nm의 레이저와 호환됩니다. 여기에서 우리는 DyeCycle 바이올렛과 조율을 사용하여 개발의 다양한 단계에서 세포 유형, 셀 크기, 셀 번호와 초파리 조직의 다양한 혈통 분석을 결합 할 수있는 세포주기 분석을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 초파리 조직과 같은 분석에 적합 cytometers의 수를 확장하고 살아있는 세포주기 분석이 유형의 추가 조직 유형 및 발달 단계에 맞게 수정 될 수있는 방법의 예제를 제공합니다.

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Protocol

1. 축산 비행

  1. 크로스 10 ㎖ 효모 포도당 보통 3 또는 원하는 다른 단백질이 풍부한 미디어 좁은 플라스틱 병에서 원하는 유전자형의 파리. 생체 내 형광 단백질 발현과 추적 조직의 특정 표현과 혈통에 사용할 수있는 광범위한 초파리 유전자 변형 도구는 다른 4,5 자세히 설명되어 있습니다. 24 시간 자손 컬렉션 시리즈를 얻기 위해 매일 신선한 유리 병에 부모를 전송하거나 더 정확한 스테이징, 한천 플레이트에서 배아를 수집하고 10 설명 된대로 유리 병에 새로 부화 한 유충을 전송합니다. 실험을 통해 균일 한 조건을 보장하고 혼잡 방지하기 위해, 하나의 유리 병 F1 자손의 총 개수는 100 개 이하이어야한다. 실험의 유전 디자인에 따라 원하는 발달 단계까지 적절한 인큐베이터에 튜브를 유지합니다.
  2. 실험 동물을 수집하여 제 3 애벌레 성숙한 유충이 필요합니다정확한 번데기 스테이징 애벌레의 해부 또는 흰색 prepupa (WPP)에 대한 개발 110-120에 대한 시간의 령 (L3). 비 증식 상태로 전환 등의 극적인 세포주기의 변화는 변태 12,13 동안 별개의 timepoints에서 발생합니다. 번데기의 따라서 정확한 스테이징 (개발 1 시간 이내) 변태 동안 재생 세포주기 데이터에 대한 필수적입니다. 그림 1과 같이 WPP (0 시간 APF) 번데기 형성 후 0 시간에 해당 패널의 I. 약간의 습도를 유지하기 위해 물 2.5 mL로 젖은 접힌 Kimwipe에 35mm 페트리 접시에 WPP를 수집합니다. 나이 번데기까지 적절한 온도 단계 (시간 APF) 원하는. 개발 29 1.2 배 빠른 속도로 진행합니다 18에서 더 느리게 ° C와 2.2 배 ° 표준 25 ° C 14에서보다 C.
  3. 9,11가 필요한 경우 복제를 혈통 추적에 열 충격 flipase (HS-FLP)에 의한 재결합을 활성화하기 위해 열 충격 동물. 유충, 몰입의 열 충격물 목욕 (37 ° C로 설정) 및 유충을 확보에 유리 병이 완전히 빠져들 수 있습니다. 번데기의 열 충격, 파라 필름 완전히 물속에 그 물을 욕조에와 페트리 접시를 밀봉하십시오. 동물의 생존을위한 충분한 산소를 교환 할 수 있도록, 열 충격 후 파라 필름을 제거해야합니다. 열 충격의 기간은 flipase의 사용 유전자 원하는 클론의 수의 활동에 따라 달라집니다. 우리는 일상적으로 HS-FLP 유전자 동안에, HS-FLP 첫 번째 염색체에있는 유전자 35 밀리미터 요리 번데기의 열 충격에 대한 2-4 분에 유충의 클론에게 15 추적 혈통 "flipout"를 유도 7-8 분 사용 두 번째 염색체는 20 분을 필요로합니다. 열 충격 클론 비슷한 숫자를 얻었다.

세포 분열 및 해부의 시간의 비율은 각 조직에서 복제 크기를 결정합니다. 정상적인 조건에서, 우리는 클론 20 분 열 충격 (두 번째 염색체에 HS-FLP 유전자를 사용하여) dissec와 애벌레 날개에 유도 것을 발견테드 48 시간 후, 복제 당 네 개의 셀 주위에 평균과, 클론 당 10 세포 클론 당 두 개의 셀에 이르기까지 크기에 약 20 ~ 30도 분리 된 클론이 포함되어 있습니다. 반면, 0 시간 APF에서 배양 접시에있는 번데기의 동일한 HS-FLP 유전자를 가진 7 분 열 충격에 36 시간 이상 해부 수익률도 평균과 1 ~ 4 셀까지 (약 15-25) 클론을 분리 클론 당 2.2 세포. 이러한 데이터는 연구 결과에 따라 조직의 평균 셀 배가 시간을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

2. 해부

  1. 부드럽게 1X PBS를 포함하는 투명 유리 해부 접시에 애벌레 / 번데기를 전송합니다.
  2. 해부 현미경과 충분한 빛을 사용하여, 부드럽게, 선명 이녹스 5 forcep과 복부에 유충을 파악 마이크로 가위로 전방 제를 잘라 애벌레를 잡고 후방을 향해 입 영역을 안쪽으로 밀어 앞쪽에 세 번째 반전 표피 정상 (그림 1A). 조심스럽게 opaqu 제거전자 체지방과 같은 날개, 눈이나 뇌 원하는 조직의 가시성을 높이기 위해 남아있는 용기. 원하는 조직을 해부, 청결 포셉, 입 후크의 눈, 또는 눈 (그림 1G)의 뇌와 기관 및 표피에서 날개를 제거.
  3. 번데기 해부를 들어, 번데기 안쪽 (그림 1C)을 손상을 방지하기 위해, 공기 거품이있는 곳에 부드럽게 번데기 케이스의 앞쪽 끝으로 번데기를 파악하기 위해 forcep을 사용합니다. 반대 손에 포셉 또는 마이크로 가위는 올바른 파악을위한 위치 유동 번데기를하는 데 도움이 될 수 있습니다. 청결 마이크로 가위로 번데기의 후방 끝을 잘라. 이 단면 컷 흉부와 머리에 원하는 조직으로 histolyzed 지방을하지 않고 내부 압력을 해제하기 위해 동물의 지느러미 부분을 향해 약간의 각도로 만들어 져야한다. 날개와 전방의 눈 - 뇌 단지를 피하는 등의 중간을 따라 조심스럽게 잘라냅니다. 조심스럽게 번데기에서 번데기를 제거번데기 표피의 후방 가장자리를 잡고 번데기 경우 (그림 1D)의 당겨 케이스. 집게와 눈 - 뇌 복잡한 표피 전방에있는 작은 구멍을 찌를. 고무 전구 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 histolyzed 지방과 나머지 창자 조직을 제거하기 위해 부분적으로 해부하는 번데기를 통해 PBS 해부 솔루션을 씻는다. 이것은 또한 효과적으로 나중에 유리 피펫의 내부에 달라 붙는 해부 조직의 발생률을 감소 지질과 단백질과 유리 피펫을 윤활.
  4. 번데기 날개를 얻으려면, 표피 날개를 포위하고 날개 자체는 번데기 (그림 1E)에서 치러야해야합니다. 이 측면에서 쫓아 내기 전에 두 날개 표피의 가장 뒤쪽 끝을 파악하기 위해 다른 forcep을 사용하여 당겨 또는 힌지 근처의 날개 아래 forcep을 조종하면서 하나의 forcep으로 머리에 의해 번데기를 누른 할 수 있습니다 시체 (Figure 1E). 날개는 절단 된 후 또는 신체에서 제거하고 멀리 시체 및 기타 자료의 더미에 넣어 힌지에 찢길 수있다.
  5. 눈 - 뇌 복잡한 빠질와 번데기 (그림 1F, 1H)에서 무료로 될 때까지 번데기 눈이나 뇌를 얻으려면, 번데기를 씻는다. forcep을 사용하여 부드럽게 두뇌에서 떨어져 번데기의 눈을 끌어와 원하는 조직을 저장합니다.
  6. 결과가 이상 세포가 동물을 연 후 PBS에 남아 정확도가 떨어질대로, 각각의 샘플을 해부하는 45 분보다 오래 걸릴하지 않습니다.

3. 조직 해리와 DNA 염색법

  1. 윤활 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 5 ML의 폴리스티렌 튜브 (그림 1G)의 라이브 DNA 얼룩 솔루션의 0.5 ML로 해부 조직을 전송합니다. DNA 얼룩 솔루션에 가능한 적은 PBS로 전송 (이하 300 μL), 트립신의 희석으로 조직의 분리를 억제합니다.
  2. SHAKI와 튜브를 품어NG 23 500 RPM (우리는 에펜 도르프 Thermomixer 사용)에서 ° C.
  3. 중간 속도 (5 설정)에서 5 초간 부드럽게 그 소용돌이 70 분 알을 품다. 밑에 소용돌이로 교반 세포 대단히 짧은 시간으로 이어질 것입니다 동안 과도한 소용돌이로 교반은 세포 분열 및 양식 파편을 발생합니다. 23 흔들어 샘플을 반환 ° 속도 5시 5 초 동안 한 번을 소용돌이로하기 전에 추가로 15 ~ 20 분 동안 500 rpm에서 C.
  4. 두뇌와 36hAPF 세 이상 번데기 눈, 수정 프로토콜이 필요합니다. 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브에 45 ~ 60 분 동안 500 rpm에서 23 ° C에서 DNA 얼룩 솔루션의 조직을 떼어 놓다. 그런 다음 하나 하나 수동으로 약 50 ㎕의 DNA 얼룩 솔루션과 신속한 수동으로 그려진 된 파스퇴르 피펫 16 (약 100 ~ 150 μm의 개방)의 위아래로 피펫과 함께 해부 접시에 전달하여 조직의 큰 덩어리를 떼어 놓다. 5 ML 튜브에 DNA 얼룩 솔루션의 0.5 ML의 나머지 부분과 각각의 해리 표본을 전송합니다. 추가로 45 품다23 -30 분 (총 배양 시간 최대 90 분) ° 500 rpm으로 흔들어 C는 수풀까지 더 이상 표시되지 않습니다.
  5. 주 무 세포 투명 번데기 날개 표피 해리되지 않습니다하지만 완전히 해리 샘플은, 조직의 거의 큰 눈에 보이는 덩어리가 있어야합니다.

4. 유동 세포 계측법

  1. 조율 cytometer에 전원을 켜고 조율 소프트웨어를 엽니 다. cytometer에 레이저는 시작 메뉴를 통해 켜져 있어야하고, 매일 성능 테스트는 데이터 수집의 하루 전에 충분한 점수와 성과 추적 구슬로 수행해야합니다. 유체 수준은 절반 이상 전체 및 성능 테스트 전에 비워 낭비해야한다. 조율의 시작, 적절한 보정 및 작동에 대한 세부 사항은 조율 사용 설명서 (에서 찾을 수 있습니다 http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
  2. 새로운 테를 디자인매개 변수가 4.3로 표시와 함께 빈 작업 공간에 4 점 플롯과 2 히스토그램을 작성하여 mplate, 또는 실험에 적합한 이전 디자인 템플릿을 선택하고 수집 할 샘플의 수를 나타냅니다. 우리는 Vybrant DyeCycle 바이올렛 GFP 또는 부록 I.에서 RFP 식 살아있는 초파리 세포주기 분석을위한 조율 템플릿 (. 얻는 형식의 파일)을 제공 한
  3. 제공되는 템플릿은 그림 2에 표시된 매개 변수 개의 도트 플롯과 두 개의 막대 그래프 (가) 있습니다. 검출을위한 채널은 다음을 포함한다 : FSC와 SSC - 세포의 크기와 막 복잡성, VL1 높이 (H), 폭 (W)와 면적 (A)를 나타내는 전방 산란 및 측면 산란 - DyeCycle 바이올렛 염색 나타내는 바이올렛 레이저 여기 DNA와 BL1을 -A - GFP 형광을 나타내는 블루 레이저 채널 1 지역. RFP 분석을 위해 제공된 템플릿은 optimi 인 블루 레이저 채널 3 (BL3-A)를 사용한다는 점을 제외하고, GFP 분석을위한 템플릿과 동일합니다RFP 감지에 데이빗.
  4. 템플릿 도트 플롯 원하는 인구에 대한 분석을 제한하고 분석 (그림 2)에서 파편과 세포 대단히 짧은 시간을 제한하는 문이 있습니다. 문 1 파편과 SSC 대 FSC (그림 2A)에 따라 대단히 짧은 시간을 제외합니다. 문 2 중항 (VL1Area 대 VL1Width) (그림 2B)의 신분에 따라 흠없는 세포, 하위 G1 사멸 세포 및 세포 대단히 짧은 시간을 제외합니다. 문 3 문 1과 2에서 세포를 포괄 파생 문이며, GFP (또는 RFP) 음성 세포 대 VL1Height (그림 2C)에 따라 DNA의 콘텐츠를 식별합니다. 문 4 문 1과 2에서 세포를 포괄 파생 문이며, GFP (또는 RFP) DNA 함량 (그림 2C) 대 양성 세포를 식별합니다. GFP (또는 RFP) 대 앞으로 분산 형 (FSC)로 측정 셀 크기의 도트 플롯 게이트 5와 6 (그림 2D)를 생성하는 데 사용됩니다. Y-AXI에 X 축 및 세포 수에있는 두 개의 히스토그램 플롯 DNA 내용문 3 문 4에 의해 정의 된 인구에 대한의. 원하는 경우 (그림 2E와 2F) 히스토그램도 (미도시) 세포의 크기 포함될 수 있습니다. 셀 크기 히스토그램의 경우, 인구는 X 축과 Y 축의 계수에 FSC를 플로팅 게이트 5와 6으로 설정해야합니다.
  5. 10,000 GFP 또는 RFP 긍정적 인 이벤트 (이 4 번 게이트, 게이트 1의 파생 게이트, 게이트 2 GFP 또는 RFP 긍정적 게이트있을 것입니다)에 중지 녹화를 설정합니다. 6,000 범위 - 10,000 GFP 긍정적 인 이벤트는 전통적으로 출판 품질 프로파일 9,11의 목표왔다. 우리는 고품질의 프로필을위한 4 이벤트 10 충분한 게이트를 얻기 위해 긍정적 인 약 50 %의 GFP는 15 날개 나 눈의 최소를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리는 성공적으로 6 날개 (그림 3A)와 같은 적은에서 예비 세포주기 분석을위한 명확한 데이터를 획득했습니다. 300 μL의 인수 볼륨을 설정,이 총 0.5 ML 시료 460 μL에 대해 사용합니다. BLE 2 그림 2의 예를 들어 템플릿에서 제공하는 적절한 임계 값 전압 설정을 보여줍니다.
  6. 표준 민감도 100 μL / 분을 기록 고감도에서 샘플을 실행합니다. 우리는 서로 다른 감도 수준을 가진 우리의 분석에 차이를 거의 찾을 수 있습니다. 세포의 초점 음향으로 인해,이 cytometer에 정확하게 매우 높은 유속 샘플을 측정 할 수 있습니다. 전통적인 cytometers과는 달리, 우리는 초당 1,500 이벤트에 속도까지 인수함으로써 데이터의 손상을 찾을 수 없습니다. 조율 소프트웨어에 의해 생성 기록 된 데이터 파일은 대부분의 세포주기 모델링 소프트웨어와 호환됩니다. FCS 형식에 있습니다.

5. 데이터 분석

  1. GFP (또는 RFP)에 대한 세포의 크기와 DNA 내용의 히스토그램은 긍정적이고 부정적인 인구를 비교할 수 있습니다. 그들은 수동으로 복사하고 어도비 포토샵 소프트웨어를 사용하여 붙여 넣는 방법으로 계층화 할 수 있습니다. y 축이 자동으로 설정되어 있으면, Y 축은 시간으로 확장 할 수각 샘플에 대한 ighest 계산합니다. 오토 스케일의 Y 축 세트와 두 개의 그래프를 오버레이는 각 모집단에 대한 세계 최대 설정 축 히스토그램의 오버레이를 만듭니다. 이 (그림 3B의 예) GFP 양성 및 GFP 부정적인 인구의 총 세포 수는 동등하지 않은 경우에도 단계적으로 세포주기의 상대적 변화를 시각적으로 쉽게 비교할 수 있습니다. 또한, 사용자 정의 y 축 (y 축 수동 옵션) 히스토그램에 대한 고정 값으로 설정할 수 있습니다. 이 경우 두 집단에 대한 상대 셀 번호를 비교할 수 있습니다. 조율이 실행 당 샘플의 정의 된 볼륨을 사용하기 때문에, 전체 인구의 비율이 각 게이트의 각 실행에 대한 세포의 절대 정량은, 그림 층의 작업 공간에서 실행 (예 :시 자동으로 생성 된 통계 테이블에서 얻을 수 있습니다 ). 도트 플롯과 히스토그램은 간단히 일에서 다른 샘플을 드래그 앤 드롭으로 조율 소프트웨어에서 계층화 할 수 있습니다비교를 위해 열려있는 샘플의 원하는 그래프 위에 오른쪽에 전자 샘플 파일 메뉴를 선택합니다. 그러나 하나의 샘플 (동일한 샘플에서 음 즉, GFP 긍정적 GFP) 내에서 모집단을 오버레이하기 위해, 우리는 포토샵을 사용합니다.
  2. 두 가지 방법은 인구 세포주기의 다른 단계에서 상대적 백분율을 찾을 수 있습니다. 근사 방법은 G1, S, G2 및> G2 피크의 경계를 묘사하기 위해 사용자 정의 된 지역에 의존합니다. 이 방법은 사용자 정의 영역 내에서 비율을 빠르고 쉽게 추정 (그림 3E)를 할 수 있습니다. 우리는 티닐-데 옥시 우리 딘 (EDU) 설립을 사용하여 S-상 표지 초파리 캔자스 시티 세포와 직접 테스트에 근거를 둔 우리의 영역을 설정합니다. 두 번째 방법은 세포주기 분포의 추정 타사 모델링 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 그림 3F, 예를 들어 ModFitLT (진실성 소프트웨어 하우스) 소프트웨어를 사용합니다.

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Representative Results

그림 2는 제공된 GFP 템플릿을 사용하여 조직의 후방 절반 GFP를 표현, 유충의 날개 샘플에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 유사한 결과는 같은 조직 유형 및 제공 RFP 템플릿 (그림 3A)를 사용하여 RFP에 대한 발현 패턴을 얻을 수 있습니다. 제공된 템플릿 및 전압 (표 2) 유충의 눈 (그림 3B), 머리와 날개뿐만 아니라, 번데기의 눈, 두뇌 (그림 3D)와 날개의 분석에 적합합니다. 게이트 5와 6의 인구에 대한 FSC 음모를 꾸미고에서 제공하는 상대 셀 크기의 막대 그래프는 (그림 3C)를 생성 할 수 있습니다. 게이츠 인해 다른 조직이나 다른 GFP 또는 RFP의 도입 유전자에 대한 형광 강도의 차이에 대한 셀 크기의 차이로 약간 조정해야 할 수도 있습니다. 샘플의 작은 양을 시험 (50-100 μl를) 실행하는 동안이 기록을 명중하기 전에 수행 할 수 있습니다.

조율 소프트웨어에서 자동 스케일 세포주기 또는 셀 크기 히스토그램의 y 축 (카운트) (y 축 스케일이 자동으로 설정)을 llowing, 각 모집단에 대한 세계 최대를 보여주는 히스토그램 결과. 그림 3B-3D 방송 Y-축 GFP 양성 및 GFP 부정적인 히스토그램 대표 결과 각 집단에 대한 전역 최대로 설정합니다. 특정 Y 축 최대 (y 축 스케일은 사용자 정의 값을 수동으로 설정)로 설정하면 확산 속도를 비교하는 데 유용 할 수 있습니다 개체군 사이의 절대 숫자를 비교 수 있지만 어려운 단계적으로 세포주기를 비교할 수 있습니다 GFP 부정적인 세포 대 GFP 양성 세포의 수는 크게 다릅니다 인구.

그림 3b는 GMR-GAL4, UAS - GFP의 형질 전환 유전자를 사용하여 후방에서 GFP를 표현, 애벌레 눈 GFP 긍정적이고 부정적인 세포에 대한 세포주기의 프로파일을 보여줍니다. 오버레이는 세포주기 P의 차이를 보여세포를 표현 후방 GFP의 hasing. 그림 3C 보여줍니다 B에서 GFP 양성 및 음성 세포 사이의 세포 크기의 상대적인 변화, FSC로 측정 셀 크기 음모를 꾸미고 있습니다. 그림 3D는 46H APF에서 번데기 뇌에서 세포주기의 프로필을 보여줍니다. GFP 양성 세포는 G1-S 규제 사이클린 D 및 정지를 중단하고 S 상 항목으로 이어질 E2F을 표현 혈통을 추적 복제, 빨간색 화살표로 표시하고 에듀의 결합 (그림 3D 삽입)과 S 상 표시에 의해 확인한다. 이것은이 단계에서 일반적으로 G1 (블랙 추적, 그림 3D)에 체포가 아닌 표현 GFP 부정적인 세포는 대조적입니다.

대부분의 세포주기 프로파일은 다른 세포주기 단계에있는 인구의 비율에 대한 정보를 얻는 데 사용됩니다. 이 G1, S 및 G2 단계 (<윤곽을 막대 그래프의 사용자 정의 영역을 작성하여 맞출 소프트웨어 근사 할 수있다강해> 그림 3E). 조율 소프트웨어가 자동으로 사용자 정의 영역 및 비율 (그림 3 층) 내에서 세포의 절대 수를주고, 각 실행에 대한 통계 테이블을 생성합니다. 제어 및 실험 집단 사이의 위상 분포의 상대적 변화를 비교할 때이 방법은 잘 작동합니다. 또한, 모델링 소프트웨어가 각 단계뿐만 아니라 사멸 세포의 비율을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 직접 조율 소프트웨어에 의해 생성. FCS 데이터 파일을 열 수있는 그림 3G에서 ModFitLT (진실성 소프트웨어 하우스)를 사용했다.

그림 1
그림 1. 110 유충의 해부와 애벌레와 번데기 조직의 준비. A. 해부 (유전자형 1118 W를 참조)개발 시간 전에 전방 번째를 표시 (위)와 (아래) 반전 후. 흰색 화살촉 유충 표피와 빨간 화살촉에 부착 된 날개 뇌 B. 날개의 위치를 나타내는 표시 (흰색 화살촉, 왼쪽 주 날개는 다리를 디스크에 부착을, 오른쪽 날개가 지느러미 notum에서 찢어), 눈 (노란색)과 뇌 (적색) 유충에서 제거됩니다. 번데기 D. 번데기 제거 세척하기 전에 큐티클 제거 헤드 (빨간 점선)에 전방 상공에 배치 집게 인하의 위치를 보여주는 C. 해부 지방 및 용기 . E.는 번데기가 F.는 번데기가 (빨간색과 노란색 화살촉) 날개를 표시 (점선)과 부분적으로 눈 - 뇌 복합 제거 청소 제거를위한 날개를 들어 올리는 과정을 보여주는 청소. G. 유충의 날개와 전송 피펫을 보여주는 눈을 해부. H. 해부 후 유사 분열 번데기의 눈 - 뇌 복합. I. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. Vybrant DyeCycle 바이올렛과 조율을 사용하여 GFP를 표현하는 조직의 대표 세포주기 분석. 대표적인 작업 공간, 4 점 플롯과 2 히스토그램을 포함하는이 깔쭉 깔쭉하게하다에 의해 구동, 후방 날개에 GFP 및 사이클린 D를 표현하는 애벌레 날개 샘플 표시됩니다문 1 셀 크기의 ED-GAL4 유전자. A. 도트 플롯은 파편과 수풀을 제외한다. B. 도트 플롯 흠 세포, 하위 G1의 DNA 함량 (세포 사멸), 그리고 수풀을 제외 게이트 2 중항을 구별 할 수 있습니다. C. GFP 대 DNA 내용의 도트 플롯. GFP 부정적인 (문 3) 긍정적 (문 4) 세포는 고유 및 2N 될 수 있으며, 4N DNA 함량은 GFP 대 앞으로 분산 형 (FSC)로 측정 셀 크기의 x 축. D. 도트 플롯을 따라 위치에 따라 분명하다 게이트 5와 6를 생성합니다. GATE1 내 세포가 DNA의 콘텐츠 대 GFP 또는 RFP 음 (문 3으로 설정 인구)에 대한 카운트. E. 히스토그램이 산점도를위한 게이트 5와 6을 결정하는 시각적 인 도움을 빨간색으로되어 있습니다. DNA 내용의 F. 히스토그램 GFP 또는 RFP 플러스 (문 4로 설정 인구)에 대한 대 계산됩니다. 원하는 경우 히스토그램은 세포의 크기에 포함될 수 있습니다. 셀 크기 히스토그램, 인구 말아야D는 게이트 5와 6으로 설정. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 세포주기의 다양한 발달 단계와 조직에 대한 세포의 크기 분석의 대표 히스토그램. (A) 대표 히스토그램 데이터를 DyeCycle 바이올렛 (RFP 형광 대 DNA 내용의 삽입 보여줍니다 산점도와 RFP 식을 사용하여 특정 세포 유형의 세포주기를 비교하기 위해 표시됩니다 ). 이 예에서는 engrailed-GAL4 유전자에 의해 구동 후방에서 RFP를 표현 애벌레 날개를 포함합니다. (B) GMR-GAL4 홍보에 의해 구동 GFP 식으로 애벌레의 눈 GFP 양성 대 GFP 부정적인 DNA 콘텐츠 히스토그램의 오버레이G1에서 가장 GFP 양성 세포를 보여주는 omoter 17. (C) GMR 기반 GFP의 작은 상대 셀 크기 + 세포 게이트 5와 6을 사용하여 앞으로 분산으로 측정, GFP-컨트롤에 비교했다. (D) 번데기 뇌, GFP 양성 세포의 탈선 S 상 입력 (빨간색 화살촉)를 일으키는 과잉 표현 G1-S 세포주기 규제 사이클린 D와 E2F, 2 애벌레 령 동안 유도 FLP 아웃 방법 5를 통해 추적 클론 혈통 유도 열 충격을 나타냅니다 일반적으로 postmitotic G1은 조직을 체포. 유동 세포 계측법에 의해 관찰 된 비정상 S 상 항목은 S 상 (삽입)의 셀을 레이블 에듀의 결합에 의해 확인되었다. G1, S 및 G2 단계의 상대적 비율을 추정하는 데 사용 지역 (E) 예제. 경계는 별도의 실험에서 초파리 세포 에듀의 S 상 정관에 따라 추정 하였다. Attun에 의해 생성 (F) 통계의 예는 테이블전자 소프트웨어 정의 된 지역에 상대적인 백분율을 표시합니다. (G) ModFitLT를 사용하는 대표적인 조율 데이터의 세포주기 모델링의 예제. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 세포주기, 상대 셀의 크기 및 상대 셀 수 다양한 발달 단계에서 라이브 초파리 조직에서 분석 할 수 있습니다. 이 분석은 세포 유형의 특정 형광 단백질의 발현 또는 추적 계보와 결합 될 때, 자세한 정보는 신중 세포주기 또는 성장 섭동에 대한 세포 반응에 대해 얻을 수 있습니다. 뇌 세포가 체포 90 % G1에 일반적으로있는 경우 원칙적으로 증거로, 우리는 (3D 그림) 발달 단계에서 비정상적인 DNA 복제로 이어지는 GFP라는 세포 클론에서 G1-S 세포주기 규제를 표현하여 번데기 플라이 두뇌에 정지를 중단 .

그러나이 살아있는 세포주기 분석 방법에 대한 몇 가지 중요한 제한이 있습니다. 첫째, 하나는 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 유사 분열의 다양한 단계에서 세포를 구별 할 수 없습니다. 따라서, 여기에 설명 된 분석 IMM로 보충해야한다그 조직에서 유사 분열 지수를 정량화하는 등 Ser10 인산화 히스톤 H3 18 개의 유사 분열 마커에 대한 unofluorescence 염색. 또한이 방법은 두 국가가 동일한 DNA 함량이 있기 때문에, G0 체포 대 G1에서 세포를 구별 할 수 없습니다 여기에 설명. DyeCycle 바이올렛은 살아있는 세포에 의해 흡수되기 때문에 나중에 사멸 단계에서 세포의 식별은 제한됩니다. 마지막으로, 앞으로 분산에 따라 셀 크기의 측정이 아닌 크기의 절대 정량보다 상대 셀의 크기 측정 점에 유의하는 것이 중요합니다. 셀 크기의 절대 정량 우리는 쿨터 카운터 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날)에 사용되는 것과 체적 접근 방식을 권장합니다.

세포주기 단계 및 크기 데이터는 세포의 배가 시간, 세포주기에 대한 자세한 정보를 측정하는 추적 계보와 결합 될 때 성장과 같은 G1의 길이, S 및 G2 단계와 세포 성장 속도 9,11과 같이 계산 될 수있다 생체 내에서 세포주기 규제의 은밀한 유전자 조작이 결합은 세포주기 및 정량 세포주기, 세포 성장 및 조직 형태 형성 모델링을위한 성장 조절에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

우리는 개발 버전이 10의 기반이되는 원래의 프로토콜을 가르치는 아이다 드 라 쿠 르스에 감사드립니다. Buttitta 연구소의 작품은 NIH 교부금 GM086517에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube BD Falcon 352058 5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer Life Technologies/ Applied Biosystems 4445315 Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5) Life Technologies/ Applied Biosystems Free PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) Life Technologies/ Applied Biosystems 4449754 For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15003-08 Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain Life Technologies/ Invitrogen V35003
Table 1. Required reagents and instruments.

Live DNA Stain Solution (10 ml):

1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2)
9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma)
5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)

10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2

FSC SSC BL1 VL1
Threshold (x1000) 100 10 10 10
Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150

Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.

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References

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라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여&gt; 조직
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Flegel, K., Sun, D., Grushko, O., Ma, Y., Buttitta, L. Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain. J. Vis. Exp. (75), e50239, doi:10.3791/50239 (2013).More

Flegel, K., Sun, D., Grushko, O., Ma, Y., Buttitta, L. Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain. J. Vis. Exp. (75), e50239, doi:10.3791/50239 (2013).

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