Summary
Overview
マイクロプレートリーダーは多目的に利用できる測定要機器であり、同時に多数のサンプルを測定することができます。マイクロプレートリーダーを用いて、吸光度、蛍光、発光を測定することが可能です。マルチウェルプレートはマイクロプレートリーダーにとって不可欠な実験器具であり、一度に多くの実験条件を設定することができます。プレートリーダーによる実験では、分析の種類に関わらず検量線を利用し計測値を算出します。既知濃度のサンプルを使用し検量線を作成します。その検量線からの推定、あるいは回帰直線から算出することで、計測値を得ることができます。スタンダード、サンプルと共にブランクとポジティブコントロール、ネガティブコントロールもマルチウェルプレート上にロードし分析することで測定が適正に行われているかどうか確認できます。マルチプレートリーダーは、タンパク質の定量、遺伝子発現、活性酸素種やカルシウム流動のような様々な代謝プロセスの研究に応用されます。
Procedure
マイクロプレートリーダーは広く利用される測定用機器であり、多数のサンプルを同時に測定することができます。
測定には96ウェルプレートのようなマルチウェルプレートを利用します。
マイクロプレートリーダーは実験の種類を問わず使用できます。検量線から、ポジティブコントロールやネガティブコントロールと同時に実験サンプルの値を計測できます。
マイクロプレートリーダーにはいろいろな形状や大きさがあり、設定方法もそれぞれ異なります。多彩な機能が備えられ、多種多様な分析に対応できます。例えば、測定モードを切り替えることで、吸光度、蛍光、発光等を測定できるようになります。
マルチウェルプレートはマイクロプレートリーダーに欠かせない器具です。これにサンプルを注入し、機械で測定します。いろいろなサイズのものがあり、底の形状やウェルの数も様々です。各分析に適したプレートを選択します。
ローディングトレイに96ウェルプレートをのせ機械にセットします。
通常コンピューターインターフェイスを利用し、プレートの測定や、波長、モードなどの条件を設定します。ソフトウェアは、グラフィカルユーザーインターフェイスで、サンプルがロードされたウェルのみを選択できます。
マルチチャンネルピペットはマルチウェルプレートにサンプルをロードするためによく使用される器具です。また、シングルチャンネルピペットも使用できます。
サンプルとスタンダードはピペッティングエラーを補正するために２つか３つずつウェルにロードします。
検量線用に既知濃度のサンプルを準備し、複数の吸光度を測定します。このデータを使ってサンプル濃度を割り出すための検量線を作成します。
ブランクはサンプルを含んでおらず、実験の目的とする反応とは関係性がありません。これは使用するバッファーや化合物がどれだけ実験結果に影響するのか特定するために準備します。この測定で得られた値を「バックグラウンド」と呼びます。
ポジティブコントロールにより適正な分析が行われたか判断できます。これは良い値の基準となります。ネガティブコントロールは、何も測定されず又影響されない値になります。ここでは何の結果も出ないはずです。
プレートの準備が整ったら機械にセットしましょう。間違ったサンプルを測定しないように、又プレートの向きが逆にならないようにトレイの正しい位にプレートをのせて下さい。測定する際には、トレイを装置に無理やり押し込まず、またサンプルが装置にこぼれないように注意しましょう。
サンプルをトレイにのせたら、プレートの測定を開始する前に、モード、波長、ウェルの測定順序などの条件を設定します。
条件設定後、測定を開始します。プレートリーダーによる測定結果はソフトウェアにより処理されます。
測定が完了したら、検量線用のサンプルを含む全てのサンプルからバックグラウンドとなるブランクの平均値を差し引きます。
その後、既知濃度のサンプルの値を各測定値、この場合吸光度に対してプロットします。
プロットに基づいて、線形回帰を利用し最適な検量線が算出されます。
この作業は、表計算プログラムを利用することで簡単に行えます。
決定係数とは得られた検量線が実測値にどの程度当てはまるかを表す統計的尺度であり、0.9から0.99が理想的な値です。最も理想的な値は0.99であり、直線とデータが完璧に一致することを意味します。
最適な検量線を利用し、サンプルとコントロール、各ウェルの濃度を算出できます。吸光度の値をYに代入し濃度xの値を計算します。
あるいはY軸上の吸光度から検量線に向かって線をひき、そこからX軸の値を読み取ることにより濃度を決定することも可能です。
多くのマイクロプレートリーダーで吸光度の測定が可能です。吸光度は対象物への入射光の強さと透過光の強さの対数比で表されます。
ブラッドフォード法は、マイクロプレートリーダーによる吸光度分析の一例です。サンプルと共にブラッドフォード試薬をプレートに加え、試薬とサンプル中のタンパク質の結合による吸光度のシフトを利用した分析法です。
蛍光検出では、蛍光色素を特定波長光で活性化させ、その後励起させることにより複数の波長で発光することを利用し分析できます。
光感受性の試薬を使用するときは、光退色防止のためにカバーをして、実験を進めてください。
化学反応による発光を利用した分析では、一般にルシフェラーゼを使用します。ルシフェラーゼは種類が豊富で、例えば蛍由来のものがあります。ルシフェラーゼは酸素、ATP、マグネシウムと反応し発光します。
発光を利用した分析には数多くの応用方法があります。例えば、がん細胞の活性酸素種の生成を検出測定するために利用されています。
その他にも、マイクロプレートリーダーを利用して384及び1536ウェルプレートのハイスループットアッセイが行われています。この解析では、ロボットによりサンプルがロードされます。そのロボットではありません。非常に正確なサンプル操作がプログラムされたロボットです。
ここまでJoVEマイクロプレートリーダー編をご覧いただきました。このビデオでは、マイクロプレートリーダーの基本概念、その使用方法、操作方法、測定結果の解析法、そして応用例を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。
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