Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية

Published: May 31, 2013 doi: 10.3791/50243
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1RT Biochemistry Section, HIV Drug Resistance Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research
* These authors contributed equally

Summary

عالية الإنتاجية انتقائية 2 'أسيلة الهيدروكسيل تحليلها من قبل التمديد التمهيدي (SHAPE) تستخدم مادة كيميائية رواية التحقيق التكنولوجيا، النسخ العكسي، الكهربائي الشعري والبرمجيات التنبؤ هيكل ثانوي لتحديد هياكل الرنا من عدة مئات إلى عدة آلاف من النيوكليوتيدات في قرار النوكليوتيدات واحد.

Abstract

فهم وظيفة الحمض النووي الريبي المشاركة في العمليات البيولوجية تتطلب معرفة وافية من بنية الحمض النووي الريبي. وتحقيقا لهذه الغاية، ومنهجية يطلق عليها اسم "عالية الإنتاجية انتقائية 2 'أسيلة الهيدروكسيل تحليلها من قبل التمديد التمهيدي"، أو الشكل، يسمح التنبؤ من الحمض النووي الريبي هيكل الثانوي لقرار النوكليوتيدات واحد. هذا النهج يستخدم وكلاء التحقيق الكيميائية التي acylate تفضيلي المناطق الذين تقطعت بهم السبل أو مرنة واحدة من الحمض النووي الريبي في محلول مائي. تم الكشف عن مواقع التعديل الكيميائي بواسطة النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي معدلة، والمنتجات من هذا التفاعل هي مجزأة من قبل الكهربائي الشعري الآلي (CE). منذ الناسخ العكسي مؤقتا في تلك النيوكليوتيدات RNA تعديلها من قبل الكواشف الشكل، مكتبة [كدنا] الناتجة خرائط غير مباشرة تلك ribonucleotides أن تقطعت بهم السبل واحدة في سياق RNA مطوية. باستخدام البرمجيات ShapeFinder، تتم معالجة electropherograms التي تنتجها الآلي CE وتحويلها إلى نوالجداول تفاعل cleotide التي يتم تحويلها إلى أنفسهم القيود الزائفة الطاقة المستخدمة في RNAStructure (V5.3) خوارزمية التنبؤ. وقد تم العثور على هياكل RNA ثنائي الأبعاد التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين SHAPE التحقيق مع الحمض النووي الريبي في سيليكون والتنبؤ هيكل ثانوي لتكون أكثر دقة من الهياكل التي تم الحصول عليها باستخدام أي من الطريقتين وحدها.

Introduction

لفهم وظائف الرنا الحفاز وغير الترميز المشاركة في تنظيم الربط والترجمة وتكاثر الفيروس وسرطان، لا بد من معرفة تفصيلية للبنية الحمض النووي الريبي 1،2. للأسف، تنبؤ دقيق من الحمض النووي الريبي للطي يمثل تحديا هائلا. وكلاء التحقيق الكلاسيكية تعاني من عيوب كثيرة مثل سمية، والتغطية النوكليوتيدات غير مكتملة و / أو إنتاجية محدودة إلى 100-150 النيوكليوتيدات في التجربة. خوارزميات التنبؤ المجردة هيكل الثانوي غير ملائم وبالمثل، نظرا لعدم الدقة الناجمة عن عدم قدرتها على التمييز بين فعالية هياكل مماثلة بقوة. الرنا كبيرة على وجه الخصوص هي أيضا في كثير من الأحيان إلى صهر أساليب تحديد هيكل 3D مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي (NMR) التحليل الطيفي، وذلك بسبب مرونتها ومتعلق بتكوين كميات كبيرة من عينات نقية للغاية المطلوبة لهذه التقنيات.

HSHAPE IGH الإنتاجية يحل الكثير من هذه المشاكل عن طريق توفير نهج بسيطة فعالة ليحقق في هياكل الرنا كبير في قرار النوكليوتيدات واحد. وعلاوة على ذلك، والكواشف المستخدمة لشكل هي آمنة وسهلة للتعامل، وعلى النقيض من معظم الكواشف الكيميائية الأخرى التحقيق، تتفاعل مع جميع ribonucleotides أربعة. ويمكن لهذه الكواشف أيضا اختراق الأغشية الخلوية، مما يجعل من الممكن للتحقيق في الرنا في سياق الجسم الحي (ق) 3. وضعت أصلا في الأسابيع مختبر 4، وقد استخدمت SHAPE لتحليل مجموعة متنوعة واسعة من الرنا، والمثال أبرزها تقرير للهيكل الثانوي كاملة من ~ 9 KB HIV-1 الحمض النووي الريبي الجينوم 5. الإنجازات البارزة الأخرى باستخدام SHAPE تشمل توضيح لهياكل أشباه الفيروسات المعدية 6، الرناوات غير الترميز طويلة الإنسان 7، 8 ريبوسوم الخميرة، وriboswitches 9 وكذلك لتحديد مواقع الربط البروتين في الفيريون المرتبطة HIV-1 RNA 3. WHوقد نشرت إيل الاختلافات الأصلي وعالية الإنتاجية من البروتوكول SHAPE في أماكن أخرى 10-12، ويوفر هذا العمل وصفا مفصلا لتحديد الحمض النووي الريبي هيكل الثانوي بحلول SHAPE الإنتاجية العالية باستخدام [أليغنوكليوتيد الفلورسنت، وكولتر CEQ 8000 محلل الوراثية بيكمان، و SHAPEfinder وRNAStructure (V5.3) والبرمجيات. كما تشمل التفاصيل الفنية لم تنشر من قبل والمشورة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

الاختلافات من الشكل

جوهر الشكل وتنوعاتها هو التعرض من الحمض النووي الريبي في محلول مائي لالانهيدريدات بالإلكترونات التي acylate انتقائي 2'-الهيدروكسيل (OH-2') مجموعات الريبوز، وتنتج adducts ضخمة في مواقع التعديل. هذا التفاعل الكيميائي يخدم كوسيلة لاستجواب ديناميات RNA المحلية الهيكلي، كما النيوكليوتيدات الذين تقطعت بهم السبل واحد هم أكثر عرضة للاعتماد التشكل مواتية لهجوم من قبل بالإلكترونات هذه الكواشف، بينما قاعدة الاقتران أو للإنشاء معمارياالنيوكليوتيدات ained أقل أو يتفاعل 10. تم الكشف عن مواقع تشكيل معقد إضافي عن طريق النسخ العكسي بدء الاشعال من fluorescently أو رديولبلد المهجنة إلى موقع معين على الحمض النووي الريبي المحورة (و"(+)" رد فعل الإرشاد التمهيدي). عندما يفشل الناسخ العكسي (RT) لاجتياز ribonucleotides acylated، ويتم إنتاج مجموعة من المنتجات [كدنا] الذي يتزامن مع مواقع من تعديل أطوال. A السيطرة "(-)" التمهيدي التمديد يتم تنفيذ رد فعل باستخدام الحمض النووي الريبي التي لم تتعرض للكاشف أيضا بحيث الإنهاء المبكر من توليف الحمض النووي (أي "توقف") بسبب الحمض النووي الريبي هيكل، غير محدد RNA حبلا الكسر، وغيرها، قد. يمكن تمييزها عن التوقف التي تنتجها التعديل الكيميائي. وأخيرا، يتم استخدام اثنين من ردود الأفعال dideoxy التسلسل بدء من نفس الاشعال كعلامات لربط النيوكليوتيدات رد الفعل مع تسلسل الحمض النووي الريبي الأولية بعد الكهربائي.

في التطبيق الأصلي من حالات العسر الشديدويستخدم E، وهو نفس نهاية 32 ف المسمى التمهيدي ل(+)، (-)، واثنين من التفاعلات التسلسل. يتم تحميل المنتجات من هذه التفاعلات إلى الآبار المجاورة في 5-8٪ هلام بولي أكريلاميد بلاطة، ومجزأة عن طريق تغيير طبيعة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE؛ الشكل 1). التحليل الكمي من الصور هلام التي تنتجها SHAPE التقليدية يمكن القيام بها باستخدام SAFA، شبه الآلي برامج التحليل footprinting 13.

في المقابل، شكل عالية الإنتاجية توظف الاشعال fluorescently المسمى والكهربائي الشعري الآلي. على وجه التحديد، لكل منطقة من الحمض النووي الريبي قيد التحقيق، مجموعة من أربعة الاشعال DNA وجود تسلسل مشتركة ولكن مختلفة 5 'يجب توليفها تسميات الفلورسنت أو شراؤها. هذه أليغنوكليوتيد] بشكل مختلف المسمى تخدم لرئيس اثنين من ردود الفعل SHAPE واثنين من ردود الفعل التسلسل، والمنتجات التي يتم تجميع ومجزأة / الكشف عنها من قبل الكهربائي الشعري الآلي (CE). وهرEAS الملف الشخصى التفاعل من 100-150 NT من الحمض النووي الريبي يمكن الحصول عليها من مجموعة من أربعة تفاعلات باستخدام النهج الأصلي، وشكل عالية الإنتاجية يسمح قرار من 300-600 NT من واحدة عينة مجمعة 3. ما يصل إلى 8 مجموعات من ردود الفعل قد تكون مجزأة في وقت واحد، في حين يمكن للما يصل الى 96 عينات أعدت للتجزئة على مدى 12 أشواط متتالية CE (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، فإن البرنامج SHAPEfinder، وضعت لمعالجة البيانات الناشئة من CEQ وتحليل وراثية أخرى وتحليلها، هو أكثر الآلي وتتطلب تدخل المستخدم أقل بكثير من SAFA 13 أو حزم هلام التحليل الأخرى.

ظهرت منهجيات عالية الإنتاجية أكثر تقدما في الآونة الأخيرة مثل PARS (تحليل موازية للبنية الحمض النووي الريبي) 14 وفرج تسلسل (جزء التسلسل) 15، والتي تستخدم الإنزيمات بنية محددة بدلا من الكواشف الألكلة بالتزامن مع الجيل القادم التسلسل التقنيات للحصول على المعلومات!ن حول بنية الحمض النووي الريبي. وعلى الرغم من جاذبية هذه التقنيات، العديد من القيود الملازمة لنوكلياز التحقيق لا تزال 16. يمكن التحايل هذه المشاكل في التسلسل SHAPE (SHAPE تسلسل) 17 البروتوكول، حيث سبق التسلسل التالي جيل عن طريق التعديل الكيميائي والنسخ العكسي من الرنا بطريقة مماثلة لتلك التي يؤديها في الشكل التقليدي. في حين أن هذه الأساليب قد يمثلون مستقبل تحديد بنية الحمض النووي الريبي، من المهم أن نتذكر أن التسلسل التالي جيل مكلفة للغاية، ويبقى غير متاحة لكثير من المختبرات.

تحليل بيانات الشكل

يتم تقديم البيانات المنتجة في محلل الوراثية في شكل رحلاني، حيث كثافة مضان من العينة (ق) التي تتدفق من خلال كاشف الشعرية المرسومة ضد فهرس من وقت الهجرة. هذه المؤامرة تأخذ شكل آثار التداخل المقابلة لقناة مضان أربعةق المستخدمة للكشف عن fluorophores مختلفة، وحيث يتكون كل أثر للقمم المقابلة لمنتجات [كدنا] تسلسل أو الفردية. ويتم تصدير البيانات رحلاني من محلل الوراثية كملف نصي المفصول والمستوردة إلى التحول ShapeFinder وتحليل البرمجيات 18.

يستخدم ShapeFinder في البداية لتنفيذ سلسلة من التحولات رياضية على البيانات لضمان أن أوقات الهجرة وأحجام الذروة تعكس بدقة الهويات وكميات من منتجات التفاعل، على التوالي. ثم يتم محاذاة قمم ومتكاملة، ونتائج جدولتها مع تسلسل الحمض النووي الريبي الأولية. يتم الحصول على "لمحة تفاعل" للجزء ذات الصلة من الحمض النووي الريبي من خلال طرح القيم التحكم من (+) القيم المرتبطة مع بعضها RNA النوكليوتيدات، وتطبيع البيانات كما هو موضح أدناه. يتم استيراد هذا الملف إلى RNAstructure (V5.3) البرامج 19،20، والذي يحول فال تفاعل تطبيعUES إلى القيود الزائفة الطاقة التي يتم دمجها في بنية الحمض النووي الريبي الثانوية خوارزمية قابلة للطي. الجمع بين المواد الكيميائية التحقيق وقابلة للطي الخوارزميات في هذه الطريقة بشكل كبير على تحسين دقة التنبؤ بنية مقارنة إما طريقة وحدها 12،21. إخراج RNAstructure (V5.3) يتضمن صورا لأقل الطاقة RNA الهياكل الثانوية مرمزة مع ملف SHAPE تفاعل (ق)، وكذلك نفس الهياكل في تدوين النصوص الدوت قوس. قد في وقت لاحق يتم تصديرها هذا الأخير إلى برامج مخصصة لعرض رسومية من بنية الحمض النووي الريبي الثانوية مثل فارنا 22 و 23 PseudoViewer.

الشكل 1
الشكل 1. انسيابي من عزم هيكل الحمض النووي الريبي عبر SHAPE (4،10). (A) RNA ميمكن الحصول على AY من العينات البيولوجية أو بواسطة نسخ في المختبر. (B) اعتمادا على مصدر، يتم طي RNA أو محضرة بطريقة أخرى وتعديلها مع كاشف الشكل. (C) النسخ العكسي باستخدام بادئات fluorescently المسمى أو بالإشعاع. (D) منتجات كدنا] هي مجزأة إما عن طريق الكهربائي الشعري أو لوح المستندة إلى هلام. (E) تحليل شظية. (F) التنبؤ بنية الحمض النووي الريبي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.

الشكل 2
الشكل 2. الطابع الإنتاجية العالية من الشكل القائم على CE يسمح تحليل سريع من الرنا متعددة، و / أو شرائح متعددة من نفس الحمض النووي الريبي. (A) (B) يتم بحثها أقسام من الحمض النووي الريبي بشكل مستقل باستخدام مجموعات مختلفة من بادئات الفلورسنت (الأسهم السوداء) (C) مجموعة من يتم تجميع ردود الفعل وتحميلها في الآبار A1، B1، C1، الخ، على التوالي، وتوفير تغطية كاملة لل~ 3 KB RNA1. منتجات التفاعل من الرنا 2، 3، 4، وما إلى ذلك قد تكون مستعدة بالمثل لتجزيء في أشواط متتالية الكهربي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

التصميم التمهيدي والإرشاد من 3 RNA 'محطة

لتحليل الرنا طويلة من قبل SHAPE الإنتاجية العالية، وينبغي اختيار مجموعة من المواقع التهجين التمهيدي بحيث يتم فصلهم (ط) التي كتبها ~ 300 NT، (الثاني) 20-30 NT في الطول، و (ثالثا) أن الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الهجينة التي تنتجها الصلب الحمض النووي لهذه المواقع لديها درجة حرارة انصهار المتوقعة من> 50 درجة مئوية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تجنب قطاعات من الحمض النووي الريبي التي من المتوقع أن تكون منظم للغاية، على الرغم من اتخاذ مثل هذا القرار يتطلب بعض المعرفة المسبقة للبنية الحمض النووي الريبي، والتي غالبا ما تكون غير متوفرة. ثم ينبغي أن تصمم الاشعال الحمض النووي الذي هجن لهذه المواقع، مع الحرص على ضمان أن لن يكون من المتوقع أن تشكل dimers مستقرة أو الهياكل الثانوية intrastrand.

مرة واحدة مصممة، ومجموعات التمهيدي يجب أن يكون إما بشراء (مثلا من الحمض النووي المتكاملة للتكنولوجيا، أميس، أيوا) أو تصنيعه 24،25. الاشعال 5'المسمى مع Cy5، Cy5.5،WellRedD2 (بيكمان كولتر) وIRDye800 (Lycor) / WellRedD1 (بيكمان كولتر) هي الأنسب للبيكمان كولتر 8000 CEQ، وتوفير كثافة إشارة جيدة مع التقليل من الحديث المتبادل. قد يتم تخزين [أليغنوكليوتيد المسمى إلى أجل غير مسمى في، 10 ميكرومتر مأخوذة الصغيرة في -20 درجة مئوية، وتجنب تجميد / الذوبان دورات متكررة.

باستخدام بادئات مصممة بهذه الطريقة، فمن الممكن الحصول على بيانات شكل ليكاد يكون RNA كامل من أي طول. ومع ذلك، فإن تسلسل في أو بالقرب من 3 'محطة من الحمض النووي الريبي هو دائما غير قابلة للوصول إلى الشكل، إلا إذا تم تصميم الحمض النووي الريبي لاحتواء 3' تمديد محطة (على سبيل المثال "كاسيت هيكل") الذي يمكن أن المهجنة التمهيدي 4.

الحمض النووي الريبي من خلال إعداد الكهربائي الشعري

على الرغم من الرنا من العينات البيولوجية قد يتم استخدامها لشكل الإنتاجية العالية، هو الأمثل لبروتوكول معين هنا للاطلاع على الحمض النووي الريبي التي تنتجها في النسخ المختبر. هيئة تنظيم الاتصالات التجاريةمجموعات nscription مثل MegaShortScript (AMBION) تستخدم في بالاشتراك مع MegaClear الأعمدة تنقية الحمض النووي الريبي (AMBION) هي مناسبة تماما لتوليد كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي نقية. يجب أن يتم تخزين الرنا في TE العازلة بين -20 درجة مئوية و -80 درجة مئوية. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن تظهر متجانسة الرنا من قبل كل تغيير طبيعة وغير تبديل طبيعة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام.

1. الحمض النووي الريبي للطي

  1. في أنبوب microcentrifuge 0.5 مل، وتمييع 12 بمول من الحمض النووي الريبي إلى 18 ميكرولتر مع الماء وإضافة 2 ميكرولتر من العازلة 10X استعادة الطبيعة. تخلط جيدا.
  2. الحرارة إلى 85 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية بمعدل 0.1 ° C / ثانية.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من المياه و 30 ميكرولتر من العازلة للطي 5X.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة، اعتمادا على الحمض النووي الريبي أن تطوى. بشكل عام، والمغنيسيوم 2 + للطي التي تعتمد من الرنا لفترة أطول، وأكثر تنظيما تتطلب مرات حضانة أطول.
  5. نقل قسامة ميكرولتر 72 إلى كل من اثنين من 0.5 مل أنابيب microcentrifuge: Modifiإد (+) والتحكم (-).

2. التعديل الكيميائي من الحمض النووي الريبي

تتميز جيدا، وتشمل الكواشف SHAPE بالإلكترونات أنهيدريد isatoic (IA)، أنهيدريد N-methylisatoic (NMIA)، أنهيدريد 1-الميثيل-7-نيترو isatoic (1M7) 26، وبيروكسايد السيانيد (BzCN) 27. من هؤلاء، والأكثر شيوعا لشكل عالية الإنتاجية هي 1M7 وNMIA، وفقط وهذا الأخير هو متاح تجاريا (لايف تكنولوجيز). يجب أن يكون الأمثل للتركيز النهائي من تعديل كاشف عن كل RNA للحصول على "ضرب واحد" حركية التعديل، أي الحالة التي يتم تعديل معظم الرنا في حل مرة واحدة في المنطقة من الحمض النووي الريبي التي يجري تحليلها 11. يمكن تحديد هذا التركيز الأمثل عن طريق إجراء التفاعلات المتعددة التي وتتنوع تركيز كاشف عبر مجموعة (ق) هو مبين في الجدول الوارد في القسم 2.1 أدناه. استخدام تركيز كاشف التي تنتج إشارة يمكن كشفها بسهولة في حين دقيقةimizing الفرق في كثافة إشارة بين المنتجات توليف الحمض النووي الطويل والقصير (على سبيل المثال الشكل 3).

الشكل (3)
الشكل (3). يتم عرض electropherograms SHAPE تنتج من ~ 360 NT RNA تعامل مع (A) 0 (B) 2.5 ملم أو (C) 10 ملي 1M7. جميع electropherograms على نفس النطاق. الأزرق والأخضر آثار والأحمر والأسود تتوافق مع (+) نواتج التفاعل (Cy5)، (-) منتجات التفاعل (Cy5.5)، وسلالم التسلسل اثنين (D2 WellRed وIRDye800)، على التوالي. وقد تم التعامل مع الحمض النووي الريبي المستخدمة لإنتاج صورة (B) مع كمية الأمثل لل1M7، مما يدل على القرار ذروة جيدة وكثافة، مع الحد الأدنى من تسوس إشارة في جميع أنحاء التتبع (إلى اليسار). قراءة طولها الأقصى في ظل هذه الظروف. في المقابل، فإن عدم وجود كثافة متوسطةensity، قمم حلها بشكل جيد في (A) يشير إلى وجود تركيز دون المستوى الأمثل من 1M7. على العكس، فإن تسوس إشارة واضحة في (C) يشير إلى أن حركية ضرب واحد لا يلاحظ، والحمض النووي الريبي هو الإفراط في تعديلها. في مثل هذه الحالات، وخصوصا عندما لن يكون من المتوقع أن تواجه RT 5 'نهاية من القالب الحمض النووي الريبي، وقراءة سوف يكون طول الأمثل.

  1. إعداد الأوراق المالية 10X من كاشف SHAPE (NMIA أو 1M7). وأفضل عن طريق إضافة كمية صغيرة من كاشف ل1.5 مل microfuge أنبوب، ثم إضافة DMSO لتحقيق التركيز المطلوب تحقيقه هذا الاهتمام: يجب أن تبقى الحلول كاشف SHAPE اللامائية حتى مختلطة مع الحمض النووي الريبي. مخزن DMSO في مجفف في درجة حرارة الغرفة، وإعداد الحلول الأسهم مباشرة قبل استخدامها من أجل تقليل التعرض لبخار الماء المحيط.
    الكاشف تركيز 10X الأمثل (في DMSO) الوقت للتدهور كاملة من كاشف 27
    NMIA 10-100 ملم ~ 20 دقيقة
    1M7 10-50 ملم 70 ثانية

    الجدول 1. الكواشف المستخدمة لبالإلكترونات RNA التعديل.
  2. إضافة 8 ميكرولتر 10X NMIA/1M7 أو اللامائية DMSO إلى تعديل (+) والتحكم (-) يمزج، على التوالي ملاحظة: أثبتت 2.5 ملم ليكون تركيز انطلاق فعالة لكلا NMIA و1M7، بغض النظر عن الحمض النووي الريبي التي يجري تحليلها.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة (NMIA) أو 5 دقائق (1M7)، حسب الاقتضاء.
  4. RNA يعجل من خلال إضافة 8 ميكرولتر (0.1 المجلد) من 3 M NaOAc (الرقم الهيدروجيني 5.2)، 8 ميكرولتر 100 ملي EDTA، 240 ميكرولتر (3 المجلد) من الايثانول الباردة و 1 ميكرولتر 10 ملغ / مل الجليكوجين. الثلاجة لمدة 2 ساعة ثم الطرد المركزي في XG 14،000 لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. يغسل بيليه مرتين مع الباردة الايثانول 70٪ انتباه: من المهم أنتقليل وقت التبريد، والوقت وسرعة الطرد المركزي من أجل تقليل شارك في ترسيب الملح، وهذا يمكن أن يؤثر سلبا الذروة قرار خلال الكهربائي.
  5. إزالة طاف مع micropipette، والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. حل RNA عجلت في 10 العازلة TE ميكرولتر واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. هذا يذوب يكفي الحمض النووي الريبي لمدة التفاعلات النسخ العكسي. تخزين الجزء غير المستخدم عند درجة حرارة -20 ° C. الاهتمام: إعادة تعليق الميكانيكية من بيليه هو عادة ليس ضروريا، وربما تلف الحمض النووي الريبي.

3. عكس النسخ

هذه الخطوة بإنشاء المنتجات [كدنا] fluorescently المسمى التي يتم استخدامها لتحديد بشكل غير مباشر إلى الدرجة التي النيوكليوتيدات RNA قد تم تعديلها من قبل كاشف الشكل. لشكل، كان أداء مرتفع الثالث (إينفيتروجن) RT متفوقة على سائر المحطة المذكورة التي تم اختبارها، وهو الانزيم الذي تم اختياره لاستخدامه مع هذاالبروتوكول. وتستخدم [أليغنوكليوتيد المسمى مع Cy5 وCy5.5 لرئيس (+) و (-) ردود الفعل، على التوالي. لالرنا أقصر، وتهجين الاشعال إلى 3 'تمديد محطة من الحمض النووي الريبي الأصلي (على سبيل المثال "كاسيت هيكل") من أجل الحصول على معلومات حول 3' محطة 4 انتباه: من هذه النقطة من خلال CE، ينبغي حماية عينات من ضوء.

  1. تحضير (+) و (-) لعينات النسخ العكسي في 0.5 مل أنابيب microfuge. ل(+) RT رد فعل، خلط 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي معدلة (+)، 6 ميكرولتر المياه و 1 ميكرولتر التمهيدي Cy5 المسمى (10 ميكرومتر)، وبالنسبة لل(-) RT رد فعل، خلط 5 ميكرولتر الحمض النووي الريبي السيطرة (-)، 6 ميكرولتر المياه، و 1 ميكرولتر Cy5 المسمى التمهيدي (10 ميكرومتر) انتباه: ينصح SARSTEDT PCR أنابيب (REF 72.735.002) لهذا التطبيق.
  2. أنابيب مكان في cycler الحرارية، ويصلب التمهيدي إلى الحمض النووي الريبي والاستعداد لعكس النسخ من خلال تطبيق البرنامج التالي: 85 درجة مئوية، 1 دقيقة، و 60 درجة مئوية، 5 دقائق؛35 ° C، 5 دقائق، و 50 درجة مئوية، وعقد.
  3. خلال الخطوة الصلب، وإعداد ما يكفي من مزيج 2.5x و RT لعدد من التفاعلات التي يتعين القيام بها، بالإضافة إلى 50٪ (على سبيل المثال لمدة سنتين (+) واثنين (-) ردود الفعل، ومقياس 4.5 أضعاف). رد فعل واحد يتطلب 8 ميكرولتر، على النحو التالي: 4 ميكرولتر العازلة RT 5X، 1 ميكرولتر 100 ملي DTT، 1.5 ميكرولتر المياه، 1 ميكرولتر dNTPs 10 ملم، 0.5 ميكرولتر مرتفع الثالث RT. الحفاظ على الجليد انتباه: يتم توفير العازلة RT 5X و 100 ملي DTT مع مرتفع الثالث RT.
  4. مرة واحدة في درجة حرارة يمزج الصلب يصل إلى 50 ° C، إضافة 8 ميكرولتر من 2.5X RT المزيج إلى (+) و (-) ردود الفعل التوصية: قم بتسخين المزيج RT إلى 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل إضافتها إلى ردود الفعل .
  5. احتضان لمدة 50 دقيقة عند 50 درجة مئوية، ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية و / أو مكان على الجليد ملاحظة: الحضانة من ردود الفعل RT لمدة أطول من 50 دقيقة قد يؤدي إلى تقديم منتجات كدنا] الشاذة.
  6. يتحلل RNA عن طريق إضافة 1 ميكرولتر 4 M هيدروكسيد الصوديوم والتدفئة إلى 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. ردود فعل باردة على الجليد ومن ثم تحييدها عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من 2 M حمض الهيدروكلوريك الاهتمام: إغفال هذه الخطوة نتائج سيئة في فصل جودة المنتجات [كدنا].
  7. الجمع بين (+) و (-) ردود الفعل ويعجل [كدنا] بإضافة 0.1 مج من 3 M NaOAc، المجلد 0.1 من 100 ملي EDTA، 1.5 مج من الايثانول الباردة و 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الجليكوجين. الثلاجة لمدة 2 ساعة، ثم الطرد المركزي في XG 14،000 لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. يغسل بيليه مرتين مع البرد 70٪ من الإيثانول الاهتمام: الطرد المركزي بمعدلات أعلى أو لنتائج فترة أطول في صعوبات إعادة التعليق على بيليه (ق).
  8. Resuspend مكعبات [كدنا] في 40 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات عن طريق تسخين إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم قبل vortexing قوية لأكثر من 30 دقيقة انتباه: الكريات قد تكون غير مرئية. عدم وجود إشارة أو إشارة ضعيفة التالية الكهربائي قد يكون نتيجة لعدم حل ملائم بيليه في هذه المرحلة.
ه "> 4. إعداد تسلسل سلم

سلالم التسلسل بمثابة علامات لتحديد موقف النوكليوتيدات أثناء معالجة البيانات. يتم إنشاء هذه باستخدام USB دورة تسلسل عدة (# 78500)، DNA وجود تسلسل نفس الحمض النووي الريبي التي تجري دراستها، والاشعال المسمى مع D2 WellRed أو D1/Lycor 800. عادة، سوف DNA المستخدمة في هذا الرد سيكون أن تستخدم كنموذج النسخ لRNA في السؤال. على الرغم من أن رد فعل بروتوكول المعروضة هنا يشبه أن موصى بها من قبل الشركة المصنعة عدة، فيتم قياس رد فعل حتى عدة أضعاف. بينما تستخدم إدارة شؤون نزع السلاح والدي دي تي وسلسلة الإنهاء في ردود الفعل هو موضح أدناه، أي زوج من الغلق يمكن استخدامها لتوليد سلالم التسلسل.

  1. خلط 40 ميكرولتر من مزيج إنهاء إدارة شؤون نزع السلاح، 5 بمول من الحمض النووي القالب، 4.6 ميكرولتر من العازلة Sequenase 10X، 10 ميكرولتر من WellRed D2 التمهيدي المسمى، 4.6 ميكرولتر من Sequenase والمياه لتبرزي حجم المشاركات إلى 82 ميكرولتر. إضافة Sequenase الماضي. PREPAإعادة رد فعل التسلسل الثاني بنفس الطريقة، وذلك باستخدام مادة الدي دي تي وLicor IR800 التمهيدي المسمى بدلا من ذلك.
  2. انتقل إلى التضخيم PCR باستخدام الشروط USB الموصى بها انتباه: ليس مطلوبا إضافة الزيوت المعدنية ولا أوصت لبروتوكولات / cyclers الحرارية التي تستخدم غطاء ساخنة.
  3. الجمع بين إدارة شؤون نزع السلاح والدي دي تي التسلسل ردود الفعل في واحد 1.5 مل microfuge أنبوب (~ 164 مجموع ميكرولتر).
  4. الحمض النووي يعجل كما يلي: إضافة 16 ميكرولتر 3 M NaOAc (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 16 ميكرولتر 100 ملي EDTA، 1 ميكرولتر 10 ملغ / مل الجليكوجين، و 480 ميكرولتر الايثانول 95٪. تخلط جيدا، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في XG 14،000 لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. Resuspend مكعبات [كدنا] في 100 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات عن طريق تسخين إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم قبل vortexing قوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.

5. تجزيء من منتجات التفاعل من قبل الكهربائي الشعري

الكهربائي الشعري يسمح في وقت واحدفصل من المنتجات التوليف [كدنا] من أربعة تفاعلات المجمعة في عينة واحدة. قد تكون ثماني عينات مجزأة في وقت واحد، في حين أن ما يصل الى 96 عينات قد تكون مجزأة خلال شوط واحد (الشكل 2).

  1. خلط 40 ميكرولتر من العينات المجمعة SHAPE مع 10 ميكرولتر من التسلسل سلالم المجمع، ونقل إلى لوحات عينة 96-جيدا انتباه: ومن الضروري أن بيكمان كولتر الكواشف واللوحات (بما في ذلك LPA-I هلام، تشغيل العازلة، الزيوت المعدنية، عينة يمكن استخدام التحميل الحل وعينة وألواح عازلة) مع CEQ 8000 محلل الوراثية بيكمان كولتر.
  2. برنامج وإعداد صك الكهربائي الشعري والشروع في تشغيل وفقا لتعليمات الشركات المصنعة ملاحظة: للحصول على أفضل قرار من العينات، استخدام المعلمات الأسلوب كافا نشرت سابقا 28.

من الناحية المثالية، خارج من التمهيدي وقمم قوية توقف، إشارات لكل الذروة في كل أربعة رحلاني ريجب أن تكون السباقات في مجموعة خطية؛ على الانزال التدريجي في إشارة غير مقبول. في بعض الأحيان، ومع ذلك، وقمم كبيرة (توقف) واضحة حتى في رد فعل السيطرة، وهذه يمكن أن تتداخل مع معالجة البيانات اللاحقة. يمكن cDNAs اقتطاع التي تؤدي إلى هذه القمم تكون نتيجة ذلك عقبة طبيعية أثناء النسخ العكسي (على سبيل المثال هيكل الثانوي RNA)، أو تدهور الحمض النووي الريبي. في الحالة الأولى، قد المضافة مثل البيتين تحسين RT processivity والحد من التوقف إنهاء RT / سابقا لأوانه.

معالجة المعلومات

ShapeFinder البرنامج يسمح للمستخدم لتصور وتحويل آثار CE وتحويلها إلى ملفات تعريف تفاعل SHAPE 18. مرة واحدة يتم جدولتها القيم التفاعل، يتم تطبيع أنها والمستوردة إلى RNAStructure (V5.3) لإنشاء وصقل النماذج الهيكلية الثانوية.

6. ShapeFinder البرامج

امتدادا للBaseFinder تتبع تجهيز بلاتشكل 29، النسخة المنشورة من ShapeFinder هي متاحة بحرية للاستخدام غير التجاري 18. وتقدم تعليمات مفصلة لمعالجة البيانات في ShapeFinder مع وثائق البرنامج.

  1. يتم استيراد Electropherograms من CEQ إلى ShapeFinder، حيث تم تعديل أنها لتصحيح ل (ط) خلفية فلوري، (الثاني) التداخل بين القنوات الطيفية الفلورسنت، (الثالث) التحولات التنقل الكشف عنها من قبل الاشعال الموسومة بشكل مختلف، (رابعا) فروق في كثافة الإزهار من المنتجات الشائعة المسمى مع fluorophores مختلفة، و(V) الاضمحلال إشارة الناتجة عن الإنهاء السابق لأوانه النسخ العكسي.
  2. "إعداد" عمل "محاذاة ودمج" أداة في ShapeFinder تلقائيا بتعيين الهويات إلى قمم الفردية ويرتبط هذا إلى تسلسل الحمض النووي الريبي على النحو المحدد من قبل إدخال المستخدم واثنين من السلالم التسلسل. على الرغم من أن مهام الأولية عادة ما تكون ناقصة، يمكن تصحيح الأخطاء يدويا باستخدام "تعديل" وظيفة مننفس الأداة. وأخيرا، يحسب وظيفة "صالح" المناطق الخاضعة لالانحياز (+) و (-) قمم رد فعل، ويجدول هذه القيم التفاعل جنبا إلى جنب مع عدد النوكليوتيدات المناظرة في ملف نصي المفصول.

ملاحظة: تحليل البيانات أمر بالغ الأهمية لدقة الشكل، وبعض الاعتبارات مهمة جدا خلال هذا التحليل، بما في ذلك:

  • إشارة إلى الضوضاء: إن نسبة الإشارة إلى الضوضاء يجب أن يكون مثل هذا أن القمم ينبغي أن يكون الفرد حتى يسهل التعرف عليها لشغل وظائف مع تفاعل المنخفض. على الرغم من ShapeFinder يوفر خيار تجانس البيانات، وهذا البديل يجب أن تستخدم بحذر شديد، كما أنه يمكن تحليلها لاحقا الانحراف.
  • المنطقة التحليل: عادة، يمكن الحصول على بيانات موثوقة من cDNAs 300-600 NT طويلة، بدءا من منطقة 40-80 NT إزالتها من التمهيدي 3 'محطة وتنتهي كما يضمحل إشارة إلى مستويات يصعب التمييز من الضوضاء في الخلفية. استخدام متعددسوف تكون هناك حاجة مجموعات التمهيدي التنوير القائل لتحليل تمتد أطول من الحمض النووي الريبي. في هذه الحالة، فمن المستحسن أن التداخل في إشارة موثوقة بين مجموعات التمهيدي هو في حدود 30-50 NT. على الرنا أقصر، حيث الناسخ العكسي في كثير من الأحيان تصل إلى نهاية القالب الحمض النووي الريبي، ويجب الحرص على استبعاد تلك القمم التي يتأثر الحمض النووي التوليف محطة قوية إشارة إلى نسبة الضوضاء.
  • تسوس إشارة: ويرتبط تسوس إشارة إلى مدى RNA التعديل خلال التجربة وكذلك processivity ناقص من RT. من الناحية المثالية، حركية التى ضربها واحد نسبة إلى منطقة من الحمض النووي الريبي التي يجري تحليلها ينبغي أن يتحقق من أجل تحقيق أقصى قدر من قراءة طول. Shapefinder يحتوي على أداة التي هي فعالة في تصحيح لتسوس إشارة، ومع ذلك، لأن هذا يميل إلى إدخال خطأ في التحليل - وخاصة عندما لا تراعى حركية ضرب واحد، ويتم استخدامها على أفضل وجه عندما تسوس إشارة هو الحد الأدنى (أي عندما يكون توزيع قمم غير متسقة مع واحد ضرب بقراتالتشنجات اللاإرادية). مؤخرا، تم نشر تحسين خوارزميات لتحويل إشارة تسوس إشارة 30 وينبغي التحقيق إذا تسوس إشارة تبعث على القلق خاصة في تجربة معينة.
  • إشارة التحجيم. يمكن القول إن الخطوة الأكثر التعسفي في معالجة البيانات الشكل، ينبغي أن تقاس الملف الشخصى التحكم بحيث شدة الذروة بين رد الفعل الحد الأدنى (+) و (-) آثار متساوون. سوف توسيع نطاق التتبع التحكم إلى حد كبير جدا يؤدي إلى وفرة من القيم تفاعل سلبي في الربع الأول (انظر تطبيع البيانات أدناه). في هذا الحدث، ينبغي خفض عامل المقياس وفقا لذلك وبيانات إعادة إدماجهم.
  • قمم الاحالة. في العام، وإصدار الآلي للاحالة الذروة يعمل بشكل جيد. عند فشل هذه العملية، ومع ذلك، لا بد من أن المستخدم التأكد من أن جميع القمم قد تم الاعتراف بها من قبل البرنامج، وخاصة عندما تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة. قمم الكتف، على سبيل المثال، لم يتم الكشف عنها دائما، وG الغنية SEوغالبا ما مضغوط quences.

7. تطبيع البيانات

لدمج ملامح تفاعل النوكليوتيدات إلى الخوارزمية المستخدمة من قبل هيكل الثانوي RNAStructure (V5.3) والبرمجيات، و / أو لمقارنة محات من الرنا وثيقة الصلة، يجب تطبيع البيانات SHAPE بطريقة موحدة 12. وهذا ينطوي على (أنا) باستثناء القيم المتطرفة من الحسابات اللاحقة، (ثانيا) تحديد "الأقصى فعالة" التفاعل (أي بمعدل أعلى من 8٪ من قيمة التفاعل، باستثناء القيم المتطرفة)، و (ثالثا) تطبيع بقسمة جميع القيم تفاعل من قبل "الأقصى فعالة"، كما يلي:

  1. فتح ملف نصي المفصول إنشاؤها بعد المواءمة والتكامل ونسخ محتوياتها إلى جدول بيانات Excel. يحتوي العمود أقصى اليمين من هذا الملف (RX.area-BG.area) المحسوبة المطلقة القيم تفاعل SHAPE لكل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي. الأعمدة أقصى اليسار تتصل هذا التفاعل إلى sequ RNAسينعقد.
  2. حساب وتخزين الربع الأول وثلثي (أي المئين 25 و 75) القيم (RX.area-BG.area) باستخدام دالة Excel "= الربع (صفيف، رابعا)"
  3. حساب وتخزين الفرق الربيعي "= الربع (صفيف، 3)، الربع (صفيف، 1)"
  4. حساب وتخزين "قيمة قطع ناشز" باستخدام صيغة "= (الربع، مجموعة، 3) +1.5 * ((الربع (صفيف، 3)، الربع (صفيف، 1))". جميع تفاعل القيم الأكبر من هذه القيمة يتم سيتم استبعادها من الحسابات اللاحقة.
  5. نسخ القيم من التفاعل (RX.area-BG.area) ولصقها في ل، عمود فارغ مجاور، ثم فرز هذه القيم مثل أن أعظم هي في الجزء العلوي من العمود.
  6. في المنشأة حديثا "عمود القيم فرز"، حذف القيم أكبر من قيمة قطع عزلاء.
  7. حساب وتخزين متوسط ​​من أعظم 8٪ من قيم التفاعل المتبقية في "الفرز القيم coluMN ". هذه القيمة هي" الأقصى "تفاعل فعال.
  8. تقسيم لم يتم فرزها (RX.area-BG.area) من كل النوكليوتيدات (بما في ذلك القيم المتطرفة) من قبل "أقصى فعالية" قيمة التفاعل للحصول على "القيم تفاعل تطبيع". تخزين هذه في عمود فارغ، وترك عمود فارغ إلى اليسار. ثم، قم بنسخ أرقام النوكليوتيدات في الجهة اليسرى من الجدول ولصقها في العمود فارغة مباشرة إلى اليسار من "القيم تفاعل تطبيع".
  9. نسخ ولصق النوكليوتيدات موقف تطبيع أزواج قيمة التفاعل في محرر نص.
  10. القضاء على القيم أدناه -0.09 (أي ترك مسافات فارغة)، وهذه هي على الأرجح نتيجة لRT التوقف خلال التوليف [كدنا] لأسباب أخرى من التعديل الكيميائي للقالب. وعلاوة على ذلك، أي القيم تفاعل لالنيوكليوتيدات التي لوحظ قوي التوقف على قالب معدلة (على النحو الذي يحدده الفحص البصري من "محاذاة ودمج" ShapeFinder الشخصي)، وينبغي استبعادها.
  11. SAهاء ملف بملحق. شكل لاستخدامها في التحليل البنيوي مع RNAstructure (V5.3) والبرمجيات.

8. نمذجة البيانات

يستخدم RNAstructure (V5.3) برنامج للتنبؤ المدعومة بالتجربة هيكل الثانوي الحمض النووي الريبي (ق) باستخدام طاقة خالية من القيود الزائفة المستمدة من تحليل SHAPE 19. يوفر البرنامج تمثيلات رسومية من الطاقة أقل هياكل الحمض النووي الريبي 2D وكذلك تمثيل نصية من هذه الهياكل في تدوين الدوت قوس. يمكن استيراد هذه الأخيرة في بنية الحمض النووي الريبي من المشاهد تفضيل المستخدم، على سبيل المثال Pseudoviewer 23 أو 22 فارنا، لإنتاج صور ذات جودة المنشور.

ملاحظة: يجب توخي الحذر عند النظر في الهياكل التي تنتجها RNAstructure (V5.3) والبرمجيات. على سبيل المثال، يمكن للبرنامج لا حل التفاعلات العالي مثل pseudoknots والحلقات التقبيل، ولا يمكن أن تميز ما إذا كان عدم وجودويرجع ذلك إلى حماية basepairing أو الفراغية من البروتينات ملزمة للتفاعل في منطقة معينة. ونتيجة لذلك، فإن هذه العوامل، جنبا إلى جنب مع الطاقات ذكرت لهياكل فردية، يجب أخذها في الاعتبار عند تقديم النموذج الهيكلي النهائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الحمض النووي الريبي التي تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية REV-1 عنصر استجابة (RRE) وأعدت 3 'هيكل محطة راديو كاسيت 4 من البلازميد خطي من قبل في النسخ المختبر، وبعد ذلك كانت مطوية عن طريق التسخين والتبريد، والحضانة عند 37 درجة مئوية في وجود من MgCl 2. تعرضت RNA إلى NMIA ومن ثم الانعطاف من كتب التمهيدي الحمض النووي 5'-نهاية المسمى المهجنة إلى 3 'هيكل محطة راديو كاسيت. الناتجة SHAPE مكتبة [كدنا]، جنبا إلى جنب مع ردود فعل السيطرة والتسلسل، ثم كان مجزأ باستخدام كولتر CEQ 8000 النظام الآلي الكهربائي الشعري بيكمان لإنتاج رحلاني مبين في الشكل (4). ويتم إنتاج أربعة متداخلة، اللون آثار الأكواد عن طريق الهجرة من أربع مجموعات من منتجات التفاعل من خلال الشعيرات الدموية، كما يلي: الأزرق (منتجات RT Cy5 المسمى المتولدة من النسخ العكسي من NMIA معدلة والرنا)، والأخضر (Cy5.5 المسمى المنتجات RT من مطوية، ولكن على خلاف ذلك unmodifiالرنا إد)، والسوداء (WellRed D2 المسمى DNA التسلسل سلم إنشاؤها باستخدام نائب المدير العام) والأحمر (Lycor800 المسمى سلم التسلسل، DDT).

تم فصل آثار CE الخام وتجهيزها الانحياز ومتكاملة باستخدام البرمجيات ShapeFinder 18. ويصور المنطقة من تتبع (ق) المقابلة لمنطقة SLII RRE في الشكل 5، بعد أن تم تجهيزها والبيانات إلى نقطة مباشرة قبل ذروة التكامل (أي، تم الانحياز آثار، تعرض لخلفية الطرح، وتصحيح لتسوس إشارة ، الخ). يتم حساب القيم تفاعل لكل النوكليوتيدات من خلال دمج قمم المقابلة في NMIA (+) وNMIA (-) ردود الفعل (في آثار الزرقاء والخضراء، على التوالي)، وطرح هذا الأخير من السابق. هذه القيم تفاعل بيان مدى الذي RT تنتهي في كل النوكليوتيدات خلال النسخ العكسي، والذي هو انعكاس للدرجة التي كل النوكليوتيدات تم تعديلها من قبل NMIAوبالتالي نزوعها إلى أن تقطعت بهم السبل واحد في الحل.

تم تطبيع-1 فيروس نقص المناعة البشرية RRE SHAPE الشخصي تفاعل ولدت في ShapeFinder وتحويلها إلى مستند نصي مناسبة للاستيراد إلى RNAStructure (V5.3) 19. في البرنامج الأخير، أدرجت القيم تفاعل في بنية الخوارزمية التنبؤ الثانوية والقيود الزائفة الطاقة، وبالتالي التأثير الذي من المتوقع هياكل لديها أدنى الطاقة الحرة. ويتألف برنامج انتاج اثنين من الأبعاد الحمض النووي الريبي خرائط هيكل الثانوي تصور هياكل أدنى الطاقة التي تولدها الخوارزمية فضلا عن ملفات نصية تحتوي على هذه الهياكل التي أعرب عنها في الدوت قوس التدوين. يمكن أن يصدر هذا الأخير من هذه النواتج في الحمض النووي الريبي البرمجيات التصور مثل VARNA 22. ويبين الشكل 6 هيكل 2D المنطقة فيروس نقص المناعة البشرية RRE SLII ولدت في RNAStructure (V5.3) باستخدام ملفات تعريف تفاعل SHAPE المشتقة وتصور باستخدام VARNA. يتم فرضه ونا مميزا القيم تفاعل الشكل.

الشكل 4
الشكل 4. . رحلاني ممثل لعينة الحمض النووي الريبي عرضها في CEQ 8000 نظام التحليل الوراثي (بيكمان) البرنامج يعرض التتبع حيث يظهر كل قناة كخط الملونة: قنوات الزرقاء والخضراء تمثل (+) كاشف و (-) تجارب الكاشف، والسوداء والحمراء تمثل سلالم التسلسل. X-Y-ومحاور دلالة وقت القرار وكثافة مضان، على التوالي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.

files/ftp_upload/50243/50243fig5.jpg "/>
الشكل 5. رحلاني التحليل باستخدام الأدوات ShapeFinder 18. إطار عرض البيانات (وسط) يقدم ملاحظات رسومية على كل خطوة معالجة البيانات. نافذة المفتش أداة (أسفل اليسار) يعرض المعلمات للأداة المحددة في المفتش البرمجة. يعرض المفتش البرمجة (أعلى اليمين) تلك الأدوات التي تم تطبيقها على البيانات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.

الشكل (6)
الشكل (6). ثنائي الأبعاد الحمض النووي الريبي لون هيكل ترميز للتفاعل SHAPE إنشاؤها باستخدام التطبيق الصغير التصور VARNA 22. هي مرمزة النيوكليوتيدات للإشارة إلى درجة (ق) من تفاعل الشكل. فيالطيف هو مبين، الدوائر الزرقاء والحمراء تشير النيوكليوتيدات وجود تفاعل المنخفضة والعالية، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم هنا بروتوكول مفصلة لشكل الإنتاجية العالية، وهي تقنية تسمح تحديد هيكل الثانوي لقرار النوكليوتيدات واحد لالرنا من أي حجم. وعلاوة على ذلك، اقتران بيانات الشكل التجريبية مع خوارزميات التنبؤ هيكل ثانوي يسهل جيل من الحمض النووي الريبي نماذج 2D مع درجة أعلى من دقة مما هو ممكن مع إما الأسلوب وحده. مزيج من الاشعال fluorescently المسمى وCE الآلي يوفر مزايا هامة على شكل التقليدي القائم على هلام، وتسهيل قرار من تسلسل الحمض النووي الريبي طويلة في تجربة واحدة، فضلا عن ارتفاع كبير السرعة والإنتاجية للتجارب متعددة. والنفعية لهذا الأسلوب وتوافر مناسبة أدوات تحليل البيانات جعل SHAPE مثالي مناسبة لتحليل الهيكلية المستعصية سابقا الفيروسية، رسول سليمة، والرنا غير المكودة. مثل الهياكل 2D هذه الرنا للفضول تصبح أكثر وضوحا، واستخدام الهيدروكسيل التحقيق، من خلال-SPAيجب منهجيات انشقاق م، والنمذجة الجزيئية المساعدة في الكشف التفاعلات المعقدة العالي وتسمح في نهاية المطاف الباحثين لتحديد هياكل هذه الرنا في ثلاثة أبعاد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

معتمدة S. Lusvarghi، J. Sztuba-Solinska، KJ Purzycka، JW RAUSCH وSFJ لو جريس من قبل برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة بالولايات المتحدة الأمريكية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
N-methylisatoic anhydride (NMIA) Life technologies M25 Dissolve in anhydrous DMSO
1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7) see ref. 22
Superscript III Reverse Transcriptase Life technologies 18080044 10,000 units
Thermo sequenase cycle sequencing kit Affymetrix 78500
Materials provided by the user
RNA of interest 6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)
Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800) Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.
DNA template DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.
Buffers
10x RNA renaturation buffer 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X RNA folding buffer 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)
2.5X RT mix 4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1.5 μl water,1 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).
GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter) Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles
EQUIPMENT
Capillary electrophoresis Beckman CEQ8000
Thermocycler varies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
  2. Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).
  3. Wilkinson, K. A., et al. High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states. Plos Biol. 6, 883-899 (2008).
  4. Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE). J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).
  5. Watts, J. M., et al. Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome. Nature. 460, 711-716 (2009).
  6. Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids. Mol. Plant Pathol. , (2012).
  7. Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator. Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).
  8. Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE. RNA Biol. 8, 478-487 (2011).
  9. Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding. J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).
  10. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).
  11. McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly. Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).
  12. Low, J. T., Weeks, K. M. SHAPE-directed RNA secondary structure prediction. Methods. 52, 150-158 (2010).
  13. Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).
  14. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467, 103-107 (2010).
  15. Underwood, J. G., et al. FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing. Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).
  16. Mauger, D. M., Weeks, K. M. Toward global RNA structure analysis. Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).
  17. Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).
  18. Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis. RNA. 14, 1979-1990 (2008).
  19. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  20. Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis. Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).
  21. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).
  22. Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).
  23. Byun, Y., Han, K. PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures. Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).
  24. Brown, T., Brown, D. J. S. Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. Eckstein, F. , IRL Press. 20 (1990).
  25. Legiewicz, M., et al. The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function. J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).
  26. Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7). Protocol Exchange. , (2011).
  27. Mortimer, S. A., Weeks, K. M. A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).
  28. Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis. Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).
  29. Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. A software system for data analysis in automated DNA sequencing. Genome Res. 8, 644-665 (1998).
  30. Aviran, S., et al. Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).

Tags

علم الوراثة، العدد 75، البيولوجيا الجزيئية، الكيمياء الحيوية، علم الفيروسات، علم الأحياء السرطان، الطب، علم الجينوم، اختبارات الأحماض النووية، مجسات RNA، RNA، SHAPE عالية الإنتاجية، الكهربائي الشعري وبناء RNA، RNA التحقيق، RNA وبناء الثانوية للطي، والحمض النووي، الأحماض النووية، رحلاني، والتوليف، والنسخ، والإنتاجية العالية، والتسلسل
RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lusvarghi, S., Sztuba-Solinska, J.,… More

Lusvarghi, S., Sztuba-Solinska, J., Purzycka, K. J., Rausch, J. W., Le Grice, S. F. J. RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE. J. Vis. Exp. (75), e50243, doi:10.3791/50243 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter