ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

Summary

Haut-débit sélectif 2 'acylation hydroxyle analysés par extension d'amorce (SHAPE) utilise une nouvelle chimique sonder la technologie, la transcription inverse, l'électrophorèse capillaire et les logiciels de prédiction de structure secondaire pour déterminer les structures des ARN de plusieurs centaines à plusieurs milliers de nucléotides à une résolution au nucléotide.

Abstract

Comprendre la fonction de l'ARN impliqués dans les processus biologiques requiert une connaissance approfondie de la structure de l'ARN. À cette fin, la méthodologie baptisée «haut débit 2 sélectif 'acylation hydroxyle analysés par extension d'amorce» ou la forme, permet de prédire la structure secondaire de l'ARN avec une résolution au nucléotide. Cette approche utilise des agents chimiques de sondage qui ACYLATE préférentiellement régions câblé ou flexible simples d'ARN en solution aqueuse. Sites de modification chimique sont détectés par transcription inverse de l'ARN modifié, et les produits de cette réaction sont fractionnés par électrophorèse capillaire automatisé (CE). Depuis la transcriptase inverse s'arrête à ces nucléotides d'ARN modifiées par les réactifs de forme, la banque d'ADNc résultant mappe indirectement ces ribonucléotides qui sont simple brin dans le contexte de l'ARN repliées. Utiliser un logiciel de ShapeFinder, les électrophérogrammes produites par automatisé CE sont traités et transformés en nutables de réactivité cleotide qui sont eux-mêmes transformés en contraintes pseudo-énergie utilisée dans le RNAStructure (v5.3) de l'algorithme de prédiction. Les structures d'ARN à deux dimensions obtenues par combinaison d'une forme de sondage avec in silico ARN prédiction de structure secondaire ont été trouvés à être beaucoup plus précis que les structures obtenues en utilisant soit la méthode utilisée seule.

Introduction

Pour comprendre les fonctions des ARN catalytiques et non-codantes impliquées dans la régulation de l'épissage, la traduction, la réplication du virus et le cancer, une connaissance détaillée de la structure d'ARN est nécessaire ^1,2. Malheureusement, la prédiction exacte du repliement des ARN constitue un formidable défi. Agents de sondage classiques souffrent de nombreux inconvénients tels que la toxicité, la couverture de nucléotides incomplètes et / ou le débit limité à 100-150 nucléotides par expérience. Secondaires algorithmes de prédiction de structure spontanées sont tout aussi désavantageux, en raison d'inexactitudes résultant de leur incapacité à distinguer efficacement entre les structures énergiquement similaires. Grand ARN, en particulier, sont également souvent réfractaires aux procédés de détermination de la structure 3D telle que la cristallographie aux rayons X et par résonance magnétique nucléaire (RMN), en raison de leur flexibilité conformationnelle et de grandes quantités d'échantillons de grande pureté nécessaires à ces techniques.

HSHAPE aute-débit permet de résoudre nombre de ces problèmes en fournissant une approche efficace, simple à sonder les structures des grands ARN à la résolution d'un nucléotide simple. En outre, les réactifs utilisés pour la forme sont sûrs, faciles à manipuler et, contrairement à la plupart des autres produits chimiques sondage réactifs, réagissent avec les quatre ribonucléotides. Ces réactifs peuvent aussi pénétrer dans les membranes cellulaires, ce qui permet de sonder ARN dans leur contexte in vivo (s) ^3. Initialement développé dans les semaines laboratoire ^4, SHAPE a été utilisée pour analyser une grande variété d'ARN, l'exemple le plus notable étant la détermination de la structure secondaire complète du ~ 9 kb ARN du VIH-1 du génome ^5. Autres réalisations notables en utilisant SHAPE comprennent élucidation des structures de viroïdes infectieuses ^6, ARN humains longs non codants ^7, les ribosomes de levure ⁸ et ⁹ riboswitches ainsi que d'identifier les sites de liaison de protéines à virion associée à ARN VIH-1 ^3. While aux variations originales et haut débit du protocole du SHAPE ont été publiés ailleurs ^10-12, le présent ouvrage fournit une description détaillée de l'ARN détermination de la structure secondaire par le SHAPE à haut débit en utilisant des oligonucléotides fluorescents, le Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer Beckman, et (v5.3) Logiciel de ShapeFinder et RNAStructure. Détails techniques inédites et des conseils de dépannage sont également inclus.

Variations de forme

L'essence de forme et de ses variations est une exposition de l'ARN en solution aqueuse à des anhydrides électrophiles qui acyler sélectivement 2'-hydroxyle (2'-OH), groupes ribose, produisant des produits d'addition encombrants dans les sites de modification. Cette réaction chimique est un moyen d'interroger la dynamique des structures d'ARN locales, nucléotides simple brin sont plus enclins à adopter des conformations favorables à une attaque électrophile par ces réactifs, tandis que la base jumelé ou architectural constructionnucléotides ained sont moins ou pas réactif ^10. Sites de la formation d'adduits sont détectés par transcription inverse à partir d'amorces initier par fluorescence ou radioactif hybridées à un site spécifique sur l'ARN modifié (le "(+)" réaction d'extension d'amorce). Lorsque la transcriptase inverse (RT) ne parvient pas à traverser les ribonucléotides acylés, un pool de produits d'ADNc est produit dont les longueurs coïncider avec les sites de modification. Un contrôle "(-)" primer extension de réaction en utilisant l'ARN qui n'a pas été exposé à un réactif est également effectuée de sorte que la résiliation prématurée de la synthèse d'ADN (par exemple, «arrêts») en raison de structure de l'ARN, non spécifique bris à ARN, etc, mai. être distinguée de faire une pause produite par modification chimique. Enfin, deux réactions séquençage didésoxy initiateurs des mêmes amorces sont utilisés comme marqueurs de corréler nucléotides réactifs avec la séquence primaire d'ARN après électrophorèse.

Dans la demande initiale de ShapE, le même ^{32P-fin-amorce} marquée est utilisée pour la (+) - et les deux réactions de séquençage (). Les produits de ces réactions sont chargés dans des puits adjacents dans un gel de polyacrylamide de la dalle de 5-8%, et fractionné par électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide (PAGE; figure 1). L'analyse quantitative des images de gel produites par forme classique peut être réalisée en utilisant SAFA, un logiciel d'analyse de l'empreinte semi-automatique ^13.

En contraste, la forme à haut débit utilise des amorces marquées par fluorescence et électrophorèse capillaire automatisé. Plus précisément, pour chaque région d'ARN sous enquête, une série de quatre amorces d'ADN ayant une séquence commune mais différente 5 'marqueurs fluorescents doivent être synthétisés ou achetés. Ces oligonucléotides différemment marquées premiers servent à deux réactions de forme et deux réactions de séquençage, dont les produits sont regroupés et fractionné / détectés par électrophorèse capillaire automatisée (CE). WherEAS le profil de réactivité de 100-150 nt de l'ARN peut être obtenue à partir d'un ensemble de quatre réactions en utilisant l'approche originale, SHAPE à haut débit permet une résolution de 300-600 nt partir d'un seul échantillon composite ^3. Jusqu'à 8 séries de réactions peut être fractionné en même temps, alors que pas moins de 96 échantillons peuvent préparé pour le fractionnement au cours de 12 séries consécutives CE (Figure 2). En outre, le logiciel de ShapeFinder, développé pour traiter et analyser les données issues de la CEQ et autres analyseurs génétiques, est plus automatisé et requiert beaucoup moins d'intervention de l'utilisateur que SAFA ¹³ ou d'autres paquets gel-analyse.

Méthodologies à haut débit les plus avancées ont récemment émergé comme PARS (analyse parallèle de structure de l'ARN) ¹⁴ et Frag-Seq (fragment de séquençage) ^15, qui utilisent des enzymes structure spécifique plutôt que réactifs d'alkylation en conjonction avec la prochaine génération de techniques de séquençage à obtenir information sur la structure d'ARN. Malgré l'attrait de ces techniques, les nombreuses limitations inhérentes à la nucléase sondage demeurent ^16. Ces problèmes peuvent être contournés dans le séquençage du SHAPE (SHAPE-Seq) ¹⁷ protocole, où le séquençage de prochaine génération est précédée par modification chimique et la transcription inverse de l'ARN d'une manière similaire à celle réalisée en forme classique. Bien que ces méthodes peuvent représenter l'avenir de la détermination de la structure de l'ARN, il est important de se rappeler que le séquençage de prochaine génération est très coûteux, et reste disponible pour de nombreux laboratoires.

Analyse de données de forme

Les données produites dans l'analyseur génétique est présenté sous la forme d'un électrophérogramme, dans lequel l'intensité de la fluorescence de l'échantillon (S) s'écoulant à travers le détecteur capillaire est tracée en fonction d'un index de temps de migration. Cette parcelle prend la forme de traces superposées correspondant au canal de quatre fluorescences utilisé pour détecter les fluorophores différents, et où chaque trace est constituée de pics correspondant à des produits de séquençage d'ADNc ou individuels. données Electrophorégramme sont exportées de l'analyseur génétique comme un fichier texte délimité par des tabulations et importés dans la transformation de ShapeFinder et des logiciels d'analyse ^18.

ShapeFinder est initialement utilisé pour effectuer une série de transformations mathématiques sur les données afin de s'assurer que les temps de migration et les volumes de pointe reflètent avec précision les identités et les quantités de produits de réaction, respectivement. Les pics sont alors alignés et intégrés, et les résultats compilés avec la séquence d'ARN primaire. Un "profil de réactivité" pour le segment pertinent de l'ARN est obtenue en soustrayant les valeurs de contrôle à partir des valeurs (+) associé à chaque nucléotide d'ARN, et normaliser les données comme décrit ci-dessous. Ce profil est importé dans RNAstructure (v5.3) ^19,20 logiciels, qui convertit le val de réactivité normaliséeues en contraintes pseudo-énergie qui sont incorporés dans l'algorithme de pliage de la structure secondaire de l'ARN. La combinaison chimique de sondage et de pliage algorithmes de cette manière améliore considérablement la précision de la prédiction de la structure par rapport à chaque méthode seule ^12,21. La sortie de RNAstructure (v5.3) comporte des images de la plus basse énergie structures secondaires d'ARN codés par couleur avec le profil du SHAPE de réactivité (s), ainsi que les mêmes structures en notation point-support textuel. Celui-ci peut ensuite être exporté vers un logiciel dédié à l'affichage graphique de la structure secondaire de l'ARN tels que Varna ²² et PseudoViewer ^23.

Figure 1. Organigramme de la détermination de la structure de l'ARN via SHAPE ^4,10. (A) ARN may être obtenue à partir d'échantillons biologiques ou par transcription in vitro. (B) Selon la source, l'ARN est plié ou autrement traité et modifié avec le réactif du SHAPE. (C) La transcription inverse en utilisant des amorces fluorescente ou radioactive étiquetés. (d) les produits d'ADNc sont fractionné soit par électrophorèse en gel capillaire ou de la dalle. (E) l'analyse de fragments. (F) ARN prédiction de la structure. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 2. Le caractère à haut débit de FORME CE à base permet l'analyse rapide de plusieurs ARN, et / ou plusieurs segments de la même ARN. (A) (b) les articles de l'ARN sont détectés indépendamment en utilisant différents jeux d'amorces fluorescentes (flèches noires) (C) ensembles de les réactions sont mises en commun et chargés dans les puits A1, B1, C1, etc, respectivement, en fournissant une couverture complète pour l'ARN 1 ~ 3 kb. Les produits de réaction à partir d'ARN 2, 3, 4, etc peuvent être préparés de manière similaire pour le fractionnement dans les courses électrophorétiques consécutifs. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Protocol

conception d'amorce et l'extension du terminal de l'ARN 3 '

Pour analyser les longs ARN par le SHAPE à haut débit, une série de sites d'hybridation des amorces doit être choisi de telle sorte qu'ils (i) sont séparés par environ 300 nt, (ii) sont 20-30 nt en longueur, et (iii) que l'ARN / hybrides d'ADN produites par un recuit d'ADN à ces sites ont une température de fusion prévue de> 50 ° C. En outre, des segments d'ARN qui sont prévus pour être très structurées doivent être évités, mais prend une telle décision nécessite une certaine connaissance préalable de la structure de l'ARN, ce qui est souvent indisponible. amorces d'ADN qui s'hybrident à ces sites doivent alors être conçus en prenant soin de veiller à ce qu'ils ne seraient pas censés former des dimères stables ou structures secondaires intrabrin.

Une fois conçu, jeux d'amorces doivent être soit achetés (par exemple à partir de l'ADN Integrated Technologies, Ames, Iowa) ou synthétisés ^24,25. Amorces 5'-étiqueté avec Cy5, Cy5.5,WellRedD2 (Beckman Coulter) et IRDye800 (LYCOR) / WellRedD1 (Beckman Coulter) sont les mieux adaptés pour le Beckman Coulter CEQ 8000, offrant une bonne intensité du signal, tout en minimisant la diaphonie. Oligonucléotides marqués peuvent être stockées indéfiniment dans de petites portions de 10 pM à -20 ° C; éviter les cycles de congélation / décongélation.

En utilisant des amorces conçues de cette manière, il est possible d'obtenir des données de forme pour la quasi-totalité d'un ARN de n'importe quelle longueur. Cependant, la séquence à ou près de l'extrémité 3 'd'un ARN est toujours inaccessible à la forme, à moins que l'ARN est conçue pour contenir une extension 3' de la borne (par exemple, une "cassette de structure") auquel une amorce peut être hybridée ^4.

Préparation d'ARN par électrophorèse capillaire

Bien ARN à partir d'échantillons biologiques peuvent être utilisés pour la forme à haut débit, le protocole donné ici est optimisé pour l'ARN produite par transcription in vitro. Commercial trakits de nscription comme MegaShortScript (Ambion) est utilisé en conjonction avec MegaClear colonnes de purification d'ARN (Ambion) sont bien adaptés à générer de grandes quantités d'ARN pures. ARN doivent être stockés dans un tampon TE comprise entre -20 ° C et -80 ° C. Pour de meilleurs résultats, les ARN devraient apparaître homogène tant par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant et non dénaturant.

1. Repliement des ARN

1. Dans un tube de 0,5 ml, diluer 12 pmol d'ARN à 18 pi avec de l'eau et ajouter 2 pi de tampon de renaturation 10X. Mélangez bien.
2. Chauffer à 85 ° C pendant 1 min, puis refroidir à 4 ° C à une vitesse de 0,1 ° C / s.
3. Ajouter 100 ul d'eau et 30 pi de tampon de pliage 5X.
4. Incuber à 37 ° C pendant 30 à 60 min, en fonction de l'ARN étant pliées. En général, Mg ^{2 +} pliage en fonction de l'allongement, et plus structurée ARN nécessitent des temps d'incubation plus longues.
5. Transférer une aliquote de 72 à chacun des deux tubes à centrifuger de 0,5 ml: Modified (+) et le contrôle (-).

2. modification chimique de l'ARN

Eh bien caractérisée, réactifs SHAPE électrophiles comprennent l'anhydride isatoïque (IA), l'anhydride N-méthylisatoïque (NMIA), l'anhydride 1-méthyl-7-nitro-isatoïque (1M7) ^26, et le cyanure de benzoyle (BzCN) ^27. Parmi ceux-ci, le plus couramment utilisé pour la forme à haut débit sont 1M7 et NMIA, et seulement celui-ci est disponible dans le commerce (Life Technologies). La concentration finale de la modification des réactifs doit être optimisée pour chaque ARN pour obtenir "single-hit" modification cinétique, c'est à dire l'état dans lequel la plupart des ARN en solution sont modifiées une fois dans la région de l'ARN en cours d'analyse ^11. Cette concentration optimale peut être déterminée en effectuant de multiples réactions dans lesquelles la concentration du réactif est variée sur toute la gamme (s) indiqué dans le tableau à la section 2.1 ci-dessous. Utilisez la concentration du réactif qui produit un signal facilement détectable pendant minimizing la différence d'intensité de signal entre des produits de synthèse longues et courtes ADN (par exemple figure 3).

Figure 3. électrophérogrammes de forme produite à partir d'une ~ 360 nt ARN traités avec (A) 0 (B) 2,5 mM ou (C) 10 mM 1M7. Toutes électrophérogrammes sont affichés sur la même échelle. Bleu, traces vertes, rouges et noires correspondent à (+) des produits de réaction (Cy5), (-) des produits de réaction (Cy5.5), et les deux échelles de séquençage (D2 WellRed et IRDye800), respectivement. Les ARN utilisés pour produire l'image (B) a été traitée avec la quantité optimale de 1M7, ce qui démontre une bonne résolution et l'intensité de pointe, avec décroissance du signal minimal tout au long de la trace (à gauche). Lire longueur est maximale dans ces conditions. En revanche, l'absence d'int moyenensité, pics bien résolus dans (A) suggère une concentration sous-optimale de 1M7. En revanche, la décroissance du signal évident dans (C) indique que la cinétique de single n'est pas respecté, et l'ARN est trop modifiée. Dans de tels cas, surtout quand on ne s'attend pas à rencontrer RT l'extrémité 5 'de la matrice d'ARN, lisez longueur sera pas optimale.

1. Préparer Stock 10X de réactif SHAPE (NMIA ou 1M7). Le mieux est obtenue en ajoutant une petite quantité de réactif dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, puis en ajoutant du DMSO pour obtenir la concentration voulue. Attention: solutions de réactifs de forme doit rester anhydre jusqu'à mélangé avec de l'ARN. Magasin DMSO dans un dessiccateur à la température ambiante, et préparer des solutions mères immédiatement avant utilisation afin de minimiser l'exposition à la vapeur d'eau ambiante.

   Réactif	Concentration 10X optimale (dans DMSO)	Il est temps dela dégradation complète du réactif 27
   NMIA	10-100 mM	~ 20 min
   1M7	10-50 mM	70 sec

   
   Tableau 1. Électrophiles réactifs utilisés pour la modification d'ARN.
   
2. Ajouter 8 pl 10X NMIA/1M7 ou DMSO anhydre à modifié (+) et le contrôle (-) mélanges, respectivement. Note: 2,5 mM s'est révélée être une concentration de départ efficace à la fois pour NMIA et 1M7, indépendamment de l'ARN en cours d'analyse.
3. Incuber à 37 ° C pendant 50 min (NMIA) ou 5 min (1M7), selon le cas.
4. précipiter l'ARN en ajoutant 8 pi (0,1 vol) de NaOAc 3 M (pH 5,2), 8 mM d'EDTA 100 ul, 240 ul (3 vol) d'éthanol froid et 1 ul mg / ml de glycogène 10. Réfrigérer pendant 2 heures, puis centrifuger à 14000 g pendant 30 min à 4 ° C. Laver le culot deux fois avec de l'éthanol froid à 70%. Attention: Il est important deminimiser le temps de réfrigération, le temps de centrifugation et de vitesse afin de minimiser les co-précipitation de sel, car cela peut nuire à la résolution des pics pendant l'électrophorèse.
5. Retirer le surnageant avec une micro-pipette, et l'air sec à granulés pendant 5 min à température ambiante.
6. Dissoudre ARN précipité dans un tampon TE 10 pi et incuber 5 min à température ambiante. Ceci est assez dissout l'ARN pour deux réactions de transcription inverse. Conservez la partie inutilisée à -20 ° C. Attention: la remise en suspension mécanique de la pastille n'est généralement pas nécessaire, et peut endommager l'ARN.

3. Reverse Transcription

Cette étape génère les produits d'ADNc marquées par fluorescence qui sont utilisés pour identifier indirectement le degré de nucléotides de l'ARN ont été modifiés par un réactif de SHAPE. Pour la forme, la performance du Exposant III (Invitrogen) RT était supérieur à tous les autres RT testé, et est l'enzyme choisie pour ceprotocole. Oligonucléotides marqués par Cy5 et Cy5.5 sont utilisées pour amorcer le (+) et (-) des réactions, respectivement. Pour ARN courts, les amorces sont hybridées à une extension 3 'terminale de l'ARN natif (par exemple une "cassette de structure") afin d'obtenir des informations sur l'extrémité 3' ⁴ Attention:. De ce point par le CE, les échantillons doivent être protégés contre lumière.

1. Préparer (+) et (-) des échantillons pour la transcription inverse de 0,5 microtubes ml. Pour la réaction de RT (+), mélanger 5 pi d'ARN modifié (+), 6 pi d'eau et 1 pi amorce Cy5 marqué (10 M); pour le (-) réaction RT, mélanger 5 ul d'ARN de commande (-), . 6 pi d'eau, et 1 pl Cy5 amorce marquée (10 M) Attention: tubes PCR Sarstedt (REF 72.735.002) sont recommandés pour cette application.
2. Placer les tubes dans un cycleur thermique et recuit amorce d'ARN et se préparer pour la transcription inverse en appliquant le programme suivant: 85 ° C, 1 min, 60 ° C, 5 min;35 ° C, 5 min, 50 ° C, maintien.
3. Au cours de l'étape de recuit, préparer suffisamment de 2.5X mélange RT pour le nombre de réactions à effectuer, plus 50% (par exemple pour deux (+) et deux (-) réactions, à l'échelle 4,5 fois). Une réaction nécessite 8 pi, comme suit: 4 pi de tampon 5x RT, 1 pl 100 mM DTT, 1,5 pi d'eau, 1 pl dNTP 10 mM, 0,5 pi SuperScript III RT. Garder sur la glace. Attention: tampon RT 5X et 100 mM DTT sont fournis avec le SuperScript III RT.
4. Une fois que la température des mélanges de recuit atteint 50 ° C, ajouter 8 pi de 2.5X RT mélange des (+) et (-) des réactions. Recommandation: chaud le mélange RT à 37 ° C pendant 5 min avant de l'ajouter aux réactions .
5. Incuber pendant 50 min à 50 ° C, puis laisser refroidir à 4 ° C et / ou placer sur la glace. Remarque: Incubation des réactions RT pendant plus de 50 min peut aboutir à des produits d'ADNc aberrants.
6. Hydrolyser l'ARN en ajoutant 1 pi 4 M de NaOH et chauffe à 95 ° C pendant 3 min. Réactions refroidir sur glace et ensuite les neutraliser en ajoutant 2 ul d'HCl 2 M Attention:. Omission de cette étape aboutit à mal la séparation de la qualité des produits d'ADNc.
7. Combiner (+) et (-) des réactions et précipiter l'ADNc en ajoutant 0,1 volume de NaOAc 3 M, 0,1 vol de 100 mM EDTA, 1,5 vol d'éthanol froid et 1 pl de 10 mg / ml de glycogène. Réfrigérer pendant 2 heures, puis centrifuger à 14000 g pendant 30 min à 4 ° C. Laver le culot deux fois avec de l'éthanol froid à 70%. Attention: centrifugation à des taux plus élevés ou pour une période plus longue entraîne des difficultés remettre en suspension le culot (s).
8. Reprendre granulés ADNc dans 40 ul de formamide désionisée par chauffage à 65 ° C pendant 10 min, suivie par vortex vigoureuse pendant plus de 30 min. Attention: Pellets peut être invisible. Manque de signal ou de faible électrophorèse en suivant du signal peut être le résultat de l'échec de dissoudre de manière adéquate le culot à ce stade.

e "> 4. Préparation de séquençage Ladder

Échelles de séquençage servent de marqueurs pour déterminer la position de nucléotide lors du traitement des données. Ceux-ci sont générées en utilisant un kit USB Cycle Sequencing (# 78500), ADN ayant la même séquence que l'ARN à l'étude, et des amorces marquées avec D2 WellRed ou D1/Lycor 800. Typiquement, l'ADN utilisé dans cette réaction sera celle utilisée comme un modèle de transcription de l'ARN en question. Bien que le protocole de réaction présentée ici ressemble beaucoup à celle recommandée par le fabricant du kit, la réaction est agrandie plusieurs fois. Bien ddA et le DDT sont utilisés comme terminateurs de chaîne dans les réactions décrites ci-dessous, toutes les paires de terminaisons peut être utilisé pour générer les échelles de séquençage.

1. Mélanger 40 ul du mélange de terminaison ddA, 5 pmol de matrice d'ADN, 4,6 pi de tampon de Sequenase 10X, 10 pl de WellRed amorce marquée D2, 4,6 l de Sequenase et d'eau pour porter le volume total à 82 pl. Ajouter le Sequenase dernier. Prepare une seconde réaction de séquençage de la même manière, en utilisant le DDT et Licor IR800 amorce marquée à la place.
2. Passez à l'amplification PCR en utilisant les conditions recommandées USB. Attention: Ajout de l'huile minérale n'est pas nécessaire ni recommandé pour les protocoles / thermocycleurs qui utilisent un couvercle chauffant.
3. Combinez le PDD et le DDT réactions de séquençage dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml (~ total de 164 pl).
4. précipiter l'ADN comme suit: Ajouter 16 ul NaOAc 3 M (pH 5,2), 16 mM EDTA pl 100, 1 pl mg / ml de glycogène 10 et 480 ul d'éthanol à 95%. Bien mélanger, incuber à 4 ° C pendant 30 min et centrifuger à 14000 g pendant 30 min à 4 ° C.
5. Reprendre granulés ADNc dans 100 pi de formamide désionisée par chauffage à 65 ° C pendant 10 min, suivie par vortex vigoureux pendant au moins 30 min.

5. Fractionnement des produits de réaction par électrophorèse capillaire

L'électrophorèse capillaire permet simultanéeséparation des produits de synthèse d'ADNc à partir de quatre réactions mises en commun dans un seul échantillon. Huit échantillons peut être fractionné en même temps, tout autant que les 96 échantillons peuvent être fractionnés au cours d'un seul passage (Figure 2).

1. Mélanger 40 pl des échantillons du SHAPE regroupées avec 10 pl des échelles de séquençage communs, et le transfert de plaques échantillons de 96 puits. Attention: Il est impératif que Beckman Coulter réactifs et des plaques (y compris gel APL-I, tampon de migration, de l'huile minérale, l'échantillon solution de chargement et de l'échantillon et les plaques de tampons) être utilisés avec la CEQ 8000 Genetic Analyzer Beckman-Coulter.
2. Programme et préparer instrument d'électrophorèse capillaire et lancer exécuter conformément aux instructions du fabricant. Remarque: Pour une meilleure résolution d'échantillons, utilisez les paramètres de la méthode CAFA publiés antérieurement ^28.

Idéalement, à l'extérieur de l'apprêt et pics forte-stop, les signaux pour chaque pic dans les quatre électrophérogramme traces devraient être dans la gamme linéaire; une descente progressive du signal est acceptable. Parfois, cependant, les grands pics (arrêts) sont évidents, même dans la réaction de contrôle, et ceux-ci peuvent interférer avec le traitement ultérieur des données. ADNc tronqués qui donnent lieu à ces pics peuvent être le résultat d'un obstacle naturel au cours de la transcription inverse (par exemple la structure secondaire de l'ARN), ou la dégradation de l'ARN. Dans le premier cas, des additifs tels que la bétaïne peut améliorer RT processivity et réduire RT pause résiliation / prématurée.

Traitement de l'information

ShapeFinder logiciel permet à l'utilisateur de visualiser et de transformer les traces de la CE et les convertir en profils de réactivité du SHAPE ^18. Une fois les valeurs de réactivité sont rassemblés, ils sont normalisées et importés dans RNAStructure (v5.3) afin de générer et d'affiner les modèles de structure secondaire.

6. ShapeFinder Software

Une extension de la BaseFinder trace traitement platforme ^29, la version publiée de ShapeFinder est disponible gratuitement pour un usage non-commercial ^18. Les instructions détaillées pour le traitement des données dans ShapeFinder sont fournis avec la documentation du logiciel.

1. Electrophérogrammes sont importés de la CEQ dans ShapeFinder, où ils sont ajustés pour corriger (i) fond fluorescent, (ii) un chevauchement spectral entre canaux fluorescents, (iii) la mobilité décalages communiquée par amorces différemment marqués, (iv) les différences d'intensité de fluorescence produits courants marqués avec des fluorophores différents, et (v) la désintégration de signal résultant de l'arrêt prématuré de la transcription inverse.
2. La fonction "Setup" de la "Aligner et Intégrer" outil en ShapeFinder attribue automatiquement les identités de pics individuels et corrèle cela à la séquence d'ARN tel que défini par l'entrée d'utilisateur et les deux échelles de séquençage. Bien que les attributions initiales sont généralement imparfaites, les erreurs peuvent être corrigées manuellement en utilisant la fonction "Modifier" dele même outil. Enfin, la fonction "Fit" calcule les zones sous alignés (+) et (-) des pics de réaction, et compile ces valeurs de réactivité avec le nombre de nucléotides correspondant dans un fichier texte délimité par des tabulations.

Note: L'analyse des données est essentielle pour la précision de la forme, et quelques considérations sont très importantes au cours de cette analyse, y compris:

• Signal-bruit: le rapport signal-sur-bruit doit être telle que les pics individuels doivent être facilement identifiables même pour des postes à faible réactivité. Bien ShapeFinder offre une option de lissage des données, cette solution doit être utilisée avec beaucoup de prudence, car elle peut fausser l'analyse ultérieure.
• Région de l'analyse: En règle générale, les données fiables peuvent être obtenus à partir des ADNc 300-600 nt de long, à partir de 40-80 nt une région retirée de l'amorce 3 'et se terminant comme les désintégrations des signaux à des niveaux difficiles à distinguer du bruit de fond. L'utilisation de plusieursjeux d'amorces ples seront nécessaires pour analyser les séquences plus longues de l'ARN. Dans ce cas, il est recommandé que le chevauchement des signaux fiables entre jeux d'amorces est de l'ordre de 30-50 nt. Sur ARN courts, où la transcriptase inverse arrive souvent à la fin de la matrice d'ARN, des précautions doivent être prises pour exclure les pics dont le rapport signal sur bruit est affecté par la forte arrêt de la synthèse d'ADN.
• décomposition du signal: La décroissance du signal est liée à l'ampleur de la modification d'ARN lors de l'expérience, ainsi que la processivité imparfaite de la RT. Idéalement, la cinétique du choc unique par rapport à la région de l'ARN en cours d'analyse devraient être réalisés afin de maximiser la longueur de lecture. ShapeFinder contient un outil qui est efficace dans la correction de la décroissance du signal, mais parce que cela tend à introduire une erreur dans l'analyse - en particulier lorsque la cinétique de single ne sont pas respectées, il est préférable d'utiliser lorsque décroissance du signal est faible (par exemple, lors de la distribution des pics est compatible avec un seul hit kinetics). Récemment, l'amélioration des algorithmes de transformation de décroissance du signal du signal ont été publiés ^{le 30} et devrait être étudiée si la pourriture du signal est particulièrement préoccupant dans une expérience particulière.
• Signaler échelle. Sans doute l'étape la plus arbitraire dans le traitement de données de forme, le profil de contrôle doit être dimensionnée de manière à ce que les intensités maximales entre mini-réactive (+) et (-) des traces sont égaux. Intensifier la trace de contrôle à une trop grande mesure se traduira par une abondance de valeurs de réactivité négative dans le premier quartile (voir normalisation des données ci-dessous). Dans ce cas, le facteur d'échelle doit être réduit en conséquence et les données réintégré.
• Peaks affectation. En général, la version automatisée de la cession de pointe fonctionne bien. Lorsque le processus échoue, cependant, il est impératif que l'utilisateur s'assure que tous les sommets ont été reconnus par le logiciel, en particulier lorsque le rapport signal-sur-bruit est faible. sommets de l'épaule, par exemple, ne sont pas toujours détectées et riche en G soiquences sont souvent compressés.

7. La normalisation des données

Pour intégrer profils de réactivité nucléotides dans l'algorithme de structure secondaire utilisé par le logiciel de RNAStructure (v5.3), et / ou pour comparer les profils d'ARN étroitement liés, les données de forme doit être normalisés de manière standardisée ^12. Il s'agit (i) à l'exclusion des valeurs aberrantes de calculs ultérieurs, (ii) la détermination de la réactivité "maximale effective" (ie, la moyenne des 8% plus élevé de la valeur de la réactivité, à l'exclusion des valeurs aberrantes), et (iii) la normalisation en divisant toutes les valeurs de réactivité par le "maximale", comme suit:

1. Ouvrez le fichier texte délimité par des tabulations généré après l'alignement et l'intégration et copier son contenu dans une feuille de calcul Excel. La colonne de droite de ce fichier (RX.area-BG.area) contient les valeurs de réactivité du SHAPE absolue calculée pour chaque nucléotide de l'ARN. Les colonnes de gauche se rapportent cette réactivité à l'ARN Sequrence.
2. Calculer et stocker le premier et le tiers des valeurs pour (RX.area-BG.area) en utilisant la fonction Excel "= quartile (tableau, pinte)" quartile (soit le centile de 25 et 75e)
3. Calculer et stocker la différence interquartile "= quartile (tableau 3) quartile (array, 1)"
4. Calculer et stocker la «valeur de coupure aberrante" en utilisant la formule "= (quartile, tableau 3) +1.5 * ((quartile (tableau 3) quartile (array, 1))." Tout réactivité valeurs supérieures à cette valeur sont à exclure des calculs ultérieurs.
5. Copiez les valeurs de réactivité de (RX.area-BG.area) et collez-les dans, une colonne vide adjacente, puis les trier ces valeurs telles que les plus grands sont au sommet de la colonne.
6. Dans le nouvellement créé "triés colonne de valeurs», supprimer les valeurs supérieures à la valeur seuil aberrant.
7. Calculer et stocker la moyenne de la plus grande des valeurs de 8% de réactivité restant dans la "triée valeurs colomn ". Cette valeur est la" réactivité maximale ".
8. Diviser la non triés (RX.area-BG.area) de chaque nucléotide (y compris les valeurs aberrantes) par la valeur de réactivité "effective maximale" pour obtenir les «valeurs de réactivité normalisés». Stocker dans une colonne vide, laissant une colonne vide à gauche. Ensuite, copiez les numéros de nucléotides à la gauche de la table et les coller dans la colonne vide directement à la gauche des «valeurs de réactivité normalisés».
9. Copiez et collez les paires de valeurs de réactivité position normalisées de nucléotides dans un éditeur de texte.
10. Éliminer des valeurs inférieures à -0.09 (ie, laisser le blanc des espaces), car ce sont probablement le résultat de RT pause lors de la synthèse d'ADNc pour des raisons autres que la modification chimique de la matrice. En outre, toutes les valeurs de réactivité pour les nucléotides à laquelle forte pause est observée sur le modèle non modifié (tel que déterminé par une inspection visuelle de la «Aligner et Intégrer" profil ShapeFinder), doivent être exclus.
11. Save le fichier avec une extension. forme pour une utilisation dans l'analyse structurale avec le logiciel de RNAstructure (v5.3).

8. Modélisation des données

un logiciel de RNAstructure (v5.3) est utilisé pour prédire la structure secondaire de l'ARN expérimentalement soutenu (s) en utilisant les contraintes énergétiques pseudo-libres dérivés de l'analyse de la forme ^19. Le logiciel fournit des représentations graphiques d'énergie la plus faible 2D structures d'ARN ainsi que la représentation textuelle de ces structures dans la notation point-support. Celui-ci peut être importé dans une structure spectateur ARN de la préférence de l'utilisateur, par exemple Pseudoviewer ²³ ou ²² Varna, pour produire des images de qualité publication.

Note: Il faut faire attention lorsque l'on considère les structures produites par le logiciel de RNAstructure (v5.3). Par exemple, le logiciel ne peut pas résoudre les interactions tertiaires telles que la pseudo-noeuds et des boucles baisers, il ne peut distinguer si le manque deréactivité dans une certaine région est due à la protection basepairing ou stérique par des protéines liées. En conséquence, ces facteurs, ainsi que les énergies présentés pour les structures individuelles, doivent être considérés lors de la présentation d'un modèle structurel définitive.

Representative Results

ARN contenant le VIH-1 élément rev de réponse (RRE), et une extrémité 3 'de la cassette de la structure ⁴ est préparé à partir d'un plasmide linéarisé par la transcription in vitro, après quoi elle a été plié par chauffage, de refroidissement, et l'incubation à 37 ° C en présence de MgCl _2. L'ARN a été exposé à NMIA puis une transcription inverse à partir d'une amorce d'ADN 5'-fin-marquée hybridée à la borne cassette de structure de l'extrémité 3 '. La forme d'ADNc résultant, ensemble avec des réactions de contrôle et de séquencement, alors fractionnée en utilisant la CEQ 8000 système d'électrophorèse capillaire Beckman Coulter automatisé pour produire l'électrophérogramme représenté sur la figure 4. Les quatre qui se chevauchent, des traces de couleurs codées sont produites par la migration des quatre ensembles de produits de réaction à travers le capillaire, comme suit: Bleu (produits de la RT-Cy5 marquées produites à partir de la transcription inverse de l'ARN NMIA modifiés), vert (Cy5.5 marquée RT produits de croisés, mais sinon unmodified ARN), noir (WellRed échelle de séquençage ADN D2 marqué générée à l'aide DDG) et rouge (Lycor800 marqué échelle de séquençage, le DDT).

Les traces CE premières ont été séparés, transformés harmonisé et intégré avec le logiciel ShapeFinder ^18. La région de la trace (s) correspondant à la région RRE LSII est représenté sur la figure 5, les données ayant été traitées au point immédiatement avant l'intégration de pointe (c'est-à-traces ont été alignés, soumis à une soustraction de fond, la correction de la décroissance de signal , etc.). les valeurs de la réactivité de chaque nucléotide sont calculées par intégration des pics correspondant à des NMIA (+) et NMIA (-) (réactions dans les traces de bleu et vert, respectivement), et la soustraction de la seconde de la première. Ces valeurs de réactivité indiquent la mesure dans laquelle RT se termine à chaque nucléotide pendant la transcription inverse, ce qui est un reflet de la mesure dans laquelle chaque nucléotide a été modifié par NMIAet donc sa propension à être simple brin en solution.

Le VIH-1 RRE profil de réactivité du SHAPE généré en ShapeFinder a été normalisé et converti en un document texte approprié pour l'importation dans RNAStructure (v5.3) ^19. Dans ce dernier logiciel, les valeurs de réactivité ont été incorporés dans l'algorithme de prédiction de structure secondaire comme des contraintes pseudo-énergie, influençant ainsi les structures qui sont prévus pour avoir l'énergie libre la plus basse. sortie du programme est composé de deux ARN secondaires cartes de la structure tridimensionnelle représentant les structures de plus basse énergie générées par l'algorithme ainsi que des fichiers texte contenant ces structures exprimées en notation point-support. Le dernier de ces sorties peut être exporté dans un logiciel de visualisation ARN comme VARNA ^22. Figure 6 montre la structure 2D de la région SLII VIH RRE généré en RNAStructure (v5.3) en utilisant les profils de réactivité SHAPE dérivés et visualisés à l'aide de Varna. Les valeurs de réactivité de forme codées de couleur sont superposées.

Figure 4. . électrophorégramme représentatif d'un échantillon d'ARN vu dans le 8000 Système d'analyse génétique CEQ (Beckman) Le logiciel affiche une trace où chaque canal est représenté par une ligne de couleur: canaux bleu et vert représentent le réactif (+) et (-) des expériences de réactifs, et en noir et rouge représentent échelles de séquençage. X et Y axes indiquent le temps de résolution et l'intensité de fluorescence, respectivement. Cliquez ici pour agrandir la figure.

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Figure 5. Electrophorégramme analyse en utilisant des outils ShapeFinder ^18. L'fenêtre Vue de données (au centre) fournit des informations graphiques sur chaque étape de traitement des données. La fenêtre Inspecteur d'outils (en bas à gauche) affiche les paramètres de l'outil sélectionné dans l'inspecteur Scripting. L'inspecteur Scripting (en haut à droite) affiche les outils qui ont été appliquées aux données. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 6. Bidimensionnelle couleur de structure de l'ARN codé pour la réactivité du SHAPE généré en utilisant la visualisation applet VARNA ^22. Nucléotides sont codés par couleur pour indiquer le degré (s) de la réactivité du SHAPE. Enle spectre affiché, cercles bleus et rouges indiquent les nucléotides ayant une faible et une forte réactivité, respectivement.

Discussion

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la forme à haut débit, une technique qui permet de déterminer la structure secondaire de la résolution d'un nucléotide simple pour des ARN de toute taille. En outre, le couplage des données du SHAPE expérimentales avec secondaires algorithmes de prédiction de structure facilite la génération de modèles 2D ARN avec un degré de précision plus élevé que ce qui est possible avec soit seule méthode. La combinaison d'amorces marquées par fluorescence et automatisé CE fournit des avantages significatifs sur la forme traditionnelle à base de gel, ce qui facilite la résolution de longues séquences d'ARN en une seule expérience, ainsi que la vitesse et le débit nettement plus élevé pour de multiples expériences. L'opportunité de cette méthode et de la disponibilité d'outils d'analyse de données appropriées faire la forme idéalement adaptée pour l'analyse structurelle de précédemment intraitable virale, messager intact et les ARN non codantes. Comme les structures 2D de ces ARN intrigantes deviennent plus claires, l'utilisation du radical hydroxyle sondage, par-spaméthodologies de clivage CE et modélisation moléculaire devraient permettre d'élucider les interactions tertiaires complexes et finalement permettre aux chercheurs de déterminer les structures de ces ARN en trois dimensions.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
N-methylisatoic anhydride (NMIA)	Life technologies	M25	Dissolve in anhydrous DMSO
1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)	see ref. 22
Superscript III Reverse Transcriptase	Life technologies	18080044	10,000 units
Thermo sequenase cycle sequencing kit	Affymetrix	78500
Materials provided by the user
RNA of interest			6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)
Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)			Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.
DNA template			DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.
Buffers
10x RNA renaturation buffer			100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X RNA folding buffer			200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)
2.5X RT mix			4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1.5 μl water,1 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).
GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)			Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles
EQUIPMENT
Capillary electrophoresis	Beckman	CEQ8000
Thermocycler	varies