RNA förutsägelser av sekundär struktur med high-throughput SHAPE

Summary

Hög kapacitet selektiv 2-hydroxylen acylering analyserades genom primerförlängning (FORMEN) utnyttjar en ny kemisk sondering teknik, omvänd transkription, kapillärelektrofores och förutsägelser av sekundär struktur programvara för att bestämma strukturerna för RNA från flera hundra till flera tusen nukleotider vid enstaka nukleotid upplösning.

Abstract

Förstå funktionen hos RNA deltar i biologiska processer kräver en grundlig kunskap om RNA-struktur. För detta ändamål, den metod som kallas "high-throughput selektiv 2 'hydroxyl acylering analyseras av primerförlängning", eller form, möjliggör förutsägelse av RNA sekundär struktur med enda nukleotid upplösning. Detta tillvägagångssätt utnyttjar kemiska sondering agens som företrädesvis acylera enkelsträngade eller flexibla regioner i RNA i vattenlösning. Sites of kemisk modifiering detekteras genom omvänd transkription av modifierat RNA, och produkterna från denna reaktion är fraktioneras genom automatiserad kapillärelektrofores (CE). Eftersom omvänt transkriptas pausar vid dessa RNA nukleotider modifierade av formen reagenser, kartlägger resulterande cDNA-biblioteket indirekt de ribonucleotides som singel är strandsatta i samband med de vikta RNA. Använda ShapeFinder mjukvara, är de elektroferogrammen produceras av automatiserad CE bearbetas och omvandlas till nucleotide reaktivitet tabeller som är själva omvandlas till pseudo-energi begränsningar som används i RNAStructure (v5.3) förutsägelse algoritm. De tvådimensionella RNA-strukturer framställs genom att kombinera SHAPE sondering med in silico RNA förutsägelser av sekundär struktur har visat sig vara mycket mer exakta än strukturer erhållna med användning av endera metoden enbart.

Introduction

För att förstå funktionerna i katalytiska och icke-kodande RNA är inblandade i regleringen av splitsning, översättning, virusreplikation och cancer, är en detaljerad kunskap om RNA-struktur som krävs ^1,2. Tyvärr visar exakt förutsägelse av RNA vikning en formidabel utmaning. Klassiska utforskande medel lider många nackdelar, såsom toxicitet, ofullständig nukleotid täckning och / eller genomströmning begränsad till 100-150 nukleotider per försök. Blotta sekundära struktur förutsägelse algoritmer är lika ofördelaktigt på grund av felaktigheter till följd av deras oförmåga att effektivt skilja mellan energiskt liknande strukturer. Stora RNA i synnerhet är också ofta är refraktära mot metoder för 3D strukturbestämning såsom röntgenkristallografi och kärnmagnetisk resonans (NMR), på grund av deras konformationell flexibilitet och stora mängder av höggradigt rena prov som behövs för dessa tekniker.

HIGH-genomströmning FORM löser många av dessa problem genom att tillhandahålla ett effektivt och enkelt sätt att sondera strukturerna för stora RNA vid singel-nukleotid upplösning. Dessutom, de reagens som används för FORM är säkra, lätta att hantera och, i motsats till de flesta andra kemiska sondering reagenser, reagera med alla fyra ribonukleotider. Dessa reagens kan också penetrera cellulära membran, vilket gör det möjligt att sondera RNA i deras in vivo sammanhang (er) ^3. Ursprungligen utvecklades under veckorna laboratorium ^4, har SHAPE använts för att analysera en mängd olika RNA, det mest anmärkningsvärda exemplet är bestämning av fullständig sekundär struktur ~ 9 kb HIV-1 RNA-genom ^5. Andra noterbara prestationer använder SHAPE omfattar klarläggande av strukturerna för smittsamma viroider ^6, humana långa icke-kodande RNA ^7, ribosomer jäst ^8, och riboswitches ⁹ samt att identifiera proteinbindningsställena i virion-associerat HIV-1 RNA ^3. While de ursprungliga och hög genomströmning variationer av formen-protokollet har publicerats på annat håll ^{10 till 12} tillhandahåller föreliggande arbete en detaljerad beskrivning av RNA-sekundärstruktur bestämning med hög genomströmning FORM använda fluorescerande oligonukleotider, Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer, och SHAPEfinder och RNAStructure (v5.3) mjukvara. Tidigare opublicerade tekniska detaljer och felsökning rådgivning ingår också.

Variationer av FORM

Kärnan i formen och dess varianter är exponering av RNA i vattenlösning för att elektrofila anhydrider som selektivt acylera 2'-hydroxyl-(2'-OH) ribos grupper, som producerar skrymmande addukter vid ställena för modifiering. Denna kemiska reaktion fungerar som ett medel för att förhöra lokala RNA strukturella dynamiken, såsom enkelsträngade nukleotider är mer benägna att anta konformationer som främjar elektrofilt angrepp av dessa reagens, medan basparad eller arkitektoniskt Constrained nukleotider är mindre eller icke reaktiva ^10. Sites of adduktbildning detekteras genom omvänd transkription initiera från fluorescerande eller radiomärkt primrar hybridiserade till ett specifikt ställe på modifierat RNA (den "(+)" primerförlängningsreaktion). När omvänt transkriptas (RT) underlåter att korsa acylerade ribonukleotiderna, är en pool av cDNA produkter produceras vars längd sammanfaller med områden av modifiering. En kontroll, "(-)" primerförlängningsreaktion utnyttjar RNA som inte har exponerats för reagens utförs också så att för tidig avslutning av DNA-syntes (dvs. "stopp") på grund av RNA-struktur, icke-specifik RNA-sträng går sönder, etc. kan. skiljas från pausa framställts genom kemisk modifiering. Slutligen är två dideoxi-sekvenseringsreaktioner initierande från samma primrar användas som markörer för att korrelera reaktiva nukleotider med RNA primära sekvensen efter elektrofores.

I den ursprungliga ansökan av SHAPE, samma ³² P-ändmärkt primer utnyttjas för de (+), (-), och två sekvenseringsreaktioner. Produkter av dessa reaktioner är laddades i intilliggande brunnar på en 5-8% polyakrylamid slab gel och fraktioneras genom denaturerande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE; Figur 1). Kvantitativ analys av gelén bilder som produceras av konventionell form kan utföras med användning SAFA, ett halvautomatiskt footprints analysprogram ^13.

I motsats härtill använder hög genomströmning FORM fluorescensmärkta primrar och automatiserad kapillärelektrofores. Specifikt för varje region av RNA under utredning, en uppsättning av fyra DNA-primers som har en gemensam sekvens men olika 5 'fluorescerande markörer måste syntetiseras eller köpas. Dessa annorlunda-märkta oligonukleotider tjänar till prime två SHAPE reaktioner och två reaktioner sekvensering, de produkter som är sammanförda och fraktionerade / detekteras genom automatiserad kapillärelektrofores (CE). WherEAS reaktiviteten profil 100-150 nt av RNA kan erhållas från en uppsättning av fyra reaktioner med den ursprungliga metoden, gör high-throughput SHAPE upplösning på 300-600 nt från en poolad enda prov ^3. Upp till 8 uppsättningar av reaktioner kan fraktioneras samtidigt, medan så många som 96 prover kan förberedas för fraktionering under loppet av 12 på varandra följande CE körningar (Figur 2). Dessutom är SHAPEfinder mjukvara, utvecklad för att bearbeta och analysera data som framkommit i CEQ och andra genetiska analysatorer, mer automatiserad och kräver mycket mindre åtgärder från användaren än SAFA ¹³ eller andra gel-analys paket.

Mer avancerade high-throughput metoder har nyligen dykt upp som PARS (parallell analys av RNA struktur) ¹⁴ och Frag-Seq (fragment-sekvensering) ^15, som använder struktur-specifika enzymer i stället reagenser alkyleringsprodukter i samband med nästa generations sekvensering tekniker för att erhålla INFORMATIOn om RNA-struktur. Trots intresset för dessa tekniker, de många inneboende begränsningar till nukleas sondering fortfarande ^16. Dessa problem kan kringgås i form sekvensering (FORMEN-Seq) ¹⁷ protokoll, där nästa generations sekvensering föregås av kemisk modifiering och omvänd transkription av RNA på ett sätt liknande det som utförs i konventionell form. Även om dessa metoder kan representera framtiden för RNA-strukturbestämning, är det viktigt att komma ihåg att nästa generations sekvensering är mycket dyrt, och förblir otillgänglig för många laboratorier.

FORM Dataanalys

Data produceras i den genetiska analysatorn presenteras i form av ett elektroferogram, varvid fluorescensintensiteten hos provet (proven), som strömmar genom kapillären detektorn är avsatt mot ett index för migration tid. Denna kurva sker i form av överlappande spår som motsvarar de fyra fluorescenskanals används för att detektera de olika fluoroforer, och där varje spår består av toppar motsvarande enskilda cDNA-eller sekvensering produkter. Electropherogram data exporteras från den genetiska analysatorn som en tab-avgränsad textfil och importeras till ShapeFinder transformation och analys ^18.

ShapeFinder initialt används för att utföra en serie av matematiska transformationer på uppgifter att se till att migrationen gånger och topp volymer korrekt återspeglar identiteten och mängden av de reaktionsprodukter, respektive. Peaks är inriktas därefter och integreras, och resultaten tabuleras tillsammans med den primära RNA-sekvens. A "reaktivitetsprofil" för det relevanta segmentet av RNA erhålls genom att subtrahera kontrollvärden från (+) värden associeras med varje RNA nukleotid, och normalisera data som beskrivs nedan. Denna profil importeras till RNAstructure (v5.3) mjukvara ^19,20, vilket omvandlar den normaliserade reaktivitet valderingar i pseudo-energi begränsningar som ingår i RNA sekundära strukturen fällbara algoritm. Kombinera kemisk sondering och vikning algoritmer på detta sätt avsevärt förbättrar noggrannheten hos strukturen förutsägelse jämfört med antingen enbart metoden ^12,21. Utsignalen från RNAstructure (v5.3) innefattar bilder av den lägsta energin RNA sekundära strukturer färgkodade med formen reaktivitetsprofil (er), liksom samma strukturer i textform dot-hakparenteser. Det senare kan därefter exporteras till programvara avsedd för den grafiska visningen av RNA sekundär struktur såsom Varna ²² och PseudoViewer ^23.

Figur 1. Flödesschema av RNA struktur beslutsamhet via SHAPE ^4,10. (A) RNA may erhållas från biologiska prover eller genom in vitro transkription. (B) Beroende på källan, är RNA vikas eller på annat sätt bearbetas och modifieras med SHAPE reagens. (C) Omvänd transkription med fluorescerande eller radioaktivt märkta primers. (D) cDNA produkter fraktionerad via antingen kapillär eller platta gelbaserad elektrofores. (E) Fragment analys. (F) RNA struktur prediktion. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Den hög genomströmning karaktären hos CE-baserad FORM tillåter snabb analys av flera RNA, och / eller flera segment av samma RNA. (A) (B) Delar av RNA sonderas självständigt med olika uppsättningar av fluorescerande primers (svarta pilar) (C) uppsättningar reaktioner poolas och laddas i brunnar A1, B1, C1, etc, respektive, vilket ger fullständig täckning för det ungefär 3 kb RNA1. Reaktionsprodukter från RNA 2, 3, 4, etc. kan framställas på liknande sätt för fraktionering i rad elektroforetiska körningar. Klicka här för att visa en större bild.

Protocol

Primer design och förlängning av RNA-3'-terminalen

För att analysera långa RNA av hög genomströmning FORM, måste en rad platser primerhybridisering väljas så att de (i) är åtskilda av ~ 300 nt, (ii) är från 20 till 30 nt i längd, och (iii) att RNA / DNA-hybrider framställda genom glödgning DNA till dessa platser har en förväntad smälttemperatur> 50 ° C. Dessutom bör segment av RNA som förutsägs vara mycket strukturerad undvikas, även om ett sådant fastställande kräver viss förkunskap om RNA-struktur, som ofta inte möjliga. DNA-primers som hybridiserar till dessa platser bör då utformas, i syfte att säkerställa att de inte skulle förväntas bilda stabila dimerer eller intrastrand sekundära strukturer.

När utformade, måste primeruppsättningar antingen köpas (t.ex. från Integrated DNA Technologies, Ames, Iowa) eller syntetiseras ^24,25. Primers 5'-märkt med Cy5, Cy5.5,WellRedD2 (Beckman Coulter) och IRDye800 (Lycor) / WellRedD1 (Beckman Coulter) är bäst lämpade för Beckman Coulter 8000 CEQ, som ger bra signal intensitet samtidigt minimera överhörning. Märkta oligonukleotider kan lagras på obestämd tid i små, 10 iM alikvoter vid -20 ° C, undvik upprepad frysning / upptining.

Genom att använda primrar utformade på detta sätt, är det möjligt att erhålla formdata för praktiskt taget en hel-RNA av valfri längd. Men "är ändstationen av en RNA alltid oåtkomlig för form, såvida RNA är konstruerad för att innehålla en 3-sekvensen vid eller nära 3 terminal förlängning (t.ex. en" struktur kassett ") till vilken en primer kan hybridisera ^4.

RNA-beredning genom kapillärelektrofores

Även RNA från biologiska prover kan användas för high-throughput SHAPE, men protokollet ges här optimerad för RNA produceras av in vitro transkription. Kommersiella transcription kit såsom MegaShortScript (Ambion) används tillsammans med MegaClear RNA reningskolonner (Ambion) är väl lämpade för generering av stora mängder rena RNA. RNA bör förvaras i TE-buffert mellan -20 ° C och -80 ° C. För bästa resultat bör RNA förefaller homogen enligt både denaturering och icke-denaturerande polyakrylamidgelelektrofores.

Ett. RNA Folding

1. I ett 0,5 ml mikrocentrifugrör, späd 12 pmol av RNA till 18 | il med vatten och tillsätt 2 ^ il 10 x renaturering buffert. Blanda väl.
2. Värm till 85 ° C under 1 min och sedan svalna till 4 ° C med en hastighet av 0,1 ° C / sek.
3. Lägg 100 pl vatten och 30 pl 5X veckningsbuffert.
4. Inkubera vid 37 ° C under 30 till 60 min, beroende på RNA hopfällt. I allmänhet, Mg ^{2 +-beroende} vikning av längre och mer strukturerade RNA kräver längre inkubationstider.
5. Överför en 72 pl alikvot till vardera av två 0,5 ml mikrorör: modified (+) och kontroll (-).

2. Kemisk modifiering av RNA

Väl kännetecknad, elektrofila SHAPE reagens innefattar isatosyraanhydrid (IA), N-methylisatoic anhydrid (NMIA), 1-metyl-7-nitro-isatosyraanhydrid (1M7) ^26, och bensoyl cyanid (BZCN) ^27. Av dessa är den mest använda för high-throughput FORM är 1M7 och NMIA, och endast den senare är kommersiellt tillgänglig (Life Technologies). Den slutliga koncentrationen av modifiera reagens måste vara optimerad för varje RNA för erhållande av "single-hit" modifiering kinetik, dvs det tillstånd i vilket de flesta RNA i lösning modifieras en gång i området för RNA som analyseras ^11. Denna optimala koncentrationen kan bestämmas genom att utföra multipla reaktioner i vilka koncentrationen av reagenset varierade mellan intervallet (er) som anges i tabellen i avsnitt 2.1 nedan. Använd koncentration av det reagens som ger en lätt detekterbar signal medan minimizing skillnaden i signalstyrka mellan långa och korta produkter DNA-syntes (t ex Figur 3).

Figur 3. SHAPE elektroferogrammen framställts från en ~ 360 nt RNA behandlades med (A) 0 (B) 2,5 mM eller (C) 10 mM 1M7. Samtliga elektroferogrammen visas på samma skala. Blå, grön, röd och svart spår motsvarar (+) reaktionsprodukter (Cy5), (-) reaktionsprodukter (Cy5.5), och de två stegar sekvensering (WellRed D2 och IRDye800), respektive. Den RNA som används för att producera bild (B) har behandlats med den optimala mängden 1M7, vilket visar god upplösning av toppar och intensitet, med minimal signalavklingning hela trace (vänster). Läs längd är maximal under dessa förhållanden. Däremot avsaknad av mediet intensity, föreslår väl upplösta toppar i (A) en sub-optimal koncentration av 1M7. Omvänt indikerar signalavklingning tydligt i (C) som enda träff kinetik inte beaktas, och RNA är över-modifierad. I sådana fall, speciellt när RT inte skulle förväntas stöta på 5'-änden av RNA-mallen, läsa längden blir suboptimal.

1. Förbered 10X lager av SHAPE reagens (NMIA eller 1M7). Detta uppnås bäst genom att tillsätta en liten mängd reagens till ett 1,5 ml mikrofugrör, sedan tillsätta DMSO för att uppnå önskad koncentration Attention:. SHAPE reagenslösningar måste förbli vattenfri tills blandat med RNA. Affär DMSO i exsickator vid rumstemperatur, och bereda stamlösningar omedelbart före användning för att minimera exponeringen för omgivande vattenånga.

   Reagens	Optimal 10X koncentration (i DMSO)	Dags attfullständig nedbrytning av reagens 27
   NMIA	10-100 mM	~ 20 min
   1M7	10-50 mM	70 sek

   
   Tabell 1. Elektrofila reagens som används för RNA-modifiering.
   
2. Lägg 8 il 10 X NMIA/1M7 eller vattenfri DMSO till modifierade (+) och kontroll (-) blandar, respektive Obs. 2,5 mM har visat sig vara ett effektivt startkoncentration för både NMIA och 1M7, oberoende av det RNA som analyseras.
3. Inkubera vid 37 ° C under 50 min (NMIA) eller 5 min (1M7), som är lämpligt.
4. Fällning RNA genom tillsats av 8 | il (0,1 vol) av 3 M NaOAc (pH 5,2), 8 ^ il 100 mM EDTA, 240 ^ il (3 vol) av kall etanol och 1 | il 10 mg / ml glykogen. I kylskåp i 2 h och centrifugera sedan vid 14.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta pelleten två gånger med kall 70% etanol Observera:. Det är viktigt attminimera kyltid, centrifugering tid och hastighet för att minimera samtidig utfällning av salt, eftersom detta kan påverka toppupplösning under elektrofores.
5. Avlägsna supernatanten med en mikropipett, och lufttorka pellet under 5 min vid rumstemperatur.
6. Lös utfällda RNA i 10 | il TE-buffert och inkubera 5 min vid rumstemperatur. Detta är nog upplöses RNA för två omvänd transkription reaktioner. Förvara den oanvända delen vid -20 ° C. OBS: Mekanisk resuspension av pellets är oftast inte nödvändigt, och kan skada RNA.

Tre. Omvänd transkription

Detta steg genererar fluorescensmärkta cDNA produkter som används för att indirekt identifiera vilken grad RNA nukleotider har modifierats av en SHAPE reagens. För Shape, var utförandet av Superscript III (Invitrogen) RT överlägsen alla andra RTs testade, och är det enzym som valts för användning med dennaprotokollet. Oligonukleotider märkta med Cy5 och Cy5.5 används för att prima (+) och (-) reaktioner, respektive. För kortare RNA är primers hybridiseras till en 3-terminal förlängning av den nativa RNA (t.ex. en "struktur kassett") i syfte att få information om 3-terminalen ⁴ Attention:. Från denna punkt genom CE, bör proverna skyddas från ljus.

1. Förbered (+) och (-) prov för omvänd transkription i 0,5 ml mikrofugrör. För (+) RT-reaktion, blanda 5 | il modifierat RNA (+), 6 pl vatten och 1 pl Cy5-märkt primer (10 | iM), för (-) RT-reaktion, blanda 5 | il kontroll-RNA (-), . 6 pl vatten och 1 pl Cy5-märkt primer (10 M) OBS: Sarstedt PCR-rör (REF 72.735.002) rekommenderas för denna applikation.
2. Placera rören i en termocykler och hybridiserar primer till RNA och förbereda för omvänd transkription genom att använda följande program: 85 ° C, 1 min; 60 ° C, 5 min;35 ° C, 5 min, 50 ° C genom att hålla.
3. Under glödgningssteget, förbereder tillräckligt 2.5x RT mix för antalet reaktioner som ska utföras, plus 50% (t.ex. för två (+) och två (-) reaktioner, skala 4,5-faldigt). En reaktion kräver 8 pl, enligt följande: 4 | il 5x RT-buffert, 1 ^ il 100 mM DTT, 1,5 yl vatten, 1 pl 10 mM dNTP, 0,5 | il SuperScript III RT. Håll på is Attention:. 5X RT buffert och 100 mM DTT är försedda med Upphöjd III RT.
4. När temperaturen av glödgning mixar når 50 ° C, tillsätt 8 pl 2,5 X RT mix till (+) och (-) reaktioner Rekommendation:. Varm RT mix till 37 ° C i 5 min innan den läggs till reaktionerna .
5. Inkubera i 50 minuter vid 50 ° C, kyl sedan till 4 ° C och / eller placera på is Anmärkning:. Inkubation av RT reaktioner under längre tid än 50 min kan resultera i avvikande cDNA-produkter.
6. Hydrolysera RNA genom att tillsätta 1 | il 4 M NaOH och upphettning till 95 ° C i 3 min. Cool reaktioner på is och sedan neutralisera dem genom att tillsätta 2 ^ 2 M HCl Attention:. Utelämnande av detta steg resulterar i dålig kvalitet separation av cDNA produkter.
7. Kombinera (+) och (-) reaktioner och fälla ut cDNA genom tillsats av 0,1 vol av 3 M NaOAc, 0,1 vol av 100 mM EDTA, 1,5 vol kall etanol och 1 pl av 10 mg / ml glykogen. I kylskåp i 2 h och centrifugera därefter vid 14.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta pelleten två gånger med kall 70% etanol Attention:. Centrifugering vid högre hastigheter eller för en längre period resulterar i svårigheter resuspending pelleten (s).
8. Resuspendera pelleterat cDNA i 40 pl av avjoniserad formamid genom upphettning till 65 ° C under 10 min, följt av kraftig virvling under mer än 30 min Observera:. Pellets kan vara osynlig. Brist på signal eller svag signal efter elektrofores kan vara resultatet av bristande adekvat lös pelleten i detta skede.

e "> 4. Beredning av sekvenseringsstege

Sekvenseringsstegar fungera som markörer för bestämning nukleotidposition under databehandling. Dessa genereras med en USB-Cycle Sequencing kit (# 78500), DNA som har samma sekvens som RNA: t som studeras, och primrar märkta med WellRed D2 eller D1/Lycor 800. Typiskt kommer DNA som användes i denna reaktion vara det som används som en transkription mall för RNA i fråga. Även om reaktionen Protokollet presenteras här liknar det som rekommenderas av satsen tillverkaren, reaktionen skalas upp flerfaldigt. Medan ddA och DDT används som kedjeterminatorer i de reaktioner som beskrivs nedan, kan varje par av termineringarna användas för att generera sekvenseringsstegar.

1. Blanda 40 ìl av ddA uppsägning mix, 5 pmol DNA-mall, 4,6 pl 10X Sequenase buffert, 10 pl WellRed märkt D2 primer, 4,6 il Sequenase och vatten för att bringa den totala volymen till 82 pl. Tillsätt Sekvenas sist. Prepare en andra sekvenseringsreaktion på samma sätt, med utnyttjande av ddT och Licor IR800 märkt primer i stället.
2. Fortsätt till PCR-amplifiering med USB rekommenderade villkor Attention:. Tillsättning av mineralolja krävs inte heller rekommenderas för protokoll / värmecykler som utnyttjar ett uppvärmt lock.
3. Kombinera ddA och ddT sekvenseringsreaktioner i en 1,5 ml mikrofugrör (~ 164 l totalt).
4. Fällning DNA på följande sätt: Tillsätt 16 | il 3 M NaOAc (pH 5,2), 16 | il 100 mM EDTA, 1 | il 10 mg / ml glykogen, och 480 | il 95% etanol. Blanda väl, inkubera vid 4 ° C under 30 minuter och centrifugera vid 14.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C.
5. Resuspendera pelleterat cDNA i 100 | il av avjoniserad formamid genom upphettning till 65 ° C under 10 min, följt av kraftig virvling under minst 30 min.

Fem. Fraktionering av reaktionsprodukter med kapillärelektrofores

Kapillärelektrofores tillåter samtidigseparation av cDNA syntes produkter från fyra reaktioner poolade till ett enda prov. Åtta prover kan fraktioneras samtidigt, medan så många som 96 prover kan fraktioneras under en enda körning (Figur 2).

1. Blanda 40 pl poolade SHAPE prover med 10 mikroliter av poolade sekvenseringsstegar, och transfer till 96-håls provplattor Attention:. Det är viktigt att Beckman Coulter reagenser och plattor (inklusive LPA-Jag gel, löpbuffert, mineralolja, prov lastning lösningen och prov och bufferttallrikarnas) användas med Beckman-Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer.
2. Program och förbereda kapillärelektrofores instrument och initiera drivs enligt tillverkarens instruktioner Obs. För bästa upplösning av prover, använd de tidigare publicerade café metodparametrarna ^28.

Helst utanför primer och stark-stop toppar, signaler för varje topp i alla fyra electropherogram ttävlingar skall vara i det linjära området, en gradvis drop-off i signalen är acceptabel. Men ibland, stora toppar (stopp) är tydliga även i kontrollen reaktionen, och dessa kan störa efterföljande databehandling. Trunkerade cDNA som ger upphov till dessa toppar kan vara resultatet av ett naturligt hinder under omvänd transkription (t.ex. RNA sekundär struktur), eller RNA nedbrytning. I det förra fallet kan tillsatser såsom betain förbättra RT processivitet och minska RT pausa / förtida avbrytande.

Databearbetning

ShapeFinder programvara tillåter användaren att visualisera och förändra CE spår och omvandla dem till profiler SHAPE reaktivitet ^18. När reaktivitet värdena är sammanställda, de normaliseras och importeras till RNAStructure (v5.3) för att generera och förfina sekundära strukturella modeller.

6. ShapeFinder Software

En utvidgning av BaseFinder spår bearbetning platblankett ^29, är den publicerade versionen av ShapeFinder fritt tillgängliga för icke-kommersiellt bruk ^18. Detaljerade instruktioner för datahantering i ShapeFinder medföljer programvaran dokumentationen.

1. Elektroferogrammen importeras från CEQ in ShapeFinder, där de justeras för att korrigera för (i) fluorescerande bakgrund, (ii) spektral överlappning mellan fluorescerande kanaler, (iii) rörlighet skift överförda av olika taggade primers, (iv) skillnader i blomningstid intensitet gemensamma produkter märkta med olika fluoroforer, och (v) signalavklingning följd av för tidig avslutning av omvänd transkription.
2. "Setup"-funktionen i "Justera och integrera" verktyg i ShapeFinder tilldelar automatiskt identiteter till individuella toppar och korrelerar detta till RNA-sekvens som definieras av användaren input och de två stegar sekvensering. Även om de första uppdragen är i allmänhet bristfällig, kan felen korrigeras manuellt med "Ändra" funktionsamma verktyg. Slutligen beräknar "Fit"-funktionen de områden som står under linje (+) och (-) toppar reaktion, och ordningsföljd dessa reaktivitet värden tillsammans med motsvarande nukleotid nummer i en tabbavgränsad textfil.

Anmärkning: Analysen av data är kritisk för riktigheten i SHAPE, och några överväganden är mycket viktigt under denna analys, inklusive:

• Signal-till-brus: signal-till-brus-förhållande måste vara sådan att de individuella topparna ska vara lätt att hitta även för positioner med låg reaktivitet. Även ShapeFinder ger en uppgifter utjämning alternativ, detta alternativ bör användas mycket försiktigt eftersom det kan skeva efterföljande analys.
• Region analys: Normalt kan tillförlitliga data erhållas från cDNA 300-600 nt lång, med början på en region 40-80 nt bort från primer 3 'änden och slutar som signalen avklingar till nivåer som är svåra att skilja från bakgrundsljudet. Användning av multiPLE primeruppsättningar kommer att krävas för att analysera längre sträckor av RNA. I detta fall är det rekommenderat att överlappningen tillförlitlig signal mellan primeruppsättningar är i intervallet av 30 till 50 nt. På kortare RNA, där omvänt transkriptas ofta når slutet av RNA-mallen, måste försiktighet iakttas för att utesluta dessa toppar vars signal-brusförhållandet påverkas av DNA-syntes stark stopp.
• Signal förfall: Signalen förfall är relaterad till omfattningen av RNA modifiering under experimentet liksom den ofullkomliga processiviteten av RT. Helst bör singel-hit kinetik i förhållande till regionen av RNA som analyseras uppnås för att maximera läsa längd. Shapefinder innehåller ett verktyg som är effektiva för att korrigera för signalavklingning, men eftersom detta tenderar att införa fel i analysen - speciellt när enda träff kinetik inte följs, är det bäst används när signalavklingning är minimal (dvs när fördelningen av toppar är förenlig med enda träff kinetics). Nyligen har förbättrade algoritmer för att omvandla förfall signal signal publicerats ³⁰ och bör undersökas om signalavklingning är av särskilt intresse i ett visst experiment.
• Signalskalning. Förmodligen det mest godtyckliga steget i SHAPE databehandling, bör kontrollen profilen skalas så att toppintensiteterna bland minimalt reaktiva (+) och (-) spår är lika. Skalning kontrollen spår i alltför stor utsträckning kommer att resultera i ett överflöd av negativa reaktivitet värden i den första kvartilen (se Data Normalisering nedan). I detta fall bör skalfaktorn minskas i motsvarande grad och uppgifterna återintegreras.
• Peaks uppdrag. I allmänhet fungerar den automatiserade versionen av toppen uppdraget väl. När processen misslyckas, är det emellertid absolut nödvändigt att användaren se till att alla de toppar som har erkänts av programvaran, särskilt då signal-till-brus-förhållandet är lågt. Shoulder toppar t ex, inte alltid upptäcks, och G-rika se-kvenserna ofta komprimeras.

7. Data Normalisering

Att införliva nukleotid reaktivitetsprofiler i den sekundära strukturen algoritm som används av RNAStructure (v5.3) programvara, och / eller för att jämföra profiler av närbesläktade RNA, måste formdata normaliseras på ett standardiserat sätt ^12. Detta innebär (i) exklusive extremvärden från efterföljande beräkningar, (ii) bestämmer "effektiv maximum" reaktivitet (dvs. genomsnittet av den högsta 8% av reaktivitet värde, exklusive extremvärden), och (iii) normalisering genom att dividera alla reaktivitet värden genom den "effektiva maximala", enligt följande:

1. Öppna tabbavgränsad textfil genereras efter anpassning och integration och kopiera dess innehåll till ett Excel-ark. Kolumnen längst till höger på denna fil (RX.area-BG.area) innehåller de beräknade absoluta värden SHAPE reaktivitet för varje nukleotid i RNA. De vänstra kolumnerna relatera denna reaktivitet till RNA SEQUhet.
2. Beräkna och lagra den första och tredjedelar kvartilen (dvs. den 25: e och 75: e percentilen) värden för (RX.area-BG.area) med hjälp av Excel-funktionen "= kvartilen (array, quart)"
3. Beräkna och lagra interkvartila skillnaden "= kvartilen (array, 3)-kvartilen (array, 1)"
4. Beräkna och lagra "avvikande avskurna värdet" med hjälp av formeln "= (KVARTIL, array, 3) 1,5 * ((KVARTIL (matris, 3)-KVARTIL (matris, 1))". Alla reaktivitet värden större än detta värde är skall undantas från efterföljande beräkningar.
5. Kopiera reaktivitet värden från (RX.area-BG.area) och klistra in dem i en angränsande, tom kolumn och sedan sortera dessa värden så att den största är på toppen av kolonnen.
6. I den nyskapade "sorteras värden kolumnen", radera värden större än avvikare gränsvärde.
7. Beräkna och lagra medelvärdet för den största 8% av reaktivitet värden kvar i den sorterade "värden Column ". Detta värde är den" effektiva maximala "reaktivitet.
8. Dela upp osorterat (RX.area-BG.area) av varje nukleotid (inklusive extremvärden) med "effektiva maximala" reaktivitet värde att få de "normaliserade reaktivitet värden". Förvara dessa i en tom kolumn och lämnar en tom kolumn till vänster. Kopiera sedan de nukleotidnumren till vänster i tabellen och klistra in dem i den tomma kolumnen direkt till vänster om "normaliserade reaktivitet värden".
9. Kopiera och klistra nukleotidpositionen-normaliserade par reaktivitet värde i en textredigerare.
10. Eliminera värden under -0.09 (dvs. lämna mellanslag blank), eftersom dessa är troligen ett resultat av RT pausa under cDNA-syntes av andra skäl än kemisk modifiering av mallen. Dessutom, eventuella reaktivitet värden för nukleotider vid vilken stark pausa observeras på den omodifierade mallen (som bestäms genom visuell inspektion av "Justera och integrera" ShapeFinder profil) bör undantas.
11. Save filen med en. form förlängning för användning i strukturell analys med RNAstructure (v5.3) programvara.

8. Data Modeling

RNAstructure (v5.3) programvara används för att förutsäga experimentellt stöds RNA sekundärstruktur (er) med användning av pseudo-fria energi begränsningar som härrör från formanalys ^19. Programmet erbjuder grafiska representationer av de lägst energi 2D RNA strukturer samt textuella representation av dessa strukturer i dot-fästet notation. Det senare kan importeras i en RNA-struktur betraktaren av användarens önskemål, t.ex. Pseudoviewer ²³ eller Varna ^22, för att producera publikationen fotokvalitet.

Obs: Man måste vara försiktig när man överväger de strukturer som produceras av RNAstructure (v5.3) programvara. Till exempel kan programmet inte lösa tertiära interaktioner såsom pseudoknutar och kysser loopar, kan inte heller skilja på om brist påreaktivitet i en viss region beror på basparning eller sterisk skydd av bundna proteiner. Som en följd av dessa faktorer tillsammans med de energier som rapporterats för de individuella strukturerna, måste betraktas när den lägger fram en slutgiltig strukturell modell.

Representative Results

RNA innehöll HIV-1 rev-svarselementet (RRE) och en 3'-terminal struktur kassett ⁴ framställdes av en lineariserad plasmid genom transkription in vitro, varefter den viks för uppvärmning, kylning, och inkubering vid 37 ° C i närvaro _MgCl2. RNA utsattes för NMIA och sedan omvänd transkription från en 5'-ändmärkt DNA-primer hybridiserades till den 3'-terminala strukturen kassett. Det resulterande FORM cDNA-biblioteket, tillsammans med styr-och sekvensering reaktioner, fraktionerades sedan med användning av Beckman Coulter CEQ 8000 automatiserad kapillärelektroforessystem att producera elektroferogrammet avbildas i figur 4. De fyra överlappande, färgkodade spår framställes genom migrering av de fyra uppsättningarna av reaktionsprodukter genom kapillären, enligt följande: Blå (Cy5-märkta RT produkter genererade från omvänd transkription av NMIA-modifierade RNA), grönt (Cy5.5-märkt RT produkterna från vikta, men annars unmodified RNA), svart (WellRed D2-märkt DNA sekvenseringsstege genereras med ddG) och röd (Lycor800-märkt sekvenseringsstege, ddT).

De råa CE spår separerades, bearbetades linje och integreras med ShapeFinder programvara ^18. Regionen av trace (s) motsvarar ROT SLII regionen skildras i figur 5, att uppgifterna har bearbetats till den punkt omedelbart före toppintegrering (dvs. spår har anpassats, utsatts för bakgrundssubtraktion, korrektion för signalavklingning , osv.). Reaktivitet värden för varje nukleotid beräknas genom att integrera motsvarande toppar i NMIA (+) och NMIA (-) reaktioner (i de blå och gröna spår, respektive), och subtrahera den senare från den förra. Dessa reaktivitet värden anger omfattningen i vilken RT slutar vid varje nukleotid under omvänd transkription, vilket är en återspegling av den grad till vilken varje nukleotid har modifierats av NMIAoch därför är dess benägenhet att vara singel strandsatta i lösning.

Den HIV-1 RRE SHAPE reaktivitetsprofil genereras i ShapeFinder normaliserades och omvandlas till ett textdokument som lämpar sig för import till RNAStructure (v5.3) ^19. I det sistnämnda programmet, var reaktivitet värden införlivas i den sekundära strukturen förutsägelse algoritm som pseudo-energi begränsningar och därmed påverka vilka strukturer förutspås ha den lägsta fria energi. Programutbud består av två dimensionella RNA sekundära struktur kartor skildrar de lägsta energistrukturer genereras av algoritmen samt textfiler som innehåller dessa strukturer uttryckta i dot-fästet notation. Den senare av dessa utgångar kan exporteras till RNA visualisering programvara såsom VARNA ^22. Figur 6 visar 2D-struktur av HIV RRE SLII regionen genereras i RNAStructure (v5.3) med formen-härledda reaktivitetsprofiler och visualiseras med VARNA. Färgkodade SHAPE reaktivitet värden överlagras.

Figur 4. . Representant electropherogram av en RNA-prov visade i CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman) Programmet visar ett spår där varje kanal visas som en färgad linje: Blå och gröna kanalerna representerar (+) reagens och (-) reagens experiment, och svart och rött representerar sekvenseringsstegar. X-och Y-axlarna anger upplösning tid och fluorescens intensitet, resp. Klicka här för att visa en större bild.

files/ftp_upload/50243/50243fig5.jpg "/>
Figur 5. Elektroferogrammet analys med ShapeFinder verktyg ^18. Datavyn Window (mitten) ger grafisk feedback för varje databehandling steg. Verktyget Inspector-fönstret (nederst till vänster) visar parametrar för verktyget markerat i Scripting Inspector. Den Scripting Inspector (uppe till höger) visar de verktyg som har använts på de uppgifterna. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6. Tvådimensionell RNA-strukturen färgkodade för FORM reaktivitet genereras med VARNA visualisering applet ^22. Nukleotider är färgkodade för att ange graden (n) SHAPE reaktivitet. Idet spektrum som visas, blå och röda cirklar indikerar nukleotider och har låg och hög reaktivitet, respektive.

Discussion

Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för high-throughput SHAPE, en teknik som tillåter sekundär strukturbestämning till enkelsträngad nukleotid upplösning för RNA av alla storlekar. Dessutom koppling experimentella formdata med sekundära algoritmer struktur förutsägelse underlättar generering av RNA 2D-modeller med en högre grad av exakthet än vad som är möjligt med antingen enbart metoden. Kombinationen av fluorescensmärkta primrar och automatiserad CE ger betydande fördelar jämfört med traditionella gelbaserad form, underlättar upplösning av långa RNA-sekvenser i ett enda experiment, såväl som betydligt högre hastighet och genomströmning för flera experiment. Lämpligheten av denna metod och tillgången på lämpliga verktyg för dataanalys gör SHAPE perfekt lämpade för strukturell analys av tidigare svårbehandlad virus, intakt budbärare, och RNA icke-kodande. Eftersom de 2D-strukturerna i dessa spännande RNAs klarnat, användning av hydroxylradikal sondering, genomgående space klyvning metoder och molekylär modellering bör hjälpa belysa komplexa tertiära interaktioner och så småningom låta forskare att bestämma strukturerna för dessa RNA i tre dimensioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
N-methylisatoic anhydride (NMIA)	Life technologies	M25	Dissolve in anhydrous DMSO
1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)	see ref. 22
Superscript III Reverse Transcriptase	Life technologies	18080044	10,000 units
Thermo sequenase cycle sequencing kit	Affymetrix	78500
Materials provided by the user
RNA of interest			6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)
Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)			Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.
DNA template			DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.
Buffers
10x RNA renaturation buffer			100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X RNA folding buffer			200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)
2.5X RT mix			4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1.5 μl water,1 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).
GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)			Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles
EQUIPMENT
Capillary electrophoresis	Beckman	CEQ8000
Thermocycler	varies