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Biology

देखिए और चयापचयों से शुद्धिकरण Published: March 15, 2013 doi: 10.3791/50245
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 2, 3, 1,4, 1,4
1Department of Neurology, McKnight Brain Institute, University of Florida, 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida, 3Genetics Institute, Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida, 4McKnight Brain Institute, Department of Neuroscience, Genetics Institute, Center for Translational Research on Neurodegenerative Diseases, and Center for Movement Disorders and Neurorestoration, University of Florida

Summary

हम यहाँ निष्कर्षण और mRNA की शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं से चयापचयों का वर्णन

Abstract

पिछले दशक के लिए, हम neuronal अध: पतन की आणविक और सेलुलर तंत्र एक मॉडल जीव के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग को समझने की कोशिश की है. हालांकि फल मक्खियों स्पष्ट प्रयोगात्मक लाभ प्रदान करने, neurodegenerative रोगों पर अनुसंधान ज्यादातर आनुवंशिक बातचीत, ऊतक विज्ञान, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और प्रोटीन जैव रसायन सहित परंपरागत तकनीकों पर भरोसा किया है. इन तकनीकों यंत्रवत, परिकल्पना संचालित अध्ययन है, जो अच्छी तरह से परिभाषित जैविक समस्याओं में एक जीन की भूमिका की एक विस्तृत समझ के लिए नेतृत्व के लिए प्रभावी रहे हैं. हालांकि, neurodegenerative रोगों बेहद जटिल हैं और कई समय पर सेलुलर organelles और प्रक्रियाओं को प्रभावित. नई प्रौद्योगिकियों के आगमन और omics उम्र वैश्विक सेलुलर जटिल रोगों अंतर्निहित perturbations को समझने के लिए एक अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. ड्रोसोफिला जैसे लचीले मॉडल जीवों अपने मजबूत annot की वजह से इन नई प्रौद्योगिकियों के अनुकूल ढालने के लिए आदर्श होते हैंव्यावहारिक और उच्च शिक्षणीयता. इन छोटे जानवरों के साथ एक चुनौती है, हालांकि, मक्खी दिमाग के रूप में अत्यधिक प्रासंगिक ऊतकों से पर्याप्त सूचना अणु (डीएनए, mRNA, प्रोटीन, मेटाबोलाइट्स) की शुद्धि है. अन्य चुनौतियों के लिए प्रयोगात्मक replicates मक्खियों के बड़ी संख्या में इकट्ठा करने (सांख्यिकीय मजबूती के लिए महत्वपूर्ण) और उच्च गुणवत्ता वाले जैविक सामग्री की शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं को विकसित करने की मिलकर बनता है. यहाँ, हम उड़ सिर और टेप की निकासी और मेटाबोलाइट्स के हजारों इकट्ठा करने के लिए समझने के लिए कैसे जीन अभिव्यक्ति और चयापचय में वैश्विक परिवर्तन neurodegenerative रोगों के लिए योगदान के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है. इन प्रक्रियाओं को आसानी से स्केलेबल होते हैं और प्रोटिओमिक और epigenomic योगदान के रोग के लिए अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

पिछली सदी में, ड्रोसोफिला विकास में सबसे विशेष रूप से गहरा जैविक सवालों, कोशिका जीव विज्ञान, आनुवंशिकी, और तंत्रिका जीव विज्ञान 1 की जांच के लिए एक अमूल्य प्रयोगशाला उपकरण साबित हो गया है. इस सफलता के लिए कारण हैं कि फल मक्खियों आसान हेरफेर करने के लिए कर रहे हैं, एक कभी विस्तार 18 Toolbox, 21, 31, और उच्च गुणवत्ता वाले 26 एनोटेशन के साथ एक अपेक्षाकृत सरल जीनोम के अधिकारी. इन तकनीकी फायदे, उड़ समुदाय के भीतर निरंतर नवाचार और सरलता के साथ संयुक्त, व्यापक वैज्ञानिक योगदान के लिए मार्ग प्रशस्त किया है, के रूप में तीन नोबेल पुरस्कार देने के (1933, 1995, 2011) के द्वारा सचित्र. हाल ही में, ड्रोसोफिला मानव विकृतियों, मुख्य रूप से विकासात्मक विकारों, सहज प्रतिरक्षा, कैंसर, और 2 neurodegeneration का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में उभरा है. हम विशेष रूप से neurodegenerative रोगों के सेलुलर और आणविक आधार uncovering में रुचि रखते हैं. इन जटिल और विविध सहnditions विधानसभाओं, असामान्य रूप से मुड़ा हुआ प्रोटीन की संभवतः घुलनशील oligomers, से जुड़े रहे हैं और कर रहे हैं, इसलिए आसानी से मक्खियों में मॉडलिंग. अल्जाइमर, पार्किंसंस सहित प्रमुख neurodegenerative रोगों, और Huntington रोग, amyotrophic पार्श्व काठिन्य, कई ataxias tauopathies, prion रोगों, और अन्य दुर्लभ विकारों के सभी पिछले पन्द्रह 23 साल में किया गया है मक्खियों में मॉडलिंग की. फ्लाई प्रयोगशालाओं ड्रोसोफिला आनुवंशिकी के कौशल का शोषण करने के लिए नई रोगजनक प्रोटीन की न्यूरोटॉक्सिटी में फंसा जीन की पहचान के द्वारा मुख्य रूप से इन बीमारियों को समझने के लिए योगदान दिया है. एक बार नए neurotoxic झरना के लिए प्रासंगिक जीन की पहचान कर रहे हैं, उनके प्रभाव आम तौर पर ऊतक विज्ञान सहित अध: पतन के पैटर्न का पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीकों, प्रोटीन वितरण और सेलुलर विकृति निर्धारित immunofluorescence, और जैव रासायनिक विश्लेषण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं और असामान्य प्रोटीन रचना की मात्रा का आकलन . अंत behav,ioral विश्लेषण रोग परिणामों के एक कार्यात्मक readout के रूप में कार्य करता है. ये अच्छी तरह से स्थापित तकनीक रोग की प्रक्रिया में एक के योगदान या कुछ उम्मीदवार जीन की जांच के लिए शोषण किया गया है oxidative तनाव और mitochondrial 13 शिथिलता, transcriptional dysregulation 9, 27, 30, न्यायपालिका axonal परिवहन और synaptic गतिविधि 14, असामान्य आरएनए सहित 9 जीव विज्ञान, dysregulated सेल 29 संकेतन, ईआर 6 dyshomeostasis, सेलुलर Proteostasis 33, और कई अन्य 23 निस्र्द्ध. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि इन जहरीले प्रोटीन एक साथ कई परस्पर रास्ते के साथ हस्तक्षेप नहीं हो सकता है, इन परिवर्तनों के अस्थायी अनुक्रम क्या है, और रोगजनन प्रत्येक मार्ग के सापेक्ष योगदान क्या है. अनुसंधान के दशकों एक जीन पर ध्यान केंद्रित किया है, दोनों मानव और पशु मॉडल में परिकल्पना संचालित दृष्टिकोण एक अधूरा, सेलुलर तंत्र है कि कारण की puzzling तस्वीर का नेतृत्व किया हैneurodegeneration. सटीक तंत्र है जिसके द्वारा इन जहरीले प्रोटीन विधानसभाओं neuropathology कारण वर्तमान गरीब समझ रोग को संशोधित करने के उपचारों के विकास के लिए एक प्रमुख सीमा है.

अब हम समझ कैसे इन रोगजनक प्रोटीन वैश्विक सेलुलर perturbations को प्रेरित करने के लिए नए तरीकों के आवेदन में रुचि रखते हैं. omics युग के आगमन के गहरे जटिल जैविक परिष्कृत उच्च throughput प्रौद्योगिकियों, जो निकट भविष्य में प्रभावी रोग के उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं का उपयोग कर समस्याओं की जांच की अनुमति देता है. जीन अभिव्यक्ति अध्ययन (transcriptomics) एकाधिक जीनोम अनुक्रम के पूरा होने के बाद से उच्च गुणवत्ता एनोटेशन टेप की भविष्यवाणी कर सकते हैं के बाद स्थापित किए गए थे. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की प्रतिलिपि विश्लेषण (आरएनए - seq) हाल ही में आवेदन के नए लाभ एक निष्पक्ष दृष्टिकोण, मात्रात्मक रेंज में सुधार, और कम लागत 32 सहित, प्रोटीन की तुलना में और अवसर प्रदान किया है.हम आरएनए - seq के लाभ का फायदा उठाने के लिए बेहतर मुख्यतः विरासत में मिला गतिभंग की सबसे आम रूप है, Spinocerebellar गतिभंग 3 प्रकार (SCA3) या Machado यूसुफ रोग को समझने के लिए करना चाहते हैं. SCA3 एक monogenic, पूर्ण अंतर्वेधन साथ प्रमुख रोग, Ataxin3 (ATXN3) जीन 16 में एक सीएजी trinucleotide विस्तार की वजह से है. यह परिवर्तन एक लंबे पॉलीग्लुटामाइन (polyQ) ट्रैक है कि यह कुल के लिए खतरा बना देता है साथ Atxn3 प्रोटीन का उत्पादन होता है. है उत्परिवर्ती Atxn3 के बाद से सभी रोग से संबंधित perturbations के लिए SCA3 जिम्मेदार में neurotoxic एजेंट है, यह इन नए omic दृष्टिकोण को लागू करने के लिए एक आदर्श बीमारी है. इसके अतिरिक्त, SCA3 जल्द से जल्द neurodegenerative 34 मक्खियों में मॉडलिंग की बीमारियों में से एक था.

जबकि जगह में डाल आरएनए - seq के लिए मक्खी सिर के बड़ी संख्या में इकट्ठा करने के लिए प्रक्रियाओं, हमने महसूस किया कि हम अन्य जानकारी अणुओं की वैश्विक अध्ययन के प्रदर्शन के लिए एक ही सामग्री का उपयोग कर सकते हैं. अन्य उभरते discip के अलावालाइनों, प्रोटिओमिक्स, epigenomics, और metabolomics हासिल पहले नहीं गहराई में चुनौतियों के बिना नहीं हालांकि सेलुलर विकृति की परीक्षा देते हैं. के रूप में mRNA करने का विरोध किया, प्रोटीन और मेटाबोलाइट्स की सूची यह सब संभव splicing वेरिएंट और सभी सामान्य और रोगजनक चयापचयों की भी अधिक रहस्यपूर्ण मूल की भविष्यवाणी में वृद्धि कठिनाई के कारण समय में काफी अधूरा है. बड़े प्रयासों को वर्तमान में कर रहे हैं कई जीवों में और बीमारी की स्थिति में प्रोटीन की सूची के लिए चल रहा है. इस के लिए, हम बदल चयापचयों का SCA3 रोगजनन योगदान ड्रोसोफिला जैसे एक साधारण जीव, का उपयोग पर ध्यान केंद्रित करना चाहता था. यह एक अपेक्षाकृत नए और होनहार क्षेत्र, विशेष रूप से परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) के हाल ही में शुरू है, जो उच्च reproducibility प्रदान करता है और 5 नमूने, 24 को नष्ट नहीं है. हम प्रस्ताव है कि metabolite रूपरेखा biomarkers और रोग तंत्र neurodegenerati में फंसा की पहचान करने के लिए योगदान कर सकते हैंपर.

इन omic परियोजनाओं के साथ एक महत्वपूर्ण विचार है कि वे बड़े, वर्दी (200 मक्खी सिर) नमूने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सटीक शोधन तकनीक प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने के लिए आवश्यकता होती है. हम मक्खियों प्रक्रियाओं हम पहले प्रोटीन के लिए प्रयोग किया जाता था और यह भी 12 आरएनए - seq के लिए हाल ही में इस्तेमाल के बाद एकत्र करना शुरू कर दिया. लेकिन हम जल्द ही SCA3 constructs misexpressing से संबंधित समस्याओं का एक नंबर का सामना करना पड़ा. पहले, हम इन 4 प्रयोगों, जहां विश्लेषण के लिए लक्ष्य ऊतक मस्तिष्क था के लिए एक Gal4 चालक का चयन करने के लिए किया था. स्पष्ट पसंद एक अखिल तंत्रिका चालक होने के बाद से SCA3 एक मस्तिष्क रोग होता है. हालांकि, बाद से हम और पूरे सिर से mRNA चयापचयों इकट्ठा करना चाहते हैं, तो इस विकल्प को ऊतकों व्यक्त और गैर व्यक्त constructs से मिश्रित सामग्री का उत्पादन होगा. सजातीय नमूने जहां सभी कोशिकाओं constructs व्यक्त उत्पन्न करने के लिए, हम एक कमजोर लेकिन सर्वव्यापी चालक लाइन, daughterless (डीए) Gal4 का उपयोग करने का फैसला किया. Interestingly, 20 ATXN3 सहित neurodegenerative रोगों, में फंसा जीन के कई एक व्यापक वितरण किया है, सर्वव्यापक अभिव्यक्ति की उपयुक्त विकल्प बनाने. Atxn3-78Q रोगजनक की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति विकास के दौरान मारक के कारण होता है: तो, हम एक दूसरी समस्या का सामना करना पड़ा. इस मारक बाईपास, हम Gal80 टीएस शामिल Gal4 19 के अस्थायी सक्रियण को नियंत्रित करने के लिए. यह हमें 20 दिन के लिए प्रयोगात्मक मक्खियों, उन्हें उम्र इकट्ठा करने के लिए, उन्हें फ्रीज, और या तो (TRIzol) शाही सेना या metabolite (मेथनॉल क्लोरोफॉर्म) निकासी (1 चित्रा) के लिए उनके lyophilized सिर की प्रक्रिया की अनुमति दी. हम पहले से ही विश्लेषण transcriptomic और metabolomic के लिए नमूने प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, लेकिन इस तकनीक के लिए आवेदन अन्य स्पष्ट हैं (जैसे प्रोटिओमिक या न्यूरो peptidomic विश्लेषण).

प्रायोगिक सिंहावलोकन: इन प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य consi के संग्रह का समर्थनस्टेंट टेप और चयापचयों की निकासी के लिए मक्खी सिर के नमूने हैं. इन प्रक्रियाओं के विशिष्ट लक्ष्य मक्खियों व्यक्त Atxn3-27Q और Atxn3 78Q (गैर रोगजनक और रोगजनक प्रयोगात्मक constructs) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lacZ (नियंत्रण का निर्माण), जहां एक नमूना 200 मक्खी सिर के होते प्राप्त है. हालांकि मौजूदा प्रौद्योगिकी एकल 28 कोशिकाओं सहित बहुत छोटे नमूने के विश्लेषण की अनुमति देता है, हम 200 सिर प्रयोगात्मक, जैविक, और तकनीकी भिन्नता को खत्म करने के लिए जमा है, इस प्रकार हमें सेलुलर उच्च सांख्यिकीय विश्वास के साथ रोग की प्रक्रिया के साथ जुड़े परिवर्तन की पहचान करने के लिए अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण के लिए केवल उन जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन है कि जनसंख्या में लगातार कर रहे हैं, हमें सबसे महत्वपूर्ण ड्राइविंग रास्ते अध: पतन की ओर निर्देशन का पता लगाने के लिए बनाया गया है. चूंकि हम इन मक्खियों के सिर में उम्र पर निर्भर परिवर्तन में रुचि रखते हैं, तो प्रत्येक जीनोटाइप 10 1 में प्राप्त किया गया था, और उम्र के 20 दिनों के.

इन का एक मूलभूत पहलूवैश्विक का विश्लेषण करती है कि समर्थन जैविक उत्पादन एक मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण replicates. हमारे प्रोटीन और आरएनए - seq के साथ पिछले अनुभव से पता चलता है कि तीन प्रतियों में जैविक नमूने विश्लेषण डेटा 11, 12 के मजबूत सांख्यिकीय महत्व प्रदान करते हैं. हम धारा 1 में वर्णन) कैसे प्रत्येक जीनोटाइप और समय बिंदु के लिए एक एकल जैविक दोहराने (1 प्रतिनिधि) उत्पन्न करने के लिए. इन प्रक्रियाओं के लिए 2 और 3 प्रतिनिधि उत्पन्न दोहराया जा सकता है, या समानांतर में किया है, के रूप में लंबे समय के रूप में प्रत्येक प्रतिनिधि ठीक से पहचान की है. हालांकि तीन प्रतिनिधि लक्ष्य है, एक चौथे प्रतिनिधि (या भी 5) की स्थापना अत्यधिक के लिए एक या एक से अधिक में उम्र बढ़ने के दौरान कम, मक्खियों की उपज हानि से संबंधित मुद्दों, या सामग्री (मक्खियों, सिर, या आरएनए) के आकस्मिक नुकसान को कवर करने के लिए सिफारिश की है नमूने हैं.

हमने पाया है कि दस पार (AJ पत्र द्वारा की पहचान की बोतलों) 200 / सिर जीनोटाइप / समय बिंदु प्राप्त करने के लिए पर्याप्त संतान का उत्पादन. चरम देखभाल के लिए भ्रम की स्थिति से बचने के लिए लागू किया जाना चाहिए एक बोतलों की बड़ी संख्या के बाद से,फिर से एक प्रतिनिधि (10 बोतलें x 3 जीनोटाइप x 3 समय अंक = 90 बोतलों) प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस के लिए, हम प्रत्येक बोतल नामित जीनोटाइप, समय बिंदु, और बोतल पत्र का उपयोग कर. उदाहरण के लिए, 20e SCA3-27Q 20 दिनों के लिए वृद्ध Atxn3 27Q व्यक्त मक्खियों की 5 बोतल (दस वर्ष की) को संदर्भित करता है. संतान eclose एक बार, मक्खियों अलग अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ लेबल शीशियों में रखा जाता है.

हम प्रत्येक नमूना, बोतल, और एक एक्सेल स्प्रेडशीट में संग्रह बिंदु (सुबह और शाम) के लिए प्राप्त मक्खियों की संख्या को बनाए रखा. हम खाते मारक और escapees में ले ठंड से पहले शीशी प्रति मक्खियों की संख्या को संशोधित किया. उन अंतिम गिनती से, 200 शीशियों जोड़ने मक्खियों को आसानी से फ्रीजर खोलने से पहले स्थित किया जा सकता है, इस प्रकार के नमूनों के संरक्षण के लिए योगदान दे. चूंकि एक बोतल से एकत्र मक्खियों केवल एक प्रतिनिधि में इस्तेमाल किया जा सकता है, हम जैविक दोहराने के प्रति उनके योगदान को अधिकतम, हालांकि सभी प्रतिनिधि कई बोतलों से मक्खियों निहित है. हम सुरक्षितअपने निर्धारित प्रतिनिधि में नहीं किया जाता प्रतिस्थापन नमूने के रूप में अन्य प्रतिनिधि के लिए, या अन्य संबंधित प्रयोगों (वेस्टर्न ब्लॉट qPCR) के लिए, बोतलों से मक्खियों.

Protocol

1. सृजन एक दोहराने और मक्खियों (सावधानी, तरल नाइट्रोजन) बर्फ़ीली

उद्देश्य: जीनोटाइप / समय बिंदु के अनुसार कम से कम 200 महिलाओं, और फ्लैश फ्रीज लीजिए.

  1. जीनोटाइप: Gal80 टीएस, दा Gal4, Gal4 की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति लिए daughterless विनियामक क्षेत्र और तापमान के प्रति संवेदनशील Gal80 के नियंत्रण के तहत तनाव. एक नियंत्रण रेखा के रूप में, हम UAS lacZ का इस्तेमाल किया है, जो पहले से कोई हानिकारक प्रभाव पैदा करने के लिए दिखाया गया है. यूएएस - Atxn3 27Q और यूएएस - Atxn3 78Q, गैर रोगजनक और रोगजनक प्रयोगात्मक constructs, क्रमशः. (वाई, निर्माण HS छुपाया कुंवारी महिलाओं के एक अधिक कुशल संग्रह के लिए किया गया है पहले का इस्तेमाल किया है, लेकिन हम इसके खिलाफ फैसला अतिरिक्त समय के लिए Gal80 टीएस के साथ वाई, एच एस छुपाया परिचय की जरूरत की वजह से, दा Gal4 और गुणसूत्रों द्वितीय पर III).
  2. बोतल में 10 महिलाओं और 5 पुरुषों के संयोजन के द्वारा सभी शेयरों का विस्तारएस भीड़भाड़ रोकने के लिए. सभी प्रयोगों जैज मिक्स मक्खी मीडिया है, जो आसानी से तैयार है और कण के साथ तेजी से ड्रोसोफिला विकास और कम infestation को बढ़ावा देता है में किए गए.
  3. हर समय बिंदु के लिए दा Gal4 पुरुषों, और 100 यूएएस Atxn3 78Q कुंवारी (केवल एक यूएएस लाइन एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा), 50 Gal80 टीएस ले लीजिए.
  4. जीनोटाइप / समय बिंदु प्रति दस पार. पुरुषों और कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) पर महिलाओं / शयनयान पैड anesthetize. प्लेस दस कुंवारी यूएएस Atxn3-78Q (पाँच दिनों से कोई पुराने) मक्खियों और पांच पुरुष Gal80 टीएस, प्रत्येक बड़ी बोतल में दा Gal4 खमीर पेस्ट (rehydrated सूखी खमीर) के साथ नुकीला. लेबल जीनोटाइप, समय अंक, और बोतल पहचानकर्ता (पत्र AJ) के साथ बोतलों, और 25 डिग्री सेल्सियस में उन्हें जगह
  5. 2 दिनों के बाद, बोतलों से वयस्कों स्पष्ट है, सूखी खमीर की एक छिड़क और इष्टतम लार्वा विकास को प्रोत्साहित करने के लिए पानी की धार जोड़ने, और 18 डिग्री सेल्सियस (Gal80 सक्रिय बोतलें जगह है,Gal4 दमित). नकल नहीं पार के रूप में इस कुंवारी महिलाओं बनाम निषेचित से प्राप्त संतान में प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता में शुरू हो सकता है. इसके अलावा, प्रत्येक बोतल से संतान स्वतंत्र replicates जैविक (प्रत्येक बोतल अद्वितीय संतान पैदा) का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन तकनीकी हस्तांतरित पार (प्रतियां) हो replicates (एक ही आनुवंशिक संविधान के साथ अतिरिक्त संतान).
  6. जब संतान 18 साल की उम्र में ecloses ° सी, सीओ 2 स्लीपर / पैड पर anesthetize, वांछित जीनोटाइप कुंवारी इकट्ठा, और उन्हें (शीशी प्रति दो से बारह मक्खियों) के साथ छोटी शीशियों में जगह. बोतल पहचानकर्ता के साथ लेबल शीशियों. अलग बोतलों से नहीं मक्खियों पूल. शीशियों वापस 24 घंटे के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर रखें. संतान को अधिकतम करने के लिए, लगातार सुबह और शाम को इकट्ठा जारी है.
  7. जब शीशी में से प्रत्येक को 18 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे पूर्ण, उन्हें 29 ° C (निष्क्रिय Gal80, सक्रिय Gal4) पाली. इस दिन 0, प्रयोग के प्रारंभिक बिंदु, जब टीवह उनकी अभिव्यक्ति आरंभ transgenes.
  8. मक्खियों शीशियों हर 2 दिन साफ ​​करने के लिए जब तक वे 10 और 20 दिनों तक पहुँचने स्थानांतरण.
  9. जब मक्खियों वांछित उम्र (1, 10, 20 दिन) तक पहुँचने, गिनती और पूर्व लेबल एक छोटे से कीप का उपयोग cryovials में उन्हें स्थानांतरित खाद्य शीशियों से. मक्खियों anesthetize नहीं. बेंच पर शीशियों उलटें.
  10. 30 मिनट रुको मक्खियों हस्तांतरण (तनाव) से ठीक करने की अनुमति है, तो तरल नाइट्रोजन में दुकान में विसर्जन से शीशियों फ्लैश फ्रीज एक पूर्व लेबल, फ्रीजर बॉक्स पूर्व ठंडा याद रखें: उसी क्रम में मक्खियों रुक वे cryovial को हस्तांतरित किया गया, नमूने भर में cryovial वर्दी में बिताए समय बना रही है.

2. संग्रह और फ्लाई प्रमुखों के lyophilization शीत कक्ष, पूर्व सर्द सभी उपकरण, सावधानी, तरल नाइट्रोजन और सूखी बर्फ (प्रदर्शन)

उद्देश्य: फास्ट जुदाई, संग्रह, और ऊतकों की फ्रीज सुखाने.

  1. विधानसभाचलनी (ऊपरी सदन में सबसे बड़ी जाल शरीर इकट्ठा, निचले सदन में दूसरा सबसे बड़ा सिर इकट्ठा, छोटे भागों को इकट्ठा करने के लिए नीचे पर ढक्कन) और पूर्व -80 में सर्द ble ° सी कम से कम 30 मिनट के लिए.
  2. एक ही बोतल से उत्पन्न मक्खियों के योगदान को अधिकतम cryovials से 200 मक्खियों ले लीजिए. सुबह या शाम में एकत्र मक्खियों के बीच मतभेद के लिए क्षतिपूर्ति को सुनिश्चित करने के लिए, कि हर नमूना एक समान अनुपात / सुबह और शाम (हम सुबह 47% / 53% शाम) का उपयोग करता है नोट: दो नमूने 100-सिर से उत्पन्न शाही सेना जोड़ा जा सकता है बाद एक एकल दोहराने में 200 मक्खियों के बराबर उत्पन्न करने के लिए.
  3. 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर parafilm (~ 9 x 14 सेमी) का एक टुकड़ा शांत रहो.
  4. को parafilm, एक समय में कुछ पर पूरा मक्खियों के साथ cryovials खाली, गिनती 100 मक्खियों तक पहुँचने तक तूलिका, और सूखी बर्फ पर एक और cryovial में दुकान का उपयोग मक्खियों.
  5. तरल नाइट्रोजन में चलनी डुबकी, ऊपरी chamb 100 मक्खियों जोड़नेएर. चलनी 1 मिनट के लिए सख्ती से हिला. तरल नाइट्रोजन में इसे फिर से डुबकी, और 1 मिनट के लिए हिला.
  6. -80 में छलनी, एक microtube में निचले सदन से सिर इकट्ठा, और जगह खोलें ° सी.
  7. खोलें microtubes लपेटो parafilm में सबसे ऊपर है, और छोटे छेद बना.
  8. Lyophilizer में 2 दिनों की एक न्यूनतम के लिए नमूने रखें.

3. कुल शाही सेना निष्कर्षण और mRNA शोधन (RNaseZap साथ सभी सतहों समझो, बदलें दस्ताने अकसर)

उद्देश्य: अधिकतम उपज के लिए ऊतक homogenize, कुल शाही सेना को निकालने के लिए, और mRNA को पवित्र.

  1. फ्रीज ड्रायर से नमूने निकालें और प्रत्येक microtube तीन छोटे, बाँझ, इस्पात पीस गेंदों जोड़ने. Geno / चक्की में प्लेस, 1 मिनट के लिए 1,500 स्ट्रोक / मिनट पर चलाते हैं.
  2. ट्यूबों खोलें, 1 मिलीग्राम TRIzol जोड़ने के लिए, और parafilm ट्यूबों के साथ सील. 1 मिनट पीस, ट्यूबों ऊपर से नीचे का दोहन करने के लिए यदि आवश्यक हो तो इस्पात गेंदों स्थानच्युत करना. 1 मिनट पीस.
  3. मतइस बिंदु पर ट्यूब अपकेंद्रित्र ट्यूब (भंगुर हो जाएगा). RNase मुक्त एक नए microtube में स्थानांतरण मिश्रण (इस्पात गेंदों को छोड़कर). गोली 4 में एक tabletop microcentrifuge में सेलुलर मलबे ° C 12,000 x छ पर 10 मिनट के लिए.
  4. एक नया microtube तैरनेवाला स्थानांतरण. 1-ब्रोमो-3 chloropropane (BCP) के 0.1 संस्करणों जोड़ें, 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 4 में एक microcentrifuge में स्पिन ° 12,000 x छ नोट पर 15 मिनट के लिए सी: इस चरण में कई शाही सेना निष्कर्षण प्रोटोकॉल क्लोरोफॉर्म का उपयोग करें, BCP चरण जुदाई की क्षमता को बढ़ाने के द्वारा शाही सेना अधिकतम उपज का इरादा है. Centrifugation कदम के दौरान नमूने 4 ओ सी में रखते हुए भी चरण जुदाई की क्षमता में वृद्धि होगी और जलीय चरण में प्रोटीन और जीनोमिक डीएनए के प्रदूषण को कम.
  5. एक नया microtube शीर्ष जलीय परत स्थानांतरण. ठंडा isopropanol 0.5 संस्करणों जोड़कर शाही सेना पेंदी में बैठ जाना, छह बार पलटना मीलx. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 4 में एक microcentrifuge में स्पिन ° 10 मिनट के लिए 12,000 एक्स सी जी.

नोट: शाही सेना उबरने के अलावा, प्रोटीन भी जैविक और TRIzol की परत अंतरावस्था से निकाला जा सकता है, तो दोनों प्रोटिओमिक्स और transcriptomics विश्लेषण करती है एक ही नमूनों पर किया जा सकता है. हालांकि हम हमारे विश्लेषण में इस कदम का पालन नहीं किया, TRIzol निष्कर्षण घुलनशील प्रोटीन की उत्कृष्ट प्रतिनिधित्व और / बफर डिटर्जेंट extractions से झिल्ली और परमाणु प्रोटीन का अधिक से अधिक प्रतिनिधित्व पैदावार. ली और 17 लो 2-D जेल और LC-MS/MS सहित प्रोटिओमिक्स विश्लेषण करती है, के लिए उपयुक्त TRIzol उपयोग प्रोटीन को निकालने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन.

  1. तैरनेवाला निकालें. 1 मिलीग्राम ठंडा 70% (DEPC पानी का इलाज का उपयोग करें) इथेनॉल, और एक छोटी भंवर के साथ मिश्रण जोड़कर शाही सेना धो लें. 4 में एक microcentrifuge में स्पिन सी ° 12,000 x छ में 5 मिनट के लिए.
  2. तैरनेवाला निकालें. एयर के लिए एक गोली सूखीटी कम से कम 15 मिनट. शाही सेना गोली DEPC पानी की 80 μl जोड़ें और यह 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए जगह है. 4 डिग्री सेल्सियस विकेट पर छोड़ दें.
  3. आरएनए NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. 260 nm/280 एनएम पर absorbance का अनुपात 1.8 और 2.1 के बीच किया जा रहा है साथ 2.1 इष्टतम होना चाहिए.
  4. 30 ग्राम थोक शाही सेना ले लो, 4 यू DNase मैं, 60 यू RNasin, 10 μl 10x प्रतिक्रिया बफर, और DEPC पानी का इलाज करने के लिए कुल 100 μl मात्रा में लाने. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  5. शाही सेना शुद्ध RNeasy मिनी किट का उपयोग कर. 30 सेकंड के लिए सभी centrifugations प्रदर्शन और सभी "वैकल्पिक" कदम शामिल करने के अलावा निर्माता के निर्देशों का पालन.
  6. आरएनए NanoDrop का उपयोग निर्धारित एकाग्रता, और शाही सेना गुणवत्ता का आकलन "एक BioAnalyzer पर कुल शाही सेना पिको" परख का उपयोग.
  7. MRNA शुद्धि के लिए, एक microfuge RNase मुक्त ट्यूब 30 μl Dynabeads हस्तांतरण.
  8. एक चुंबक पर 1-2 मिनट के लिए ट्यूब और जगह तैरनेवाला हटाने के. में मोती Resuspendबंधन बफर के 15 μl. दोहराएँ.
  9. कुल शाही सेना के 5 ग्राम के साथ शुरू, 15 DEPC पानी का उपयोग μl मात्रा समायोजित करें. 65 में हीट ° सी 2 मिनट, बर्फ और जगह के लिए.
  10. 15 μl पूर्व धोया मोती के लिए कुल शाही सेना की 15 μl जोड़ें. 30 मिनट के लिए हर 5 मिनट pipetting मोती शाही सेना तपाना अच्छी तरह से मिलाएं. 1-2 मिनट के लिए चुंबक पर प्लेस और तैरनेवाला का सभी को हटा दें.
  11. सावधान pipetting द्वारा वॉशिंग बफर बी मिक्स के 35 μl जोड़ें. चुंबक पर रखें और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने के. धोने दो बार दोहराएँ.
  12. 80 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट के लिए 15 μl ठंड 10 मिमी (7.5 पीएच) Tris - एचसीएल और हीटिंग जोड़कर mRNA Elute. तुरंत चुंबक पर ट्यूब जगह है, एक ट्यूब RNase मुक्त करने के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर 3.8 के रूप में यों). यील्ड ~ कुल शाही सेना की 1-5% होना चाहिए.

Metabolomic विश्लेषण के लिए, 1 प्रोटोकॉल और 2) प्रदर्शन, और 4 के साथ आगे बढ़ना) के नीचे:

4. अतिरिक्त मेथनॉल - क्लोरोफॉर्मचयापचयों का ction

उद्देश्य: अलग ध्रुवीय और गैर - ध्रुवीय चयापचयों.

  1. क्लोरोफॉर्म 0.1 मिलीग्राम / lipids की निकासी के दौरान ऑटो ऑक्सीकरण रोकने मिलीलीटर की एक एकाग्रता में hydroxytoluene (BHT) butylated एंटीऑक्सीडेंट जोड़ें. सभी बाद के चरणों के लिए इस BHT-क्लोरोफॉर्म का प्रयोग करें.
  2. 200 सिर के स्थानांतरण में ठंडा, शंक्वाकार टोपी पेंच polypropylene ट्यूबों -80 पर फ्रीज डिग्री सेल्सियस पूर्व तौल, और lyophilize. सूखी वजन का निर्धारण करते हैं.
  3. ट्यूबों में 5-7 zirconia मोती रखो और प्रत्येक 20 सेकंड के चक्र के लिए 800 हर्ट्ज पर दो एक मनका डिब्बा में homogenize.
  4. भारी नमूना की सूखी वजन के आधार पर, निम्नलिखित अनुपात में पानी, मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म और जोड़ने: 11.74 x मेथनॉल, 10.59 x पानी, क्लोरोफॉर्म 11.74 x, जहाँ x ग्राम और उत्पाद में भारी नमूना के वजन है मिलीलीटर मात्रा में. मनका डिब्बा lyophilized सिर युक्त ट्यूब मेथनॉल के रूप में गणना और कुल पानी का 45% जोड़ें.
  5. Homogeniप्रत्येक 20 सेकंड के दो और चक्र के लिए मनका डिब्बा में ze.
  6. क्लोरोफॉर्म की मात्रा (100%) और पानी की बर्फ पर एक शंक्वाकार कांच की शीशी में (55%) बाकी जुडा. फिर, कांच की शीशी ऊतक मिश्रण हस्तांतरण (मोतियों के साथ). 10 मिनट के लिए हिला. बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  7. 4 में एक अपकेंद्रित्र में स्पिन है ° 2000 x छ में 5 मिनट के लिए सी. पाश्चर विंदुक (प्लास्टिक से बचने के लिए) और एक 2 microcentrifuge ट्यूब में जगह के साथ ध्रुवीय चरण (ऊपरी) निकालें.
  8. गैर - ध्रुवीय (कम) -80 पर एक छोटे कांच की शीशी और फ्रीज में चरण डिग्री सेल्सियस सहेजें सूखी नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत, यह सुनिश्चित करें कि नाइट्रोजन टैंक से चल रहा है टयूबिंग उच्च शुद्धता निकालने में plasticizers से बचने Tygon है.
  9. 620 μl deuterated क्लोरोफॉर्म के साथ गैर - ध्रुवीय चरण rehydrate. लेबल एनएमआर ट्यूब में 600 μl स्थानांतरण. विस्फोट प्रूफ -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर.
  10. ध्रुवीय चरण रखें Centrivap में और चलाने के लिए जब तक ट्यूब 30 में पूरी तरह से सूखा है ° C (~ 7 घंटा).
  11. Rehएक आंतरिक मानक के रूप में - [(trimethylsilyl) propionic-2 ,2,3,3 d4 एसिड 3] 620 μl ड्यूटिरियम ऑक्साइड में 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट (7.3 पीएच) 1 मिमी TMSP साथ बफर के साथ ध्रुवीय चरण ydrate. 30 सेकंड के लिए भंवर. 4 microcentrifuge में स्पिन ° 10,000 तलछट pigments और अन्य बड़े अणुओं, जो एनएमआर स्पेक्ट्रा के साथ हस्तक्षेप करेगा rpm पर 5 मिनट के लिए सी. लेबल एनएमआर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला के 600 μl.

Representative Results

दा Gal4 के नियंत्रण के तहत विस्तार Atxn3 की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति से प्रेरित मारक बाईपास, हम Gal80 टीएस साथ Gal4 की अस्थायी विनियमन की शुरुआत की. लेकिन संग्रह और मक्खियों की बड़ी संख्या की ठंड के साथ आगे बढ़ने से पहले, हम Gal80 टीएस और दा Gal4 के नियंत्रण के तहत हमारे transgene अभिव्यक्ति की गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए करना चाहता था. ऐसा करने के लिए, हम पार उत्पन्न है, 18 डिग्री सेल्सियस पर संतान छोड़ दिया है, वयस्क मक्खियों एकत्र, और 24 घंटे के लिए उन्हें 18 साल की उम्र में बनाए रखा डिग्री सेल्सियस फिर, हम प्रतिबंधक तापमान (29 डिग्री सेल्सियस) पर मक्खियों रखा और उन्हें 6 0 के लिए incubated, 12, 24, 36, 48, और 72 घंटे. अगला, हम एकल मक्खियों से पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रकाशित 10 प्रोटोकॉल निम्नलिखित विस्तारित polyQ एलील के संचय का पता चला. अभिव्यक्ति 1 का पता चला था, लेकिन तापमान के बदलाव के बाद बेहोश 6 घंटा और 48 घंटा तक वृद्धि जारी रखा, जब यह संतृप्ति स्तर (2A चित्रा) पर पहुंच गया. Interestingly, एक उच्च अघुलनशील polyQ के आणविक वजन बैंड 48 घंटा के बाद दिखाई दिया, यह प्रोटीन के लिए बड़ी समुच्चय के रूप में लेता है समय का संकेत है. हम भी हर समय बिंदु पर मक्खी दिमाग dissected immunofluorescence (चित्रा 2B) विस्तारित polyQ एलील का वितरण निर्धारित. प्रोटीन तापमान बदलाव के बाद पहली बार 24 घंटे का पता लगाया गया था, हालांकि असमान वितरण के साथ. 24 और 48 घंटे के बीच प्रोटीन के स्तर में वृद्धि जारी रखा, जिससे कई मस्तिष्क स्पष्ट रूप से केन्द्रों antennal lobes और मशरूम शरीर अनुमानों (चित्रा 2B) सहित दिखाई. 48 और 72 घंटे के बीच विस्तारित polyQ एलील की अभिव्यक्ति अधिक से अधिक के स्तर पर पहुंच गया है, सुझाव है कि Gal4 प्रणाली इस समय पूरी तरह सक्रिय हो गया था. इन परिणामों के आधार पर, हम बाद के प्रयोगों के लिए पहली बार बिंदु (1 दिन) के रूप में तापमान में बदलाव के बाद 24 घंटे का चयन किया है. 10 और 20 दिनों के पुराने मक्खियों का संग्रह भी तापमान बदलाव (ती से शुरू मापा गयामुझे 0), जो समय के है जब प्रयोग रोगजनक और नियंत्रण transgenes की नई अभिव्यक्ति के साथ शुरू होता है.

एक बार जब हम सत्यापित कि Atxn3 Gal80 टीएस और दा Gal4 29 डिग्री सेल्सियस के नियंत्रण के तहत 24 घंटे के बाद पता चला था, हम सोच रहा था कि इन 20 दिनों से अधिक मक्खियों neurodegeneration के लक्षण दिखा सकते हैं. चूंकि इन मक्खियों वयस्क के रूप में रोगजनक प्रोटीन व्यक्त शुरू, हम डर था कि वे एक लंबी ऊष्मायन समय neurodegenerative phenotypes को दिखाने की जरूरत हो सकती है. इन शर्तों में Atxn3-78Q की विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए, हम lacZ, Atxn3 27Q, और Atxn3 78Q व्यक्त मक्खियों एकत्र, और उनकी लंबी उम्र दर्ज की गई. जबकि lacZ और 20 दिनों के बाद 90% की व्यवहार्यता पर प्रदर्शित Atxn3 27Q व्यक्त मक्खियों, व्यक्त मक्खियों Atxn3 78Q 20 दिन (30%) में कम अस्तित्व दिखाया (चित्रा 3). वास्तव में, Atxn3-78Q मक्खियों 10 दिन (7% मृत्यु दर) और 15 दिन से मरने के लिए नुकसान महत्वपूर्ण था (20%) है, जो पिछले पाँच घ में त्वरित करने के लिए शुरू कर दियाays. इस प्रकार, इन परिणामों से संकेत दिया है कि एक रोगजनक जीन के वयस्क अभिव्यक्ति छोटा उम्र, neurodegenerative Atxn3-78Q द्वारा प्रेरित phenotypes का एक महत्वपूर्ण संकेत के परिणामस्वरूप.

इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से निकाले सामग्री की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए ठंड के बाद से निपटने और नमूनों के संरक्षण था. हम 200 सिर (उम्र और जीनोटाइप पर निर्भर करता है) के अनुसार कुल शाही सेना के 15-80 ग्राम के बीच DNase NanoDrop अनुसार उपचार से पहले निकाली गई. लगभग एक तिहाई (6-25 ग्राम) शाही सेना के रूप में अत्यधिक शुद्ध DNase उपचार के बाद 260 nm/280 एनएम पर absorbance के अनुपात से बरामद किए गए. हालांकि, हमने पाया है कि आरएनए - seq के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी के लिए शाही सेना की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा तरीका BioAnalyzer पर कुल शाही सेना का विश्लेषण किया गया था. सौभाग्य से, केवल शाही सेना (5 एनजी) की एक छोटी राशि BioAnalyzer पर इस्तेमाल किया गया था, तो यह नमूना प्रति कई पुस्तकालयों का उत्पादन करने की क्षमता को प्रभावित नहीं किया है. एक उदाहरण के रूप में, हम कुल के दो नमूने भागाआरएनए एक BioAnalyzer चिप पर DNase उपचार से पहले, उनमें से अपमानित किया जा रहा (4A-C चित्रा) के संदिग्ध. उच्च गुणवत्ता शाही सेना (1 नमूना) तीन तेज शाही सेना बैंड, बस +२,००० nucleotides नीचे (NT) 200 NT के नीचे आकार और एक छोटे बैंड में दो, ribosomal RNAs (4A चित्रा) का प्रतिनिधित्व करने का उत्पादन किया. करीब 2,000 NT के दो बैंड 18S rRNA (छोटे चोटी) और 28S rRNA (बड़ा शिखर), जो rRNA ड्रोसोफिला में जीव विज्ञान (4B चित्रा देखें) का एक अनूठा पहलू यह है से दो टुकड़े के अनुरूप. ये गुण भी BioAnalyzer निशान (4B चित्रा) में मनाया गया. इसके विपरीत, एक पदावनत आरएनए (2 नमूना) नमूना ribosomal RNAs के तेज चोटियों का उत्पादन नहीं किया था, और कम से कम 500 NT (4A चित्रा) के कई बैंड संचित. इस आकार के वितरण तत्काल BioAnalyzer (चित्रा 4C) निशान, जिसमें छोटे आकार के व्यापक चोटियों का उल्लेख किया गया में प्रतिष्ठित किया गया था. इसके अलावा w ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्णy-अक्ष के दो शाही सेना के नमूने, जो प्रदर्शन किया है कि अपमानित नमूना कम शाही सेना के बीच इकाइयों में अंतर के रूप में. केवल अधिकतम गुणवत्ता प्रदर्शित (1.8 और 2.1 के बीच 260 nm/280 एनएम पर absorbance के NanoDrop 2.1 इष्टतम किया जा रहा है, प्रोटोकॉल 3.8 कदम देखने के साथ, अनुपात) आरएनए पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

चयापचयों की निकासी के लिए, हम एक क्लासिक पानी / मेथनॉल / (2.0:2.0:1.8) क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रक्रिया दो चरणों में दोनों ध्रुवीय और गैर - ध्रुवीय 35 चयापचयों की निकासी को अधिकतम 3 विभाजन के बाद. ध्रुवीय और गैर - ध्रुवीय चरणों को अलग करने के बाद, हम उन्हें deuterated पानी में पुनर्गठन या क्लोरोफॉर्म deuterated, क्रमशः, और एनएमआर द्वारा विश्लेषण के लिए आंतरिक मानकों जोड़ा. एनएमआर स्पेक्ट्रा का उपयोग कर इस निष्कर्षण विधि फ्लैट baselines और संकीर्ण लाइनें (5 चित्रा) के साथ अच्छी तरह से सुलझाया गया, उच्च गुणवत्ता के अर्क के शुद्धीकरण का संकेत है, दोनों चयापचय की रूपरेखा के लिए एक उपयुक्त प्राप्तचयापचयों की बड़ी संख्या की पहचान चित्रा 5. 7 साहित्य में रासायनिक परिवर्तन के अनुसार, कुछ प्रमुख ग्लूकोज और sucrose, और दो ​​प्रमुख चयापचय एसिड, लैक्टेट और एसीटेट जैसे अत्यधिक प्रचुर मात्रा में मेटाबोलाइट्स, इसी चोटियों की पहचान से पता चलता है. रासायनिक बदलाव (मिलियन प्रति भागों में) एक मानक अणु (टीएमएस, सही से पहले चोटी) के सापेक्ष अणु के परिरक्षण विद्युत का प्रतिनिधित्व करता है. अधिक shieldedmolecules उच्च घनत्व इलेक्ट्रॉन नाभिक के चारों ओर है और स्पेक्ट्रम के alkyls सहित सही करने के लिए दिखाई देगा. एमाइड और खुशबूदार hydrogens के रूप में Deshielded अणुओं स्पेक्ट्रम के बाईं ओर दिखाई देगा. व्यस्त मध्यम वर्ग (3-4 पीपीएम) चीनी अणुओं के लिए समृद्ध है.

चित्रा 1

चित्रा 2
चित्रा 2. कैनेटीक्स अभिव्यक्ति (ए) वेस्टर्न ब्लॉट Atxn3 78Q अभिव्यक्ति (Gal80 टीएस, दा Gal4 / यूएएस Atxn3 78Q) दिखा. 29 पर incubated मक्खियों ° सी 0 से 72 घंटा. एक बेहोश बैंड 1 घंटा 6 में पाया जाता है और संतृप्ति अधिष्ठापन के बाद 48 घंटा तक पहुँच जाता है. (बी) एक ही मक्खियों में पूरे दिमाग के इम्यूनोफ्लोरेसेंस. दिमाग dissected थे, तय, एकएक एंटीबॉडी कि विस्तारित polyQ प्रोटीन की पहचान के साथ दाग. प्रोटीन 1 मशरूम शरीर (MB) अनुमानों और antennal lobes (AL) में पाया जाता है. के बीच 48 और 72 घंटा, अभिव्यक्ति अधिकतम स्तर तक पहुँचता है और अत्यधिक प्रचुर मात्रा innervation साथ मस्तिष्क केन्द्रों में दिखाई देता है. न्यूरॉन प्रति अभिव्यक्ति स्तर कमजोर है, के रूप में ऑप्टिकल (राजभाषा) राजभाषा और केंद्रीय मस्तिष्क के बीच कुछ बड़े न्यूरॉन्स में छोड़कर पालि में देखा है.

चित्रा 3
चित्रा 3. उम्र Atxn3-78Q कम वयस्क चरणों (Gal80 टीएस, दा Gal4) में lacZ, Atxn3, 27Q, और सर्वत्र Atxn3-78Q व्यक्त मक्खियों. उनकी लंबी उम्र के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर नजर रखी मक्खियों lacZ (नीला) और Atxn3 27Q (हरा) व्यक्त 20 दिन से मृत्यु दर के कम स्तर से पता चला है. इसके विपरीत, (लाल) Atxn3 78Q प्रदर्शित व्यक्त मक्खियोंएक स्पष्ट मृत्यु दर 10 दिन में शुरू. 15 दिन तक वे व्यवहार्यता में 20% की कमी है, जो अगले पांच दिनों में त्वरित, 20 दिन से मृत्यु दर 70% तक पहुंच दिखाया.

चित्रा 4
चित्रा 4. आरएनए गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता और अपमानित नमूनों से मूल्यांकन आरएनए एक BioAnalyzer चिप पर चलाया गया था. (ए) BioAnalyzer एक उच्च गुणवत्ता (1 नमूना) शाही सेना और एक पदावनत (2 नमूना) आरएनए अगले एक आकार मार्कर (बाईं लेन) के साथ चला रहे हैं. तीन तेज केंद्रीय लेन में ribosomal शाही सेना के लिए इसी चोटियों नोट. (बी) BioAnalyzer 1 नमूना के लिए सिर्फ 2,000 NT और 200 के नीचे एक नीचे दो विशेषता मजबूत चोटियों के साथ, अनुरेखण. (सी) BioAnalyzer नमूना 2, जो ज्यादातर अपमानित शाही सेना के होते हैं के लिए अनुरेखण. नोट पैनलों बी और सी के बीच y-अक्ष पर इकाइयों में अंतर.


चित्रा 5. प्रतिनिधि ध्रुवीय चयापचयों का 1D एनएमआर स्पेक्ट्रा ड्रोसोफिला और पूरक 2 डी (सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी) मधुर और HSQC (heteronuclear एकल क्वांटम सहसंबंध) चोटी के काम के लिए प्रयोग से ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स के प्रतिनिधि 1D प्रोटॉन एनएमआर स्पेक्ट्रम. ग्लूकोज, 3: बीटा alanine, 4: एसीटेट, 5: लैक्टेट, 2 सूकरोज: चयापचयों ज्ञात रासायनिक बदलाव-1 के अनुसार पहचान की.

Discussion

हमारे transcriptomics 11, 12, 15 चयापचय, और neurodegenerative रोगों 6, 8 में पिछले अनुभव पर बिल्डिंग, हम यहाँ रोगजनक जीनों की अभिव्यक्ति के साथ वयस्क विशिष्ट उड़ सिर के हजारों इकट्ठा करने के लिए एक नए प्रोटोकॉल, और शुद्ध और के लिए mRNA चयापचयों मौजूद आरएनए - seq और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी क्रमशः. इन प्रयोगों के प्रकृति के कई नवाचारों के निगमन मक्खी संग्रह से पहले एक देशव्यापी Gal4 लाइन और अस्थायी विनियमन के जीन की अभिव्यक्ति के उपयोग के चयन सहित, की आवश्यकता है. Gal4, transgenes की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति के बारे में दो कारणों के लिए महत्वपूर्ण था. सबसे पहले, ATXN3, Huntingtin, amyloid प्रोटीन अग्रदूत, और Superoxide dismutase 1 सहित neurodegenerative रोगों, दूसरों के बीच में शामिल जीनों की एक बड़ी संख्या है, व्यापक रूप से के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तंत्रिका तंत्र के बाहर अन्य प्रकार की कोशिकाओं में neuronal और glial कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं. हम चाहते थेसर्वव्यापक अभिव्यक्ति के परिणामों का विश्लेषण के बजाय तंत्रिका अभिव्यक्ति पर ही ध्यान केंद्रित द्वारा सही ढंग से इन रोगजनक जीनों के जीव विज्ञान के इस पहलू मॉडल. दूसरा, यह करने के लिए बड़ी संख्या में मक्खी दिमाग को इकट्ठा करने के लिए संभव नहीं है, लेकिन हम तो मक्खी स्थिति के अनुसार तीन प्रतियों में (200 से अधिक) सिर 11, 12 के साथ कर सकते हैं. के बाद से पूरे सिर के homogenization तंत्रिका और गैर - तंत्रिका ऊतकों घोला जा सकता है, सर्वव्यापक transgene अभिव्यक्ति एक ही transgenes व्यक्त कोशिकाओं की आबादी से वर्दी शाही सेना और मेटाबोलाइट्स प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि दा Gal4 इसकी काफी भी वितरण के लिए चुना गया था, हालांकि हाल ही में एक रिपोर्ट में सुझाव दिया है कि दा Gal4 पूरी तरह सर्वव्यापी नहीं हो 25 मई अपनी उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की वजह से नहीं है. हम पहले हाथ, टब, और अधिनियम Ga4 सहित अन्य सर्वव्यापक Gal4 लाइनों, माना जाता था, लेकिन वे सभी वयस्क सीएनएस और मांसपेशियों में जटिल अभिव्यक्ति पैटर्न से पता चला है, उन्हें एक कम कर रहीइस अध्ययन के लिए dequate. वास्तव में, वयस्क दिमाग में immunofluorescence से पता चला है कि दा Gal4 व्यापक लेकिन कमजोर अभिव्यक्ति है, जो केवल मस्तिष्क के कुछ हजार axons की शामिल केन्द्रों में और कुछ बड़े न्यूरॉन्स में उच्च स्तर (2 चित्रा) में संचित लाती है. हालांकि constructs की अभिव्यक्ति के स्तर को कम किया गया है, इन शर्तों में नाटकीय रूप से एक फैशन polyQ निर्भर अस्तित्व को कम कर दिया. इस अभिव्यक्ति गतिशीलता हमारी जरूरतों को पूरा जबकि धीमी गति से, प्रगतिशील सेलुलर neurotoxic प्रोटीन से प्रेरित परिवर्तन के अवलोकन के लिए अभिव्यक्ति के निम्न स्तर, जो महत्वपूर्ण था रखने.

Neurotoxic प्रोटीन की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति उत्प्रेरण के लिए एक उम्मीद के मुताबिक परिणाम था कि यह वयस्क eclosion करने से पहले मारक के कारण होता है. सौभाग्य से, इस जटिलता टीएस Gal80 के उपयोग के साथ नजरअंदाज किया गया था. जैसा कि ऊपर चर्चा, जीन अभिव्यक्ति तापमान के बदलाव के बाद लगभग 48 घंटे अधिक से अधिक के स्तर पर पहुंच गया है, जो समय fra के साथ अच्छी तरह से फिट बैठता हैमुझे प्रयोग के. का उपयोग करने के Gal80 टीएस एक अतिरिक्त लाभ यह था कि, प्रयोगों जहां neurotoxic प्रोटीन constitutively अखिल neurally व्यक्त कर रहे हैं, के विपरीत में, तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान कोई अभिव्यक्ति थी. इस प्रकार, Gal80 टीएस के उपयोग एक "साफ" पृष्ठभूमि जहां तंत्रिका तंत्र को संवेदनशील विकास के चरणों के दौरान इन neurotoxic प्रोटीन की विषाक्त गतिविधियों को उजागर नहीं किया गया था बनाया. हमारे विचार में, वयस्कों में जीन की अभिव्यक्ति के सक्रियण वयस्क शुरुआत विकृतियों के इस वर्ग के लिए एक बेहतर मॉडल के परिणामस्वरूप. हालांकि, Gal80 टीएस भी तापमान में परिवर्तन के साथ जुड़े कुछ जटिलताओं की शुरुआत की. एक था कि कम तापमान (18-20 डिग्री सेल्सियस) में बढ़ रही मक्खियों के जीवन चक्र में देरी, प्रयोगों काफी लंबे समय तक बना. इसके अलावा, यह सर्वविदित है कि उच्च तापमान (29-31 डिग्री सेल्सियस) में बढ़ रही मक्खियों उनके चयापचय, के रूप में 25 में वृद्ध मक्खियों की तुलना में छोटा जीवन द्वारा सचित्र डिग्री सेल्सियस accelerates सीnce transcriptional और चयापचय अध्ययन उच्च तापमान पर वृद्ध मक्खियों में प्रदर्शन किया जाएगा, हम सेलुलर तनाव रास्ते और ऊर्जा चयापचय में महत्वपूर्ण परिवर्तन देखने की उम्मीद कर सकते हैं. यही कारण है कि यह इतना महत्वपूर्ण था प्रयोग, एक गैर रोगजनक Atnx3 27Q और एक असंबंधित नियंत्रण lacZ व्यक्त के साथ करने के लिए दो नियंत्रण परिचय. इन नियंत्रणों जीन अभिव्यक्ति और चयापचय उच्च तापमान के साथ जुड़े परिवर्तन के लिए एक आधार रेखा प्रदान इतना है कि हम उन लोगों के सीधे विषाक्त Atxn3 की अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं. वयस्क शुरुआत, प्रगतिशील रोगों का अध्ययन करने के लिए और कुछ नुकसान (तापमान मुद्दों और अगले पैराग्राफ) कुल मिलाकर, हम मक्खियों कि कई लाभ प्रदान करने का संग्रह करने के लिए कई संशोधन पेश किया है.

हालांकि Gal80 टीएस साथ अस्थायी विनियमन इसके अलावा एक सहायक था, यह भी एक अप्रत्याशित जटिलता की शुरुआत की. जबकि दोनों Gal80 टीएस पेट मक्खियों पैदाएक स्थिर स्टॉक में एन डी दा Gal4 constructs, हमने पाया है कि दोगुना homozygous के लिए दोनों constructs व्यवहार्य थे लेकिन बाँझ मक्खियों. चूंकि homozygous Gal80 टीएस और दा Gal4 उपभेदों व्यवहार्य और खुद के द्वारा उपजाऊ थे, यह स्पष्ट क्यों संयोजन कम प्रजनन प्रदर्शित नहीं है. यह कुछ समय है कि Gal4 थोड़ा ड्रोसोफिला 22 ऊतकों को विषाक्त है के लिए जाना जाता है. यह संभव है, तो, है कि खमीर transcriptional repressor Gal80 heterologous अभिव्यक्ति हस्तक्षेप, अंतर्जात transcriptional मशीनरी के साथ संभावित Gal4 की विषाक्तता के लिए योगदान दिया. इस विषाक्तता दा, एक जीन है कि प्रारंभिक विकास और यौन संकल्प में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है के नियंत्रण के तहत Gal4 की सर्वव्यापक वितरण द्वारा exacerbated किया जा सकता है. बाँझपन के मूल कारणों के बावजूद, हम Gal80 टीएस का विस्तार, दा Gal4 पर एक balancer गुणसूत्र को बनाए रखने जबकि हो रखने के द्वारा मक्खियों दा Gal4के लिए Gal80 टी एस mozygosity, सुझाव है कि Gal4 बाँझपन के लिए एक और महत्वपूर्ण योगदान है. यह समाधान महत्वपूर्ण था, क्योंकि हम हर दूसरे सप्ताह यूएएस transgenes में से प्रत्येक के साथ पार करने के लिए इन पुरुषों के सैकड़ों का इस्तेमाल किया. हालांकि, एक उपयुक्त संतान के चयन के दौरान अतिरिक्त काम बनाया balancer ले पार. केवल संतान में से एक चौथाई (25%) (महिलाओं, गैर balancer) एकत्र किया गया था, जो चयन समय जोड़ा, बोतल प्रति उपज कम, और जीनोटाइप प्रति कम से कम 200 मक्खियों प्राप्त / / को दोहराने के समय की जरूरत बोतलों की संख्या में वृद्धि हुई बिंदु. कुल मिलाकर, हालांकि मक्खियों का संग्रह समय लेने के बड़े सेट की जरूरत के लिए कारण बन गया है, हमें विश्वास है कि रोगजनक जीनों की अभिव्यक्ति पर निर्णायक के बाद केवल कुछ घंटों के सेलुलर परिवर्तन का अध्ययन सर्वत्र उपन्यास और दिलचस्प प्रगतिशील neuronal नुकसान में फंसा प्रक्रियाओं की पहचान कर रहे हैं.

एक बार आनुवंशिक डिजाइन जगह में था, हम करने के लिए विशेष ध्यान दियाप्रयोगात्मक अभिव्यक्ती कि जैविक परिवर्तनशीलता मिलवा सकता है. सबसे पहले, हम केवल कुंवारी महिलाओं एकत्र नमूनों की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए, हालांकि यह दूर फेंक पुरुषों और संतान के लिए एक दिन में दो बार की जाँच का मतलब है. उम्र बढ़ने के दौरान, कोई 12 से अधिक एक ही शीशी में मक्खियों भीड़भाड़ और तनाव से बचने के लिए रखा गया था. इसके अलावा, ठंड से पहले, मक्खियों संज्ञाहरण के बिना cryovials स्थानांतरित कर दिया गया और 30 मिनट के लिए स्थानांतरण से उबरने की अनुमति. ये प्रतीत होता है तुच्छ कारक जीन की अभिव्यक्ति और चयापचय को प्रभावित करने के लिए, कि प्रयोग करने के लिए प्रासंगिक नहीं होगा अंतिम विश्लेषण में परिवर्तनशीलता शुरू कर सकते हैं.

जमी सामग्री (सिर, शाही सेना, और मेटाबोलाइट्स) की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, हम हर विस्तार है कि ऊतक क्षरण करने के लिए योगदान कर सकते हैं पर विशेष ध्यान दिया. चूंकि मक्खियों छोटे संख्या में cryovials (शीशी प्रति 12 मक्खियों) को स्थानांतरित कर रहे हैं, हम 200 सिर के संग्रह के लिए कई शीशियों को पुनः प्राप्त करने के लिए किया था. इन जोड़तोड़ घ थेएक सूखी बर्फ और तरल नाइट्रोजन के साथ एक ठंडे कमरे में चरम देखभाल के साथ. मक्खियों, सिर की जुदाई, और सूचना के अणुओं की शुद्धि का संग्रह भी काफ़ी समय से पता चलता है कि सामग्री इस लंबी प्रक्रिया के अंत में अपमानित किया गया था. यह सुनिश्चित करना है कि सामग्री इसकी गुणवत्ता को बरकरार रखे हुए है के अलावा, इस प्रोटोकॉल में कई कदम है कि शाही सेना और फ्रीज सुखाने और मनका की धड़कन सहित मेटाबोलाइट्स, अधिकतम उपज का वर्णन करता है. RT-पीसीआर या पूरे मक्खियों से मात्रात्मक पीसीआर के लिए ये कदम सामान्य extractions के लिए की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं, लेकिन वे मक्खी सिर के रूप में इस तरह के छोटे नमूने से लगातार शुद्धि के लिए महत्वपूर्ण हैं. हम निर्धारित किया है कि अन्य कदम शाही सेना की उपज को प्रभावित. उदाहरण के लिए, पुराने मक्खियों छोटी मक्खियों की तुलना में काफी कम शाही सेना का उत्पादन किया, जीनोटाइप की परवाह किए बिना. इस अवलोकन का सुझाव दिया है कि उच्च तापमान पर उम्र बढ़ने के नाटकीय परिवर्तन लाती है. इसके अलावा, 100 सिर से शाही सेना निकालने था वास्तव में अधिक 200 सिर से की तुलना में कुशल है, तो हम दो ख में शुद्ध के लिए रवाना100 नमूना प्रति के atches, केवल उन्हें गुणवत्ता के BioAnalyzer साथ सत्यापन के बाद गठबंधन करने के लिए. इसके अलावा, mRNA शुद्धि के लिए कॉलम के लिए आसानी से तर करने के लिए लग रहा था, तो कुल शाही सेना की राशि प्रति स्तंभ इस्तेमाल करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.

चयापचयों छोटे अणुओं की एक विविध मिश्रण कर रहे हैं, तो गुणवत्ता नियंत्रण के डीएनए, शाही सेना, या प्रोटीन के साथ की तुलना में और अधिक कठिन है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (दुर्भाग्य से, वहाँ इस समय कोई किसी भी पशु मॉडल के लिए चयापचयों की पूरी सूची है, कुछ है कि अगले कुछ वर्षों में धन्यवाद एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और तरल क्रोमैटोग्राफी के विस्तार का उपयोग सहित कई प्रौद्योगिकीय नवाचारों के आवेदन करने के लिए बदल किया जा सकता है LC-एमएस). हालांकि एनएमआर एमएस की तुलना में कम संवेदनशील है, यह नमूनों का कोई विनाश, कोई विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं है कि पूर्वाग्रह (नियंत्रण रेखा) परिचय है, और उच्च reproducibility कि प्रतिनिधि और कई प्रयोगात्मक शर्तों के 24 के सांख्यिकीय तुलना की अनुमति देता है सहित कई होनहार लाभ, से पता चलता है. इस प्रकार, नमूना हो सकता हैretested टिप्पणियों को सत्यापित करने के लिए या LC-एमएस एनएमआर डेटा को मान्य करने के लिए फिर से विश्लेषण किया. यहाँ, हम मक्खियों से प्रारंभिक एनएमआर डेटा से पता चला है कि हम ड्रोसोफिला में चयापचयों की एक सूची संकलन करने के लिए प्रयोग कर रहे हैं. यह जानकारी निर्धारण कैसे रोगजनक जीनों की अभिव्यक्ति सामान्य चयापचय बदल, सेलुलर neurodegenerative रोगों अंतर्निहित तंत्र को समझने के आगे के लिए एक नई विंडो खोलने के लिए महत्वपूर्ण होगा.

नए उभरते omic प्रौद्योगिकियों विस्तार पहले से हासिल नहीं की एक स्तर पर neurodegenerative रोगों का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा अवसर प्रदान करते हैं. शायद सबसे बड़ा करने के लिए इन उच्च throughput अध्ययन में बाधा को दूर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नमूने कि अत्यधिक संवेदनशील तरीके के साथ विश्लेषण किया जा सकता है के वफादार संग्रह है. प्रक्रियाओं को यहाँ पेश इस निरंतरता को प्राप्त करने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं, और परिणाम है कि आसानी से डेटासेट भर में तुलना की जा सकती है के लिए नेतृत्व करेंगे. हालांकि हमारे प्राथमिक अनुसंधान के हितों जीन व्यक्त की जांच परिवर्तन शामिलआयन और मेटाबोलाइट्स, उत्पन्न मक्खियों भी प्रोटिओमिक या epigenomic विश्लेषण किया जा सकता है. प्रोटिओमिक और epigenomic neurodegeneration के दौरान होने वाली परिवर्तन भी रोग की प्रक्रिया में सर्वोपरि महत्व के होने की संभावना है. जब वैज्ञानिक समुदाय अंततः आणविक रोग की प्रक्रिया को प्रभावित परिवर्तन का पूरा स्पेक्ट्रम की पहचान, रोग के एक सच्चे सिस्टम स्तर समझ संभव हो जाएगा. इस स्तर पर, रोग संशोधित उपचार अंत में एक वास्तविकता के रूप में उभरेगा.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

हम जेनिस सैंटियागो, गेब्रियल Figueroa, और उड़ शेयरों के लिए तकनीकी सहायता और ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला इंडियाना विश्वविद्यालय में स्टॉक केंद्र के लिए जोस हेरेरा आभारी हैं. DH और CW NSF-IOS-1051890 से धन के द्वारा समर्थित थे. PF एफ और LMM फ्लोरिडा के विश्वविद्यालय से एक अवसर बीज कोष द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jazz mix Drosophila food Fisher Scientific AS-153
Cryogenic Vials Corning, Inc. 430658
Microtubes Axygen MCT-175-C-S
RNaseZap Ambion AM9786 Treat all surfaces
5/32" grinding balls, stainless steel OPS Diagnostics GSS 156-5000-01
TRIzol Ambion 15596018
1-bromo-3-chloropropane Sigma B9673-200ML
Isopropanol Fisher Scientific A416-500
DEPC-treated water Fisher Scientific BP561-1
DNase I Promega M6101
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification kit Invitrogen 610-06
Conical Screw Cap Tubes Fisher Scientific 02-681-344
Screw Caps w/O-Rings Fisher Scientific 02-681-364
2.0 mm Zirconia beads BioSpec Products 11079124zx
Methanol, HPLC-grade Fisher Scientific A4524
Chloroform, HPLC-grade Acros organics AC39076
Drosophila Stocks
da-Gal4 Bloomington Stock Center 5460
Gal80[ts] Bloomington Stock Center 7108
UAS-MJD-27Q Bloomington Stock Center 8149
UAS-MJD-78Q Bloomington Stock Center 8150
UAS-LacZ Bloomington Stock Center 8529
Equipment
Inject+Matic Sleeper INJECT+MATIC
Microsieve Set Fisher Scientific 3410531 Use two largest meshes
Geno/Grinder 2000 SPEX Sample Prep SP2100-115
Sorvall Legend Microcentrifuge ThermoScientific 75002436
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System LabConco 7670041
BioAnalyzer v. 2.6 Agilent 2100
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 123-21D
NanoDrop spectrophotometer ThermoScientific
Fast Prep bead-beater ThermoScientific FP120
Centrivap Vacufuge Plus Labconco 022820001

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References

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