Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rensing av vitnemål og metabolitter fra Published: March 15, 2013 doi: 10.3791/50245
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 2, 3, 1,4, 1,4
1Department of Neurology, McKnight Brain Institute, University of Florida, 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida, 3Genetics Institute, Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida, 4McKnight Brain Institute, Department of Neuroscience, Genetics Institute, Center for Translational Research on Neurodegenerative Diseases, and Center for Movement Disorders and Neurorestoration, University of Florida

Summary

Vi beskriver her prosedyrene for utvinning og rensing av mRNA og metabolitter fra

Abstract

For det siste tiåret, har vi forsøkt å forstå de molekylære og cellulære mekanismene neuronal degenerasjon ved hjelp Drosophila som modell organisme. Selv fruktfluer gi åpenbare eksperimentelle fordeler, har forskning på nevrodegenerative sykdommer meste avhengig av tradisjonelle teknikker, inkludert genetisk interaksjon, histologi, immunfluorescens, og protein biokjemi. Disse teknikkene er effektive for mekanistisk, hypotese-drevet studier, som fører til en detaljert forståelse av rollen enkle gener i veldefinerte biologiske problemer. Imidlertid, nevrodegenerative sykdommer er svært komplekst og påvirke flere cellulære organeller og prosesser over tid. Bruk av nye teknologier og omics alder gir en unik mulighet til å forstå de globale mobilnettet forstyrrelsene underliggende komplekse sykdommer. Fleksibel modell organismer som Drosophila er ideelle for å tilpasse disse nye teknologiene på grunn av sin sterke Annotasjon og høy tractability. En utfordring med disse små dyrene, skjønt, er rensing av nok informative molekyler (DNA, mRNA, protein, metabolitter) fra svært relevante vev som fly hjerner. Andre utfordringer består av samle et stort antall fluer for eksperimentell replikater (kritisk for statistisk robusthet) og utvikle konsistente prosedyrer for rensing av høy kvalitet biologisk materiale. Her beskriver vi prosedyrer for innsamling tusenvis av fly hoder og utvinning av utskrifter og metabolitter til å forstå hvordan globale endringer i genekspresjon og metabolisme bidrar til neurodegenerative sykdommer. Disse prosedyrene er lett skalerbar og kan brukes til studiet av proteomikk og epigenomic bidrag til sykdom.

Introduction

I det forrige århundre, har Drosophila vist seg å være et uvurderlig laboratorium verktøy for å undersøke dypere biologiske spørsmål, spesielt i utvikling, cellebiologi, genetikk og en nevrobiologi. Årsakene til denne suksessen er at fruktfluer er lett å manipulere, har en stadig voksende 18 verktøykasse, 21, 31, og har en relativt enkel genom med høy kvalitet merknad 26. Disse tekniske fordeler, kombinert med oppfinnsomhet og innovasjon innenfor fly samfunnet, har ført til brede vitenskapelige bidrag, som illustrert ved tildeling av tre Nobelpriser (1933, 1995, 2011). Mer nylig har Drosophila dukket opp som en relevant modell for å studere menneskelige sykdommer, først og fremst utviklingsforstyrrelser, medfødt immunitet, kreft og to neurodegenerering. Vi er spesielt interessert i å avdekke den cellulære og molekylære basis av nevrodegenerative sykdommer. Disse kompleks og mangfoldig conditions er knyttet til sammenstillinger, muligens oppløselige oligomerer, av unormalt brettede proteiner og er derfor lett modellert i fluer. Alle de store nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, flere ataxias, tauopathies, prionsykdommer, og andre sjeldne lidelser, er modellert i fluer i de siste femten år 23. Fly laboratorier har bidratt til å forstå disse sykdommene hovedsakelig ved å utnytte dyktighet av Drosophila genetikk å identifisere nye gener involvert i nevrotoksisitet av de sykdomsfremkallende proteiner. Når nye gener som er relevante for den nevrotoksiske kaskade identifiseres, blir effekten vanligvis analysert av tradisjonelle tilnærminger, inkludert histologi å fastslå mønstre av degenerasjon, immunofluorescence å bestemme protein distribusjon og mobilnettet patologi, og biokjemiske analyser for å vurdere mengde og type unormale protein conformations . Til slutt, atferdioral analyse fungerer som en funksjonell avlesning av sykdom utfall. Disse veletablerte teknikker er blitt utnyttet for å undersøke bidraget av en eller noen få kandidatgener til sykdommen prosessen, inkludert oksidativt stress og mitokondrielle 13 dysfunksjon, transkripsjonelle dysregulering 9, 27, 30, aberrant aksonal transport og synaptisk aktivitet 14, unormal RNA biologi 9, hindret feilregulert celle 29 signalering, ER dyshomeostasis 6, cellular proteostasis 33, og mange andre 23. Det er imidlertid ikke klart hvordan disse toksiske proteiner kan forstyrre samtidig med flere sammenhengende trasé, er hva temporale Rekkefølgen av disse endringer, og hva som er den relative bidraget til hver vei til patogenesen. Tiår med forskning fokusert på enkelt gen, har hypotesen-drevet tilnærminger i både mennesker og dyremodeller ført til en ufullstendig, forvirrende bilde av de cellulære mekanismene som forårsakerneurodegeneration. Gjeldende dårlig forståelse av de eksakte mekanismene som disse giftige protein forsamlinger forårsake nevropatologi er en viktig begrensning for utviklingen av sykdomsmodifiserende behandling.

Vi er nå interessert i anvendelsen av nye tilnærminger til å forstå hvordan disse sykdomsfremkallende proteiner indusere globale mobilnettet forstyrrelser. Advent av omics æra gjør den dype sondering av komplekse biologiske problemer ved hjelp av avanserte high-throughput teknologi, som kan føre til effektive sykdom behandlinger i nær fremtid. Genuttrykk (transcriptomics) studier ble etablert etter ferdigstillelse av flere genomsekvenser siden høy kvalitet merknad kan forutsi de fleste transkripsjoner. Den nye søknaden av neste generasjons sekvensering til karakterutskriften analyse (RNA-seq) har gitt nye fordeler og muligheter i forhold til mikromatriser, inkludert en upartisk tilnærming, forbedret kvantitative rekkevidde, og reduserte kostnader 32.Vi ønsker å utnytte fordelene av RNA-seq å bedre forstå den vanligste formen for dominant arvelig ataksi, spinocerebellar ataksi type 3 (SCA3) eller Machado-Joseph sykdom. SCA3 er en monogen, dominant sykdom med full penetrans, forårsaket av en CAG trinucleotide ekspansjon i Ataxin3 genet (ATXN3) 16. Denne mutasjonen fører til produksjon av Atxn3 protein med en lang polyglutamine (polyQ) spor som gjør den utsatt for aggregat. Siden mutant Atxn3 er nevrotoksisk agent i SCA3 ansvarlig for alle sykdomsrelaterte forstyrrelser, er dette en ideell sykdom for å bruke disse nye omic tilnærminger. I tillegg var SCA3 en av de tidligste nevrodegenerative sykdommer modellert i fluer 34.

Mens du setter på plass prosedyrer for å samle inn store mengder fly hoder for RNA-seq, innså vi at vi kunne bruke det samme materialet for å utføre globale studier av andre informative molekyler. Blant andre fremvoksende disciplinjer, proteomikk, epigenomics og metabolomics tillate undersøkelse av mobilnettet patologi ved en dybde som ikke tidligere oppnådd, men ikke uten utfordringer. I motsetning til mRNA, er katalogen av proteiner og metabolitter ganske ufullstendig på dette tidspunktet på grunn av økt vanskelighetsgrad i å forutsi alle mulige skjøting varianter og enda mer gåtefulle opprinnelse av alle normale og sykdomsfremkallende metabolitter. Stor satsing er for tiden i gang med å katalogisere proteiner i mange organismer og i sykdomstilstander. For dette, ønsket vi å fokusere på bidrag av endrede metabolitter til SCA3 patogenesen ved hjelp av en enkel organisme, for eksempel Drosophila. Dette er et relativt nytt og lovende feltet, spesielt med den nylige introduksjon av nukleær magnetisk resonans (NMR), som gir høy reproduserbarhet og ikke ødelegger prøvene 5, 24. Vi foreslår at metabolitt profilering kan bidra til å identifisere biomarkører og sykdomsmekanismer innblandet i neurodegeneratipå.

Et viktig hensyn med disse omic prosjektene er at de krever store, ensartede prøver (200 fly hoder) samt presise rensing teknikker for å minimere eksperimentell variasjon. Vi begynte å samle fluer i henhold til prosedyrene vi hadde brukt tidligere for microarrays og også brukt nylig for RNA-seq 12. Men vi snart oppdaget en rekke problemer knyttet til misexpressing de SCA3 konstruksjoner. Først måtte vi velge en Gal4 driver for disse eksperimentene 4, der målet vev for analyse var hjernen. Det opplagte valget ville være en pan-neural driver siden SCA3 er en hjernesykdom. Men siden vi har tenkt å samle mRNA og metabolitter fra hele hodet, ville dette alternativet produsere blandet materiale fra vev uttrykke og ikke-uttrykker konstruksjoner. For å generere homogene prøver der alle cellene uttrykker de konstruerer, besluttet vi å bruke en svak, men allestedsnærværende driver linje, daughterless (da)-Gal4. Interestingly, mange av gener involvert i nevrodegenerative sykdommer, inkludert ATXN3 20, har en bred fordeling, noe som gjør valget av allestedsnærværende uttrykk hensiktsmessig. Deretter møtte vi et annet problem: allestedsnærværende uttrykk for patogene Atxn3-78Q forårsaket dødelighet under utvikling. Å omgå denne dødelighet, innlemmet vi Gal80 ts å kontrollere timelige aktivering av Gal4 19. Dette tillot oss å samle de eksperimentelle fluer, alder dem i opptil 20 dager, fryse dem, og behandle sine lyofiliserte hoder for enten RNA (TRIzol) eller metabolitten (metanol-kloroform) ekstraksjon (figur 1). Vi har allerede brukt denne protokollen for å oppnå prøver for transcriptomic og metabolomic analyser, men det er andre åpenbare bruksområder for denne teknikken (f.eks proteomikk eller nevro-peptidomic analyser).

Eksperimentell oversikt: Det overordnede målet med disse protokollene er å støtte innsamling av consistent prøver av fly hoder for utvinning av vitnemål og metabolitter. Den spesifikke målet med disse prosedyrene er å få fluer uttrykker Atxn3-27Q og Atxn3-78Q (non-patogene og sykdomsfremkallende eksperimentelle konstruksjoner) samt lacZ (kontroll konstruere), hvor en enkelt prøve består av 200 fly hoder. Selv dagens teknologi tillater analyse av svært små prøver, inkludert enkeltceller 28, samles vi 200 hoder å eliminere eksperimentell, biologiske og tekniske variasjon, og dermed tillater oss å identifisere de celleforandringer assosiert med sykdommen prosessen med høy statistisk sikkerhet. Denne tilnærmingen er designet for å oppdage bare de endringer i genuttrykk som er konsistent i befolkningen, regi oss mot de mest kritiske stier kjøring degenerasjon. Siden vi er interessert i aldersavhengige endringer i hodene på disse fluene, ble hver genotype oppnådd på 1, 10 og 20 dager gammel.

En grunnleggende del av disseglobale analyser er produksjonen av biologiske replikater som støtter en robust statistisk analyse. Vår tidligere erfaring med mikromatriser og RNA-seq tyder på at analyse av biologiske prøver i tre eksemplarer gi sterk statistisk signifikans av de 11 data, 12. Vi beskriver i punkt 1) hvordan å generere en enkelt biologisk replikere (Rep 1) for hver genotype og tidspunkt. Disse prosedyrene kan gjentas for å generere Reps 2 og 3, eller gjort i parallell, så lenge hver Rep er riktig identifisert. Selv om tre representanter er målet, og setter en fjerde (eller femte selv) Rep er sterkt anbefalt å dekke problemstillinger knyttet til lav avkastning, tap av fluer under aldring, eller utilsiktet tap av materiale (fluer, hoder, eller RNA) i ett eller flere prøver.

Vi fant at ti kors (flasker identifisert av bokstaver AJ) produsert nok avkom til å få 200 hoder / genotype / tidspunkt. Ekstrem forsiktighet må brukes for å unngå forvirring, siden et stort antall flaskerre nødvendig for å få en Rep (10 flasker x 3 genotyper x 3 tidspunkter = 90 flasker). For dette, utpekt vi hver flaske med genotype, tidspunkt og flaske brev. For eksempel refererer SCA3-27Q 20E til den femte flasken (av ti) av fluer uttrykker Atxn3-27Q eldet i 20 dager. Når avkommet Eclose er fluene opprettholdt i separate hetteglass merket med en unik identifikator.

Vi opprettholdt antallet fluer oppnådd for hver prøve, flaske, og returpunkt (morgen og kveld) i et Excel-regneark. Vi revidert antall fluer pr ampulle før frysing for å ta hensyn til dødelighet og escapees. Fra disse siste teller, kan ampuller legge 200 fluer være lett plassert før du åpner fryseren, og dermed bidra til bevaring av prøvene. Siden fluer samlet inn fra en flaske kan bare brukes på én Rep, maksimert vi deres bidrag per biologisk replikere, selv om alle representanter inneholdt fluer fra flere flasker. Vi har reservertfluene fra flasker som ikke brukes i deres planlagte Rep for andre representanter, som erstatning prøver, eller for andre relaterte eksperimenter (western blot, qPCR).

Protocol

1. Generere en Repliker og Fryse Fluenes (OBS, flytende nitrogen)

Mål: Samle minst 200 kvinner per genotype / tidspunkt, og flash-fryse.

  1. Genotyper: Gal80 ts; da-Gal4, stamme for allestedsnærværende uttrykk for Gal4 under kontroll av daughterless regulatoriske område og temperatur-sensitive Gal80. Som styreledning vi brukt UAS-LacZ, som tidligere har blitt vist å indusere noen skadelige virkninger. UAS-Atxn3-27Q og UAS-Atxn3-78Q, ikke-sykdomsfremkallende og patogene eksperimentelle konstruksjoner, henholdsvis. (Y, hs-Hid konstruksjon har vært brukt før for en mer effektiv innsamling av jomfruelige hunner, men vi bestemte seg mot det på grunn av den ekstra tiden som trengs for å innføre Y, hs-Hid med Gal80 ts; da-Gal4 på kromosomer II og III.)
  2. Utvid alle aksjer ved å kombinere 10 kvinner og 5 menn i flaskens for å hindre overbefolkning. Alle forsøk ble gjennomført i Jazz Mix fly media, som er enkel å tilberede og fremmer rask Drosophila vekst og lav angrep med midd.
  3. Samle 50 Gal80 ts; da-Gal4 menn, og 100 UAS-Atxn3-78Q jomfruer (bare én UAS linjen vil bli brukt som et eksempel) for hvert tidspunkt.
  4. Gjøre ti kors per genotype / tidspunkt. Anesthetize de menn og kvinner på karbondioksid (CO 2) sovende / pad. Sted ti jomfru UAS-Atxn3-78Q fluer (ikke eldre enn fem dager) og fem mannlige Gal80 ts; da-Gal4 i hver stor flaske tilsatt gjær lim (utvannet tørrgjær). Merke flaskene med genotyper, tidspunkter, og flaske identifikatorer (bokstaver AJ), og plassere dem ved 25 ° C.
  5. Etter 2 dager, fjerner de voksne fra flaskene, legge til et dryss av tørrgjær og en skvett vann for å oppmuntre optimal larve vekst, og plassere flaskene ved 18 ° C (Gal80 aktiv,Gal4 undertrykt). Ikke kopier kors, da dette kan innføre eksperimentell variasjon i avkom avledet fra befruktet versus jomfruelige kvinner. Også representerer avkom fra hver flaske uavhengig biologiske replikater (hver flaske gir unike avkom), men overførte kors (kopier) ville være teknisk replikater (ekstra avkom med samme genetiske konstitusjon).
  6. Når avkommet ecloses ved 18 ° C, bedøve på CO 2 sovende / pad, samle jomfruer av de ønskede genotyper, og plassere dem i små ampuller med (11:58 fluer per hetteglass). Etiketten hetteglass med flasken identifikator. Ikke bassenget flyr fra forskjellige flasker. Plasser hetteglassene tilbake ved 18 ° C i 24 timer. For å maksimere avkom, fortsette å samle på påfølgende morgen og kveld.
  7. Når hvert hetteglass fullfører 24 timer ved 18 ° C, skifte dem til 29 ° C (Gal80 inaktiv, Gal4 aktiv). Dette er 0 dag, startpunktet av eksperimentet, når than transgener starte sitt uttrykk.
  8. Overfør fluene til å rense hetteglass hver 2 dager før de når dagene 10 og 20.
  9. Når fluene kommer til ønsket alder (1, 10, 20 dager), telle og overføre dem fra maten hetteglassene i forhåndsmontert merkede kryorør hjelp av en liten trakt. Ikke anesthetize fluene. Invertere hetteglassene på benken.
  10. Vent 30 min å la fluene å komme seg fra overføringen (stress), og deretter flash-fryse hetteglassene ved nedsenkning i flytende nitrogen og oppbevar i en pre-merket, pre-kjølt fryser boksen. Husk: Frys fluene i samme rekkefølge de ble overført til cryovial, slik at tid brukt på cryovial lik i prøvene.

2. Innsamling og Lyofilisering av fly Heads (Utfør i kaldt rom, Pre-chill alt utstyr, FORSIKTIG, flytende nitrogen og tørris)

Mål: Rask separasjon, innsamling, og frysetørking av vev.

  1. AssemBLE sikten (største mesh i øvre kammer for å samle organer, andre største i nedre kammer for å samle hoder, lokket på bunnen for å samle smådeler) og pre-chill ved -80 ° C i minst 30 min.
  2. Samle 200 fluer fra kryorør ved å maksimere bidraget av fluer stammer fra samme flaske. For å kompensere for forskjeller mellom fluer samlet i morgen eller kveld, sørge for at hver prøve bruker et identisk morgen / kveld ratio (vi brukte 47% morgen / 53% kveld). Merk: de resulterende RNA fra to 100-head prøver kan kombineres senere å generere tilsvarende 200 fluer i en enkelt replikere.
  3. Chill en stykke Parafilm (~ 9 x 14 cm) på tørris i 5 min.
  4. Tømme kryorør med de komplette fluer bort på parafilm, noen få om gangen, teller flyr med pensel, og oppbevar i en annen cryovial på tørris til å nå 100 fluer.
  5. Dypp silen i flytende nitrogen, legge de 100 fluer til den øvre Chambeh. Rist silen kraftig i 1 min. Dyppe den i flytende nitrogen igjen, og rist i 1 min.
  6. Åpne silen, samle hoder fra det nedre kammer i en mikrorør, og sted ved -80 ° C.
  7. Åpne mikrorør, pakk toppene i parafilm, og gjøre små hull.
  8. Plasser prøvene i lyophilizer for minimum 2 dager.

3. Total RNA Utvinning og mRNA Rensing (Unn alle overflater med RNaseZap, endring Hansker Ofte)

Mål: homogenisere vev for å maksimere utbyttet, trekke total RNA, og rense mRNA.

  1. Fjern prøvene fra fryse-tørketrommel og legge til tre små, sterile, stål sliping baller til hver mikrorør. Plass i Geno / Grinder, kjøre på 1500 slag / min i 1 min.
  2. Åpne rør, tilsett 1 ml TRIzol, og forsegle rørene med parafilm. Grind 1 min; pek rørene opp-ned for å løsne de stålkuler hvis nødvendig. Grind 1 min.
  3. Ikkesentrifuger røret på dette tidspunkt (røret vil være sprø). Blandingen (bortsett stålkuler) i en ny RNase-fri mikrorør. Pelletere cellulært avfall i en tabletop mikrosentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter ved 12.000 x g..
  4. Overfør supernatanten til et nytt mikrorør. Legg 0,1 volumer 1-brom-3-klorpropan (BCP); riste kraftig i 15 sek. Inkuber ved romtemperatur i 3 min. Spinne i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 15 min ved 12.000 x g Merk: mange RNA ekstraksjonsmetoder bruker kloroform på dette stadiet, BCP skal maksimere RNA utbytte ved å øke effektiviteten av faseseparasjon.. Holde prøvene ved 4 o C under sentrifugeringstrinnet vil også øke effektiviteten av faseatskillelse og redusere forurensning av protein og genomisk DNA inn den vandige fase.
  5. Overfør den øverste vandige lag i et nytt mikrorør. Utfelle RNA ved å legge 0,5 volumer iskald isopropanol; invertsukker seks ganger til mix. Inkuber ved romtemperatur i 10 min. Spinne i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter ved 12.000 x g.

Merk: I tillegg til å utvinne RNA, kan proteiner også trekkes ut fra det organiske laget og interfase av TRIzol, slik at begge proteomikk og transcriptomics analyser kan utføres på de samme prøvene. Selv om vi ikke utføre dette trinnet i våre analyser, gir TRIzol utvinning utmerket representasjon av løselige proteiner og større representasjon av membran og kjernefysiske proteiner enn de fleste buffer / vaskemiddel extractions. Lee og Lo 17 beskriver en prosedyre for å trekke proteiner med TRIzol hensiktsmessig for proteomics analyser, inkludert 2-D gel og LC-MS/MS.

  1. Supernatanten fjernes. Vask RNA ved å tilsette 1 ml iskald 70% etanol (bruk DEPC-behandlet vann), og bland med en kort vortex. Spinne i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 5 min ved 12000 x g..
  2. Supernatanten fjernes. Lufttørke pellet for ent minimum 15 min. Tilsett 80 pl av DEPC-vann til RNA pelleten og plassere den ved 55 ° C i 10 min. Forlate ved 4 ° C over natten.
  3. Bestem RNA konsentrasjonen ved hjelp av NanoDrop spektrofotometer. Forholdet mellom absorbans ved 260 nm/280 nm skal være mellom 1,8 og 2,1, med 2,1 være optimal.
  4. Ta 30 mikrog bulk RNA, tilsett 4 U DNase I, 60 U RNasin, 10 pl 10x reaksjonsbuffer og DEPC-behandlet vann for å bringe det totale volum opp til 100 ul. Inkuber ved 37 ° C i 20 min.
  5. Rense RNA ved hjelp av RNeasy Mini kit. Følg produsentens instruksjoner, bortsett utføre alle sentrifugering i 30 sek og inkludere alle "valgfrie" trinn.
  6. Bestem RNA konsentrasjonen ved hjelp av NanoDrop, og vurdere RNA kvalitet ved hjelp av "total RNA pico" analysen på en Bioanalyzer.
  7. For mRNA rensing, overføre 30 ul Dynabeads til en RNase-fri mikrosentrifuge tube.
  8. Plasser røret på en magnet for 1-2 min og fjerne supernatant. Resuspender perlene i15 ul bindingsbuffer. Gjenta.
  9. Fra og med 5 ug total RNA, justere volumet til 15 ul hjelp DEPC-vann. Varme ved 65 ° C i 2 min, og sted på is.
  10. Tilsett 15 pl av totalt RNA til 15 pl pre-vasket perler. Blandes grundig ved pipettering hver 5 min i 30 min for å anneal RNA til perlene. Sted på magneten i 1-2 min og fjerne alle av supernatanten.
  11. Legg 35 pl vaskebuffer B. Mix ved forsiktig pipettering. Plasser på magneten og fjern forsiktig supernatanten. Gjenta vask to ganger.
  12. Eluer mRNA ved tilsetning 15 pl kald 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og oppvarming til 80 ° C i 2 min. Plasser øyeblikkelig røret på magneten, overfører supernatanten til en RNase-fri rør, og fryse ved -80 ° C. Kvantifisere som i 3.8). Yield bør ~ 1-5% av total RNA.

For metabolomic analyser, utføre protokoller 1 og 2), og fortsette med 4) nedenfor:

4. Metanol-kloroform ExtraDette skjer av metabolitter

Mål: Separate polare og ikke-polare metabolitter.

  1. Legg antioksidant butylert hydroksytoluen (BHT) til kloroform ved en konsentrasjon på 0,1 mg / ml for å hindre auto-oksidasjon av lipider under ekstrahering. Bruk denne BHT-kloroform for alle påfølgende trinn.
  2. Overfør 200 hoder i en nedkjølt, pre-veid koniske skrukork polypropylenrør, fryser ved -80 ° C, og lyophilize. Bestem tørrvekt.
  3. Put 5-7 zirconia perler i rørene og homogenisere i en perle-visp for to sykluser med 20 sek hver på 800 Hz.
  4. Basert på den tørre vekten av det tyngste prøven, tilsett vann, metanol, og kloroform i følgende forhold: 11,74 x metanol; 10,59 x vann; 11,74 x kloroform, der x er vekten av det tyngste prøven i gram, og produktet er volum i ml. Legg all metanol som beregnet og 45% av den totale vann til perlen beater røret som inneholder lyofiliserte hoder.
  5. Homogenize i perle-beater for to sykluser på 20 sek hver.
  6. Kombiner volumene av kloroform (100%), og resten av vannet (55%) i en konisk hetteglass på is. Deretter overfører vevet blanding (med perler) til hetteglass. Rist i 10 min. Inkuber i 10 min på isen.
  7. Spinne i en sentrifuge ved 4 ° C i 5 min ved 2000 x g.. Fjern den polare (øvre) fase med en Pasteur pipette (unngå plast) og plasser i en annen mikrosentrifugerør.
  8. Lagre ikke-polart (lavere) fase i et lite glass hetteglass og fryse ved -80 ° C. Tørrhet under en strøm av nitrogengass, være sikker på at slangen går fra nitrogentank er høyrent Tygon å unngå mykgjørere i ekstraktet.
  9. Rehydrere ikke-polar fase med 620 pl deuterert kloroform. Overfør 600 pl i merkede NMR rør. Oppbevares i en eksplosjon-bevis -80 ° C fryser.
  10. Plasser polar fase i Centrivap og kjøre inntil røret er helt tørr ved 30 ° C (~ 7 t).
  11. Rehydrate polar fase med 620 pl 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,3) i deuteriumoksyd med 1 mM TMSP [3 - (trimetylsilyl) propionsyre-2 ,2,3,3-d4 syre] som en indre standard. Vortex i 30 sek. Spinne i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 5 minutter ved 10.000 rpm for å utfelle pigmenter og andre store molekyler, som ville forstyrre den NMR-spektra. Overfør 600 ul av supernatanten til merket NMR rør.

Representative Results

Å omgå dødelighet forårsaket av allestedsnærværende uttrykk for utvidet Atxn3 under kontroll av da-Gal4 introduserte vi temporal regulering av Gal4 med Gal80 ts. Men før du fortsetter med innsamling og frysing av et stort antall fluer, ønsket vi å studere uttrykket dynamikken i transgenet vår under kontroll av Gal80 ts og da-Gal4. For å gjøre dette, genererte vi korsene, forlot avkommet ved 18 ° C, samlet de voksne fluene, og opprettholdt dem i 24 timer ved 18 ° C. Deretter satte vi fluene på restriktive temperatur (29 ° C) og inkubert dem for 0, 6, 12, 24, 36, 48, og 72 timer. Neste, vi har oppdaget opphopning av den utvidede polyQ allele av vestlig blot fra enkle fluer etter publisert protokoller 10. Uttrykk ble først oppdaget, men svak 6 timer etter temperatur skift og fortsatte å øke fram til 48 hr, da den nådde metningsnivåer (figur 2A). Interestingly opptrådte en høymolekylær band av uløselig polyQ etter 48 hr, signaliserer den tiden det tar for proteinet for å danne store aggregater. Vi også dissekert flua hjerner ved hvert tidspunkt for å bestemme fordelingen av den utvidede polyQ allel ved immunfluorescens (figur 2B). Proteinet ble først oppdaget 24 timer etter den temperatur skift, selv om med ujevn fordeling. Mellom 24 og 48 hr nivåene av protein fortsatte å stige, noe som gjør flere hjerne sentre tydelig, inkludert antennal lobes og sjampinjong kroppen anslag (figur 2B). Mellom 48 og 72 timer uttrykk for den utvidede polyQ allelet nådd maksimal nivåer, noe som tyder på at Gal4 systemet var fullt aktivert på dette tidspunktet. Basert på disse resultatene, valgte vi 24 timer etter den temperatur skift som første tidspunkt (Dag 1) for påfølgende eksperimenter. Samlinger av fluer 10 og 20 dager gamle ble også målt fra temperaturen skift (timeg 0), som er den tid da forsøket starter med nytt uttrykk for de patogene og kontroll transgener.

Når vi bekreftet at Atxn3 ble detektert etter 24 timer under kontroll av Gal80 ts og da-Gal4 på 29 ° C, vi lurte hvorvidt disse fluene ville vise tegn neurodegenerering over 20 dager. Siden disse fluene begynner å uttrykke de sykdomsfremkallende proteiner som voksne, fryktet vi at de kanskje trenger en lang inkubasjonstid å vise nevrodegenerative fenotyper. Å fastslå giftighet av Atxn3-78Q i disse forholdene, samlet vi flyr uttrykker LacZ, Atxn3-27Q, og Atxn3-78Q, og spilt inn sin levetid. Mens fluer uttrykker LacZ og Atxn3-27Q vises over 90% levedyktighet etter 20 dager, flyr uttrykke Atxn3-78Q viste lav overlevelse på dag 20 (30%) (figur 3). Faktisk Atxn3-78Q fluer begynte å dø etter dag 10 (7% dødelighet) og etter dag 15 tapet var betydelig (20%), noe som akselererte i de siste fem days. Dermed indikerte disse resultatene at voksen ekspresjon av et patogen genet førte forkortet levetid, en nøkkel tegn på nevrodegenerative fenotyper indusert av Atxn3-78Q.

En av de mest kritiske aspekter av denne protokollen var håndteringen og bevaring av prøver etter frysing for å sikre kvaliteten på materialet ekstrahert. Vi hentet mellom 15-80 mikrogram total RNA per 200 hoder (avhengig av alder og genotype) før DNase behandling i henhold til NanoDrop. Omtrent en tredjedel (6-25 ug) ble utvunnet som meget rent RNA etter DNase behandling ved forholdet absorbans ved 260 nm/280 nm. Men vi fant ut at den beste måten å avgjøre kvaliteten på RNA for utarbeidelse av cDNA biblioteker for RNA-seq var å analysere total RNA på Bioanalyzer. Heldigvis, ble bare en liten mengde av RNA (5 ng) som brukes på Bioanalyzer, så det ikke påvirke evnen til å produsere flere biblioteker per sample. Som et eksempel, kjørte vi to prøver av totaltRNA før DNase behandling på en Bioanalyzer chip, mistenkt en av dem for å være degradert (Figur 4A-C). Den høye kvaliteten RNA (prøve 1) produsert tre skarpe RNA band, to like under 2000 nukleotider (nt) i størrelse og en mindre bånd under 200 nt, som representerer ribosomale RNA (figur 4A). De to båndene rundt 2.000 nt tilsvarer 18S rRNA (mindre topp) og to fragmenter fra 28S rRNA (større peak), som er et unikt aspekt av rRNA biologi i Drosophila (se figur 4B). Disse egenskapene ble også observert i de Bioanalyzer spor (figur 4B). Derimot syntes en degradert RNA prøve (prøve 2) ikke produsere skarpe topper av det ribosomale RNA, og akkumulert flere band under 500 nt (Figur 4A). Denne størrelsen fordeling ble lett skjelner mellom Bioanalyzer spor (figur 4C), hvor brede topper med kortere størrelse ble registrert. Også viktig å merke wsom forskjellen i enheter i y-aksen mellom de to RNA prøver, som viste at det degraderte prøve hadde mindre RNA. Bare RNA viser maksimal kvalitet (NanoDrop forholdet absorbans ved 260 nm/280 nm mellom 1,8 og 2,1, med 2,1 være optimalt, se protokoll trinn 3,8) vil bli brukt for generering av biblioteker.

For utvinning av metabolitter, fulgte man en klassisk vann / metanol / kloroform (2.0:2.0:1.8) ekstraksjonsmetode 3 delt inn i to trinn for å maksimere utvinningen av både polare og ikke-polare metabolitter 35. Etter separering de polare og ikke-polare faser, rekonstituert vi dem i deuterert vann eller deutererte kloroform, henholdsvis, og lagt interne standarder for analyse ved NMR. NMR-spektra oppnådd ved denne ekstraksjonen metoden var godt løst med flate grunnlinjen og smale linjer (figur 5), noe som indikerer den rensing av høy kvalitet ekstrakter, egnet for både metabolsk profilering end identifisering av et stort antall av metabolitter. Figur 5 viser identifisering av noen fremtredende topper tilsvarende svært rikelig metabolitter, slik som glukose og sukrose, og to sentrale metabolske syrer, laktat og acetat, i henhold til kjemiske skift i litteraturen 7. Den kjemiske skift (i parts per million) representerer elektromagnetisk skjerming av et molekyl i forhold til en standard molekyl (TMS, første topp fra høyre). Flere shieldedmolecules har høyere elektrontetthet rundt kjernen og vil vises til høyre av spekteret, inkludert alkyler. Deshielded molekyler som amid og aromatiske hydrogener vises til venstre av spekteret. Den travle midterste delen (3-4 ppm) er beriket for sukkermolekyler.

Figur 1

Figur 2
Figur 2. Expression kinetikk (A) Western blot viser Atxn3-78Q uttrykk (Gal80 ts; da-Gal4 / UAS-Atxn3-78Q). På fluer inkubert ved 29 ° C 0-72 timer. En svak bandet er først oppdaget ved 6 timer og metning er nådd ved 48 hr etter induksjon. (B) Immunofluorescence av hele hjernen i de samme fluer. Hjernene ble dissekert, løst, end farget med et antistoff som gjenkjenner den utvidede polyQ protein. Proteinet er først oppdaget i soppen kroppen (MB) anslag og antennal lapper (AL). Mellom 48 og 72 timer, når uttrykket grenseverdier og er svært synlig i hjernen sentre med rikelig innervasjon. Uttrykket nivå pr neuron er svak som sett i den optiske lobe (OL), bortsett fra i noen få store nevroner mellom OL og sentrale hjernen.

Figur 3
Figur 3. Atxn3-78Q reduserer levetiden Flies uttrykke LacZ, Atxn3-27Q, og Atxn3-78Q overalt i voksne stadier (Gal80 ts; da-Gal4). Ble overvåket for sin lange levetid på 29 ° C. Fluer uttrykker LacZ (blå) og Atxn3-27Q (grønn) viste lave nivåer av dødelighet etter dag 20. I kontrast, flyr uttrykke Atxn3-78Q (rød) visesen markert dødelighet starter på dag 10. Ved dag 15 viste de en 20% reduksjon i levedyktighet, noe som akselererte i løpet av de neste fem dagene, og nådde en 70% dødelighet ved dag 20.

Figur 4
Figur 4. RNA kvalitetsvurdering. RNA fra høy kvalitet og degradert prøver ble kjørt på en Bioanalyzer chip. (A) Bioanalyzer kjøre med en høykvalitets RNA (prøve 1) og en degradert RNA (prøve 2) ved siden av en størrelse markør (venstre felt). Legg merke til de tre skarpe topper tilsvarende ribosomal RNA i den sentrale kjørefelt. (B) Bioanalyzer tracing for prøven 1, med to karakteristiske sterke topper underkant 2.000 nt og en annen under 200. (C) Bioanalyzer tracing for 2 eksempel, som består av hovedsakelig degradert RNA. Obs forskjellen i enheter på y-aksen mellom panelene B og C.


Figur 5. Representative 1D NMR spektra av polare metabolitter. Representant 1D proton NMR spekter av polare metabolitter fra Drosophila og utfyllende 2D COSY (korrelasjon spektroskopi) og HSQC (heteronukleære enkelt quantum korrelasjon) eksperimenter for peak oppdrag. Metabolitter identifisert i henhold til kjent kjemisk skift-1: Sukrose, 2: Glukose, 3: Beta-alanin, 4: Acetat; 5: Laktat.

Discussion

Bygge på vår tidligere erfaring i 11 transcriptomics, 12, metabolisme 15, og nevrodegenerative sykdommer 6, 8, presenterer vi her en ny protokoll for å samle tusenvis av fly hoder med voksen-konkret uttrykk for sykdomsfremkallende gener, og rensende mRNA og metabolitter for RNA- seq og NMR spektroskopi, henholdsvis. Naturen av disse eksperimentene kreves inkorporering av flere nyvinninger før flua samlingen, inkludert valg av en allestedsnærværende Gal4 linje og bruk av tidsmessig regulering av genekspresjon. Angående Gal4, allestedsnærværende uttrykk for transgener var avgjørende av to grunner. Først, et stort antall gener involvert i nevrodegenerative sykdommer, inkludert ATXN3, huntingtin, amyloid forløper protein og Superoxide dismutase 1, blant andre, er allment uttrykt i neuronal og glial celler samt i andre celletyper utenfor nervesystemet. Vi ønsket åfullstendig modellere dette aspektet av biologien disse patogene gener ved å analysere konsekvensene av allestedsnærværende uttrykk stedet for å fokusere bare på nevrale uttrykk. Sekund, er det ikke mulig å samle fly hjerner i stort antall, men vi kan gjøre det med fly hoder (over 200 i tre eksemplarer per tilstand) 11, 12. Siden homogenisering av hele hodet blander neural og ikke-nervevevet blir allestedsnærværende transgene uttrykk kritisk for å oppnå ensartede RNA og metabolitter fra populasjoner av celler som uttrykker de samme transgener. Det er viktig å merke seg at da-Gal4 ble valgt for sin ganske jevn fordeling, ikke på grunn av sin høye uttrykk nivå, selv om en fersk rapport antydet at da-Gal4 ikke kan være helt allestedsnærværende 25. Vi hadde tidligere vurdert andre allestedsnærværende Gal4 linjer, inkludert arm-, Tub-, og lov-Ga4, men de alle viste komplekse uttrykk mønstre i voksen CNS og muskler, noe som gjør dem mindre endequate for denne studien. Faktisk viste immunfluorescens hos voksne hjerner at da-Gal4 induserer utbredt men svak uttrykket, som akkumuleres bare ved høye nivåer i hjernen sentre består av noen få tusen axoner og i noen få store nevroner (figur 2). Selv om uttrykket nivåer av constructs var lav, disse forholdene dramatisk redusert overlevelse i en polyQ-avhengig måte. Dette uttrykket dynamikk oppfylt våre behov, samtidig uttrykk nivåer lave, noe som var viktig for å observere de langsomme, progressive mobilnettet endringer forårsaket av nevrotoksiske proteiner.

En forutsigbar konsekvens av å indusere allestedsnærværende uttrykk for nevrotoksiske proteiner var at det forårsaket dødelighet før voksen eclosion. Heldigvis, denne komplikasjonen forbikoblet med bruk av Gal80 ts. Som omtalt ovenfor, nådde genekspresjon maksimale nivåer ca 48 timer etter den temperatur skift, som passer godt med den tiden FRAmeg av forsøket. En ytterligere fordel med å bruke Gal80 ts var at, i motsetning til eksperimenter hvor nevrotoksisk proteiner er konstitutivt uttrykte pan-nevralt, var det ingen ekspresjon under utviklingen av nervesystemet. Dermed skapte bruk av Gal80 ts en "ren" bakgrunn der nervesystemet ikke var eksponert for giftige aktiviteter av disse nevrotoksiske proteinene under utviklingsstadier. Etter vårt syn, resulterte aktivering av genuttrykk hos voksne i en bedre modell for denne klassen av voksen-angrep patologi. Men Gal80 ts også innført noen komplikasjoner forbundet med temperaturendringer. En var at voksende fluer ved lave temperaturer (18-20 ° C) forsinket livssyklusen, gjør forsøkene betydelig lengre. Dessuten er det velkjent at voksende fluer ved høye temperaturer (29-31 ° C) akselererer deres metabolisme, som illustrert ved den forkortede levetid sammenlignet fluer alderen ved 25 ° C. Since de transcriptional og metabolske studier vil bli utført i fluer i alderen ved høy temperatur, kan vi forvente å se viktige endringer i cellulære stress-trasé og energiomsetning. Dette er grunnen til at det var så viktig å introdusere to kontroller i forsøket, en med ikke-patogene Atnx3-27Q og en uavhengig kontroll uttrykker LacZ. Disse kontrollene vil gi en baseline for genuttrykk og metabolske forandringer assosiert med høy temperatur, slik at vi kan identifisere disse endringene direkte knyttet til uttrykk for giftige Atxn3. Samlet har vi innført flere endringer i innsamling av fluer som gir en rekke fordeler - og noen ulemper (temperatur problemer og neste avsnitt) - for å studere voksen alder, progressive sykdommer.

Selv om tidsmessig regulering med Gal80 ts var en nyttig tillegg er det også innført en uventet komplikasjon. Mens generere fluene bærer både Gal80 ts ennd da-Gal4 konstruerer i en stabil lager, la vi merke til at flyr dobbelt homozygot for begge konstruerer var levedyktig, men sterilt. Siden homozygot Gal80 ts og da-Gal4 stammene var levedyktig og fruktbar av seg selv, er det ikke klart hvorfor kombinasjonen viste lav fruktbarhet. Det har vært kjent i noen tid at Gal4 er litt giftig for Drosophila vev 22. Det er mulig, da, at det heterologe uttrykket av gjær transkripsjonelle repressor Gal80 bidro til giftigheten av Gal4 ved å gripe, potensielt med endogent transkripsjonelle maskineri. Dette toksisitet kan bli forverret av den allestedsnærværende distribusjon av Gal4 under kontroll av da, et gen som spiller en viktig rolle i tidlig utvikling og seksuell besluttsomhet. Uavhengig av de underliggende årsakene til sterilitet, utvidet vi Gal80 ts; da-Gal4 fluer ved å opprettholde en balanseaksel kromosom enn da-Gal4 samtidig som homozygosity for Gal80 t s, noe som tyder på at Gal4 er en mer kritisk bidragsyter til sterilitet. Denne løsningen var nøkkelen fordi vi brukte hundrevis av disse menn annenhver uke for å krysse med hver av de UAS transgener. Imidlertid krysser bærer en balanseblokk opprettet merarbeid ved valg av den riktige avkom. Bare fjerdedeler (25%) av avkom ble oppsamlet (hunner, ikke-balansesleider), som legges valg tillegg reduserte utbyttet per flaske, og økt antall flasker som trengs for å oppnå minst 200 fluer pr genotype / replikere / tid punktet. Total, selv om innsamling av fluer ble tidkrevende på grunn av de store sett trengs, er vi sikre på at det å studere celleforandringer bare noen timer etter å slå på uttrykket av sykdomsfremkallende gener overalt vil identifisere nye og interessante prosesser involvert i progressive neuronal tap.

Når den genetiske design var på plass, vi betalte spesiell oppmerksomhet tileksperimentelle manipulasjoner som kan introdusere biologiske variasjoner. Først, vi bare samlet jomfruelige kvinner for å sikre homogeniteten av prøvene, selv om dette betydde å kaste bort hanner og sjekke for avkom to ganger om dagen. Under aldring, ble ikke mer enn 12 fluer oppbevares i samme hetteglasset unngå overbefolkning og stress. Også før frysing, ble fluer overført til kryorør uten bedøvelse og fikk lov til å komme seg fra overføringen for 30 min. Disse tilsynelatende trivielle faktorer kan påvirke genuttrykk og metabolisme, innføre variasjon i den endelige analysen som ikke ville være relevant for eksperimentet.

For å sikre kvaliteten på de frosne materialer (hoder, RNA, og metabolitter), betalte vi spesiell oppmerksomhet til hver detalj som kan bidra til vev degradering. Siden fluene er overført til kryorør i små tall (opptil 12 fluer per hetteglass), måtte vi hente mange hetteglass for innsamling av 200 hoder. Disse manipulasjoner var den med ekstrem forsiktighet i et kaldt rom med tørris og flytende nitrogen. Samlingen av fluer, separasjon av hoder, og rensing av informative molekyler er for tidkrevende å oppdage at materialet var degradert på slutten av denne lange prosess. I tillegg til å sikre at materialet beholder sin kvalitet, beskriver denne protokollen flere skritt som maksimerer utbyttet av RNA og metabolitter, inkludert frysetørking og perle juling. Disse trinnene er ikke nødvendig for normal utdrag for RT-PCR eller kvantitativ PCR fra hele fluer, men de er kritiske for konsekvent rensing fra små prøver som fly hoder. Vi fastslått at andre trinn påvirker utbyttet av RNA. For eksempel produserte eldre fluer betydelig færre RNA enn yngre fluer, uavhengig av genotype. Denne observasjon antydet at aldring ved høy temperatur induserer dramatiske endringer. Også trekke RNA fra 100 hoder var faktisk mer effektivt enn fra 200 hoder, så vi gikk for å rense i to batches på 100 per prøve, bare for å kombinere dem etter kontroll av kvalitet med Bioanalyzer. Også, virket kolonner for mRNA rensing å mette lett, slik at mengden av total RNA brukt per kolonne må optimaliseres.

Metabolitter er en god blanding av små molekyler, slik kvalitetskontroll er vanskeligere enn med DNA, RNA eller proteiner. Dessverre er det ingen komplett katalog av metabolitter for enhver dyremodell på denne tiden, noe som kan være i endring i de neste årene takket være bruk av flere teknologiske nyvinninger, blant annet NMR-spektroskopi og utvidet bruk av væskekromatografi - massespektrometri ( LC-MS). Selv om NMR er mindre sensitiv enn MS, viser det mange lovende fordeler, inkludert ingen ødeleggelse av prøver, ingen analytiske prosedyrer som introduserer bias (LC), og høy reproduserbarhet som tillater statistisk sammenligning av representanter og flere eksperimentelle betingelser 24. Således kan prøven væretestes for å verifisere observasjoner eller re-analysert ved LC-MS til å validere NMR data. Her viste vi foreløpige NMR data fra fluer som vi bruker til å lage en katalog av metabolitter i Drosophila. Denne informasjonen vil være avgjørende for å bestemme hvordan uttrykk for patogene gener endrer normal metabolisme, åpner et nytt vindu for å fremme forståelse cellulære mekanismene bak nevrodegenerative sykdommer.

Nylig nye omic teknologier tilby den beste muligheten til å studere nevrodegenerative sykdommer på et detaljnivå som tidligere ikke oppnådd. Kanskje den største hinderet for å overvinne disse high-throughput studier er den trofaste samling av reproduserbare prøver som kan analyseres med svært følsomme metoder. Prosedyrene introdusert her gi en måte å oppnå dette konsistens, og vil føre til resultater som lett kan sammenlignes på tvers av datasett. Selv om våre primære forskningsinteresser involvert undersøke endringer av genet expression og metabolitter, kunne fluene genereres også underkastes proteomikk eller epigenomic analyse. Proteomikk og epigenomic endringene som skjer i løpet av neurodegeneration er også sannsynlig å være av avgjørende betydning for sykdommen prosessen. Når det vitenskapelige samfunn slutt identifiserer hele spektret av molekylære endringer påvirker sykdommen prosessen, vil en sann systemnivå forståelse av sykdommen være mulig. På dette nivået, vil sykdomsmodifiserende behandling endelig fremstå som en realitet.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for Janice Santiago, Gabriel Figueroa, og Jose Herrera for teknisk bistand og Bloomington Drosophila Stock Center ved Indiana University for fly aksjer. DH og CW ble støttet av midler fra NSF-IOS-1051890. PF-F og LMM ble støttet av en salgsmulighet Seed Fund fra University of Florida.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jazz mix Drosophila food Fisher Scientific AS-153
Cryogenic Vials Corning, Inc. 430658
Microtubes Axygen MCT-175-C-S
RNaseZap Ambion AM9786 Treat all surfaces
5/32" grinding balls, stainless steel OPS Diagnostics GSS 156-5000-01
TRIzol Ambion 15596018
1-bromo-3-chloropropane Sigma B9673-200ML
Isopropanol Fisher Scientific A416-500
DEPC-treated water Fisher Scientific BP561-1
DNase I Promega M6101
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification kit Invitrogen 610-06
Conical Screw Cap Tubes Fisher Scientific 02-681-344
Screw Caps w/O-Rings Fisher Scientific 02-681-364
2.0 mm Zirconia beads BioSpec Products 11079124zx
Methanol, HPLC-grade Fisher Scientific A4524
Chloroform, HPLC-grade Acros organics AC39076
Drosophila Stocks
da-Gal4 Bloomington Stock Center 5460
Gal80[ts] Bloomington Stock Center 7108
UAS-MJD-27Q Bloomington Stock Center 8149
UAS-MJD-78Q Bloomington Stock Center 8150
UAS-LacZ Bloomington Stock Center 8529
Equipment
Inject+Matic Sleeper INJECT+MATIC
Microsieve Set Fisher Scientific 3410531 Use two largest meshes
Geno/Grinder 2000 SPEX Sample Prep SP2100-115
Sorvall Legend Microcentrifuge ThermoScientific 75002436
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System LabConco 7670041
BioAnalyzer v. 2.6 Agilent 2100
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 123-21D
NanoDrop spectrophotometer ThermoScientific
Fast Prep bead-beater ThermoScientific FP120
Centrivap Vacufuge Plus Labconco 022820001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
  3. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
  4. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  5. Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
  6. Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
  7. Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
  8. Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507 (2009).
  9. Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
  10. Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
  11. Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
  12. Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
  13. Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
  14. Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
  15. Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
  16. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
  17. Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
  18. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
  19. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  20. Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
  21. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
  22. Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
  23. Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
  24. Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
  25. Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  26. Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
  27. Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  28. Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
  29. Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361 (2011).
  30. Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
  31. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
  32. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  33. Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
  34. Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
  35. Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).

Tags

Genetikk biokjemi molekylærbiologi nevrobiologi Neuroscience bioteknologi cellebiologi anatomi nevrodegenerative sykdommer biologisk analyse Drosophila bananflue leder separasjon rensing mRNA RNA cDNA DNA karakterutskrifter metabolitter replikerer SCA3 neurodegenerering NMR genekspresjon dyremodell
Rensing av vitnemål og metabolitter fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Heads
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jensen, K., Sanchez-Garcia, J.,… More

Jensen, K., Sanchez-Garcia, J., Williams, C., Khare, S., Mathur, K., Graze, R. M., Hahn, D. A., McIntyre, L. M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads. J. Vis. Exp. (73), e50245, doi:10.3791/50245 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter