Summary
描述一个准确的，短的，复杂的和廉价的方法，使用定量RT-PCR在多个组织和物种评估端粒长度。此外，我们将介绍一个简单的检测，以评估作为一个互补的骨干测试端粒长度的端粒酶活性。
Abstract
端粒重复DNA序列结束的尖端处的染色体长度和人类中是多种多样的，可以达到15000个碱基对的长度。端粒在每次细胞分裂染色体磨损作为一个生物保护机制。在一定的长度，端粒变得太短，允许复制，这个过程可能导致染色体不稳定或细胞死亡。端粒长度是受两个对立的机制：磨损和断裂伸长率。每个细胞分裂发生磨损。与此相反，伸长率部分调制的端粒酶，这增加了重复序列的染色体的端部。以这种方式，端粒酶可能扭转老化机制，活化细胞活力。这些都是重要的元素，在维持细胞的生命和用于评估细胞的衰老。在这篇稿件中，我们将介绍一个准确的，短的，复杂的和便宜的方法来评估在多个组织的端粒长度s和物种。这种方法需要利用两个关键要素，串联重复端粒序列和定量RT-PCR检测的灵敏度差分被测样品的拷贝数。此外，我们将介绍一个简单的检测，以评估作为一个互补的骨干测试端粒长度的端粒酶活性。
Introduction
端粒DNA重复六聚体（TTAGGG）序列，发现在染色体的末端。在每个细胞的复制，这些染色体末端缩短。如果它们变得太短，可以进行染色体端粒末端融合，异常重组和降解。因此，足够维持端粒长度染色体稳定性和细胞保护38中起着重要的作用。基因附近发现染色体的末端端粒长度的保养也是至关重要的，因为DNA复制不能继续1-2染色体的尽头。因此，防止端粒缩短，可以提高电池的稳定性。
许多研究已证实，端粒长度与一个有机体的长寿和疾病状态，如3-4在癌症，糖尿病和心血管疾病的6,7。此外，端粒缩短过度紧张或已与不健康的生活方式，可能是通过促 进细胞过早衰老和死亡9。另一方面，一些研究发现，端粒长度与寿命和年龄有关的疾病39，40，41，有没有显着区别。
端粒缩短的保护细胞的先天机制之一是通过激活其自身端粒酶逆转录酶（TERT）。这种酶和其亚单位，端粒酶RNA（TERC），非编码RNA作为模板使用的端粒添加端粒重复染色体的端部10。虽然端粒酶活性缺席参与维持端粒长度的几种类型的细胞和其他机制，增加端粒酶活性与端粒长度的增加。端粒酶激活已建立细胞损伤和强调，避免过早衰老和死亡的机制之一。例如，较长的特表现在德系犹太人的人口与例外寿命11 lomeres，TERC基因的突变或叔已被证明有助于致命的疾病12，和表观遗传调控端粒酶已被证明有效果与年龄有关的疾病13。自从其发现，端粒长度已经提出在各种动物模型以及人类健康状况的生物标志物，但这些早期的研究采用的方法是难以广泛复制，因为繁琐，漫长而昂贵的。在2002年和2009年进一步调整，Cawthon提出并实现了一个新的，准确，快速，简单的基于PCR的协议，以评估进一步探讨端粒长度和细胞生物学的各个方面，它的作用在衰老和疾病19。
选择正确的一项研究端粒测量方法是必不可少的。目前，有多种方法，用于测量端粒长度，每个都有其自己优点和缺点。传统上，端粒长度的测量采用Southern blot分析末端限制性片段（成绩单），其中包括：一。不切端粒重复序列，以获得成绩单，B的限制性内切酶消化的DNA。这些末端限制性片段的Southern印迹法是通过用端粒探针14，37确定的平均TRF长度。尽管此方法是高度精确的，一个小的变动系数，是直接的措施，可以是有利的，用于测量长度分布，TRF分析是昂贵的，劳动密集型的，至少需要3微克DNA。此方法也是不敏感的短的端粒长度和决心，可以混淆的端粒DNA，它可以检测探头，由于（TTAGGG）N像序列含有15，42。
另一种高度准确的方法测量端粒长度的端粒伸长长度分析（STELA），以单Ë分子PCR为基础的方法，只需要少量的DNA。在该方法中，引物被认识到的富含G的悬在染色体末端的一条染色体上，放大一个特定的染色体的端粒要绑定到一个独特的亚端粒序列。然后，将得到的扩增是可视化的Southern印迹法。此方法的优点是高度精确的，能够检测潜在的离群值端粒16。不幸的是，因为并不是所有的染色体两端有富G和可用的端粒序列，端粒长度只能在特定的染色体上测量，这些测量可能无法代表所有端 粒的长度在小区15。
已经实行的另一种方法是使用肽核酸（PNA）探针检测端粒长度。 原位杂交定量花期 （Q-FISH）技术使我们能够想象的端粒在中期，ST癌宁端粒与PNA探针在它们的大小比例，允许特定染色体的端粒之间的比较。虽然这种方法也可以用于细胞间期，在这里针对不同的染色体的端粒长度不能被检测到，它引入了一个在衰老或不常除以单元17测量时，端粒长度的限制。流鱼，而不是使用流式细胞仪，是目前最敏感的方法，在临床上用于测量血细胞的端粒长度，但需要高度熟练的技术人员18。
目前，在我们的实验室中测量平均端粒长度的标准方法充分利用的精度，灵敏度，简便的定量实时PCR。此方法所开发的新型引物，避免合成的引物二聚体衍生的产品，否则会被作为测量端粒长度尽可能由于端粒的重复性质TANDARD测定。对于这个实验中，端粒长度的测量T / S比，端粒重复序列拷贝数单拷贝基因数目表示。因为有一个直接的端粒长度和标记的端粒引物结合的DNA的PCR过程的开始阶段的数量之间的比例关系，在T / S比率成正比的端粒长度。 T / S比值衡量比较CT的差异，在该样品的循环数累计花期越过一个门槛就是几基线花期个标准差以上，端粒引物与样品之间的和SCG引物19。这种方法已经被批评为间接测量端粒长度，这可能会导致不准确的测量，例如，在染色体重复或拷贝数变异15的情况下。此外，研究之间的比较往往是二已发展到测量绝对端粒长度20 fficult，但标准低聚物。此方法进一步改进通过Cawthon，使用单色多重qPCR实验。在该试验中，在PCR的前几个周期，在较低温度下运行，以避免引物二聚体的结合，并的端粒和控制基因进行了分析，在相同的PCR管中以进一步避免错误。与端粒长度的末端限制性片段的Southern印迹分析测定，将所得的端粒长度测量很强的相关性，并具有更高的精度15，19，36。此刻，实时定量RT-PCR是唯一方便的方法，可用于大样本测试，只需要少量的DNA进行。这种方法的一个重要部分是全面的质量控制措施，这样，当它处理得当，这种方法可以提供有价值的比较信息端粒长度。此外，这种方法已被改编为超越白细胞测量在各种不同的组织42的端粒长度。
此外，为了进一步了解背后的生物学机制维持端粒长度和两种相反的效果（ 即端粒缩短和伸长率在复制过程中的端粒酶）之间的相互作用，我们伴随着额外的检测，测量端粒酶活性与端粒长度的方法。
为了这个目的，我们使用了端粒重复序列扩增， 在体外试验。简单地说，溶解，保护，合成的酶活性的细胞将端粒重复序列的寡核苷酸的基板使用端粒酶，并用PCR扩增的存在下的SYBR Green的产品。结果，然后进行分析比较样品和控制CT阈值。由于端粒酶是一种对热敏感的酶，一个额外的热处理控制每个样品21一 起运行。
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Protocol
1。端粒长度协议19
- DNA的提取
大多数DNA的提取方法也可使用。我们的实验室更喜欢：Qiagen公司都可套件（＃69506）血源。根据源DNA，如口腔或其他来源的不同，不同的隔离方法也可使用。
- 底漆：
稀释所有的引物在PCR级水100pmoles/μl股票的浓度，并储存在-20℃直到需要。工作股引物作出了新的，并存储在20℃很短的一段时间（几个月）。奥卡拉汉等人所描述的标准引物用于端粒和β-珠蛋白，对SCG，20 。
引物序列：
端粒1：5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT TGGGTTTGGGTT-3'
端粒2：5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT ACCCT-3'
SCG 1：5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCAC的TAGC-3'
SCG 2：5'-CACCAACTTCATCCACGTTC的ACC-3'
注意：引物稀释至工作浓度为10pmoles/μl前加入到反应组合。
- 连续稀释的基因组DNA：
稀释的基因组DNA序列，端粒和单拷贝基因（SCG）创建生成一个标准的CT检测值曲线。所用的基因组DNA的提取从淋巴细胞从血液样本。在这些稀释液所建立的DNA与PCR级H 2 O稀释至各浓度的一个因素为1.68，得到两组使用相同的基因组DNA的系列稀释液。基于试验和错误的起始浓度都得到了优化，并且可能需要使用不同的试剂，仪器，来自其他物种的DNA，细胞类型和SCG使用时，必须调整。
注意：使用的基因组DNA的序列稀释是由轻轻地混合，并等待至少15分钟至一小时befo重新下稀释的DNA。每个稀释需要的时间分解的基因组DNA。对于长期储存，分装系列稀释成PCR条储存在-80°C每个PCR条被解冻，并使用一次，以避免可能破坏DNA的冻融循环。
- RT-PCR反应设置
仪器：Roche480光循环仪
材料：罗氏光循环仪SYBR绿色
测试的DNA样品稀释至终浓度为10纳克/微升。我们测试浓度使用的NanoDrop或量子比特。我们进一步稀释的DNA10ng/μl最终5ng/μl的的。我们不会再次测试浓度。
反应部分组成：
| TELO | 1X | SCG | 1X | |
| H 2 0 </ TD> | 6微升 | H20 | 6微升 | |
| TELO 1 | 0.2微升 | SCG 1 | 0.6微升 | |
| TELO 2 | 1.8微升 | SCG 2 | 1.4微升 | |
| RXN组合 | 10微升 | RXN组合 | 10微升 | |
| DNA或串行稀释 | 2微升 | DNA或串行稀释 | 2微升 |
注：预混无DNA和用过量5％至10％。
双方TELO和SCG一起运行的同一个盘子，使用下面的程序。要精确测试的，至少有三个重复，每个样品，应运行和控制。使用的引物中的变化可能会影响结果。我们的协议已经优化的Roche480光循环仪和我们的引物如下工作。
在itial变性
10分钟变性95°C
循环
95°C 10秒保持
60℃5秒保持
72℃11秒保持和单次采集
根据需要，重复45〜55次
2。端粒酶定量检测（QTD）协议（QTD套件的基础上，通过联合生物科技有限公司货号MT3012）
提取物的制备
- 沉淀细胞或组织。
- 与1X PBS洗一次。
- Repellet和删除1X PBS *
- 细胞沉淀重悬在200μl的1×裂解缓冲液为每10 5 -10 6个细胞，或40-100毫克组织。
- 在冰上孵育30分钟。
- 降速样品在4℃下以12,000×g离心30分钟
- 160微升上层清液转移到新的管中，测定蛋白质浓度。
- 分装和速冻剩余的干冰/乙醇提取物对，储存于-80°C。
*在t他的条件，冷冻细胞或组织中的端粒酶是稳定至少一年。当解冻使用，立即悬浮细胞在1×裂解液。
2.1。含量控制
热灭活控制：对于每一个样本，热处理提取物端粒酶活性检测前10分钟在85°C孵育一个额外的控制。
TSR控制模板的标准曲线：执行实时定量PCR的TSR，寡核苷酸与端粒引物包含在套件中生成标准曲线的相似序列使用稀释。
- 准备1:5系列稀释液的库存TSR浓度（0.5 amoles个/μl），用裂解缓冲液
- 执行使用1微升每个TSR稀释，包括股票浓度的的端粒酶检测标准检测。可以被存储在这些稀释液，在4℃下至少2周。
2.2。端粒酶活性测定使用实时PCR QTD
- 对于每个样本中，添加下面的PCR管或薄壁PCR板（总体积25.0微升）：
- QTD预混料2×12.5微升
- 1.0微升的细胞或组织提取物
- 11.5μl的PCR合格水
- 调匀
- 程序的实时荧光定量PCR检测系统，按照下面的程序：
- 25°C为20分钟（端粒酶反应）
- 95℃下和10分钟（PCR初始活化步骤）
35-40周期：
- 95℃下30秒（变性）
- 60℃下进行30秒（退火）
- 72°C，持续30秒（扩展名） - PCR管放置在热循环仪，并开始循环程序。
- 收集阈值周期或周期完成后的C T值。阈值循环周期ΔRn值有统计学意义的增加是首次发现。
2.3。数据分析
- GENERATEA标准曲线使用C T读数和端粒酶活性进行比较。
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Representative Results
端粒长度定量RT-PCR分析的一个例子是图1中所示。在左上角的面板中，在红色和绿色标记的样品代表的位置上的96 - 孔板的受试者。在右上方的面板，扩增曲线证明。每个主题是由两个检测（端粒，单拷贝基因），这是一式三份进行测试。由于选定的个人的两个实验中产生的不同的DNA的拷贝数，花期检测的周期数，直到达到其指数曲线之间的不同检测。在较高的拷贝数管（ 即端粒法），荧光检测量达到27个循环后的指数曲线。第二组线表示的单拷贝基因（SCG）具有在基因组中只有一个副本，因而具有少得多份比端粒样品和达到其只在31个周期后的指数曲线。棕色系代表标准曲线是根据已知的样品浓度的连续稀释。右下方的面板中表示对数浓度的标准曲线的点（的直线演示了一个最佳的连续稀释）。正在使用该线性曲线来计算浓度的测试管（左下面板）。的定量RT-PCR的结果，最初是在Cawthon的手19，我们和其他人重复，已经示出了通过以下方式获得的末端限制性片段长度检测与。一T / S比率单元（定量RT-PCR端粒碾过定量RT-PCR对SCG运行周期的周期）是相当于平均端粒长度为4270碱基对白细胞42。除以定量RT-PCR由SCG测定在我们的例子中的端粒检测周期的比例为0.87，这相当于平均为3715 bp。此测量由单独的端粒长度，并且不包括亚端粒区。
定量RT-PCŗ这里展示的涉及很少的样品制备。在此示例中（ 图1），定性和定量的差异（表示的连续稀释和之间的一致性的一式三份），观察之间的两个实验。从本次测试的计算结果表明中间端粒长度为65岁的主题。
由图2展示了一个例子端粒酶活性的检测结果和端粒酶活性和端粒长度之间的可能关系。我们的初步研究结果表明，端粒酶活性增加，可伴有较长的端粒长度。
图1：图1表示典型的输出从水溶液RT-PCR检测端粒长度。左上角显示安排在96 - 孔板中，一式三份样品。左下角列出计算浓度，对每个样品的CT值，被用于计算T / S值。右上方是在扩增曲线（周期数与花期检测从CYBR绿色），用于可视化结果的曲线图。在右下方，与CT值连续稀释控制日志浓度标准曲线绘制。直线证实，连续稀释的精确测量和加载。 点击这里查看大图 。
图2。使用的初步结果定量RT-PCR检测端粒酶活性和端粒长度，<>图2显示了一个直接的，显着的关系（P = 0.008）之间的端粒长度，T / S比来衡量，与端粒酶活性，Ct值测量。
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Discussion
端粒长度提供了一个独特的学习压力和老化细胞的细胞标记和衰老的机制提供见解。由于其老化的作用首次被提出，众多的研究已经完成，有关端粒长度的年龄，长寿，与年龄有关的疾病，癌症和压力。几十年来，端粒长度测量的金标准是末端限制性片段分析Southern杂交。然而，最近一个负担得起的，快速和容易执行由Cawthon方法已经演变而来的。使用实时定量PCR，Cawthon提供了一个有用的替代测量端粒长度，可能开展大样本的研究。
使用定量RT-PCR，许多研究已经完成，以探讨端粒长度和多种结局的关系，尤其是与年龄有关的疾病。更具体地说，这种方法使研究人员能够进行大型的流行病学学生死亡人口证明或否认端粒长度之间的相关性和多种疾病的发生。命名了几句，缺血性心脏疾病7，阿尔茨海默氏病22，女性23，肺癌在吸烟者24，家族性甲状腺癌25 osteocarcoma，糖尿病5，血压26，老化27，和老年痴呆症28已被相关较短的端粒长度，而年龄相关性黄斑变性7，大肠癌43，和死亡的感染性疾病，癌症，心脏或脑血管疾病44已被证明与端粒长度没有显着的关系。此外，某些应力已被证明，以配合端粒长度较短，例如，炎症标志物的增加量，TNF-α和IL-6，与较短的端粒长度在白细胞29。此外，紧张的LIFestyles由于耗时的工作日程安排，轮班工作，或工作的性质，特别是长期病患儿童的看守位置，已与端粒长度的差异有关。这表明应力可能会导致过早衰老，端粒缩短的方式，如果没有足够的恢复30，31。在最近的一项研究中，具有较少的社会关系也与端粒缩短32。端粒长度缩短的预防也被证明与选择健康的生活方式，如每天服用多种维生素和不吸烟的24，33。此外，这些研究显示测量的端粒可能的临床用途，例如，作为一种非侵入性的筛分试验的可能发展为肝硬化34。在其他情况下，也有类似的研究并没有表现出显着的相关性（或适度的相关性）疾病和端粒长度之间，研究人员一直鼓励ST乌德等新机制的细 胞下降和疾病状态7。
这些研究在数量和强度已经证明了实用的测量端粒长度在破译的老化过程的首要步骤之一。为此目的Cawthon定量RT-PCR方法是有用的，因为它可以大量的人进行比较，只需要很少的DNA，并能提供可靠的证据对端粒长度和细胞健康之间的关系。这些研究有助于引导未来的老龄化研究某些基因，组织和细胞进程的努力。
不可避免的是，后端粒长度的一个显着差异，另外，解释查询。要回答这些问题，研究端粒酶，这种酶参与端粒维持和调控，已经成立。已经提供了基于PCR的端粒酶活性协议，提供额外的信息走向：。确定续ributions端粒的降解，以及b。失败，成功的维持端粒长度的端粒酶，从而提供了另一个章节的故事作为一个整体的老化，尤其是细胞的衰老。
虽然定量RT-PCR检测平均端粒长度，而不是一个个体的染色体基础上，这个方法是一个强大的工具，朝细胞如何老化和应激反应的证据，并提供了一个序言的故事我们的年龄如何。有趣的是，这个信息已经导致生物年龄估计在诊所测量端粒长度，将让我们进一步了解衰老过程，必然导致衰老和与年龄有关的疾病的预防或延迟和筛选。
| 试剂名称 | 公司 | 目录编号 |
| 端粒酶定量检测联合生物 | MT3012 | |
| Qiagen公司都可套件 | Qiagen公司 | 69506 |
| 的LightCycler 480的SYBR Green I主，准备使用的热启动使用SYBR Green I的基于实时PCR反应混合物在LightCycler 480仪器 | 罗氏诊断 | 4707516 |
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantitative Telomerase Detection | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
References
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