Summary
Een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode wordt beschreven dat beoordeelt lengte van telomeren in meerdere weefsels en diersoorten met behulp van qRT-PCR. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.
Abstract
Telomeren zijn DNA-sequenties herhaald aan het uiteinde uiteinden van de chromosomen die zijn divers in lengte en bij de mens kan een lengte van 15.000 baseparen bereiken. De telomeer dient als een bioprotectieve mechanisme van chromosoom attritie bij elke celdeling. Bij een bepaalde lengte, telomeren te kort om replicatie, een proces dat kan leiden tot chromosomale instabiliteit of celdood mogelijk. Lengte van telomeren wordt gereguleerd door twee tegengestelde mechanismen: verloop en rek. Natuurlijk verloop gebeurt als elke cel deelt. Daarentegen rek gedeeltelijk gemoduleerd door het enzym telomerase, die herhalende sequenties draagt aan de uiteinden van de chromosomen. Op deze manier kan telomerase eventueel omkeren van een vergrijzing van de regeling en verjongt levensvatbaarheid van de cellen. Zijn cruciale elementen in het handhaven cel levensduur en worden gebruikt om cellulaire veroudering beoordelen. In dit manuscript zullen we een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode om de lengte van telomeren beoordelen in meerdere weefsels te beschrijvens en soorten. Deze methode maakt gebruik van twee belangrijke elementen, de tandem herhaling van de telomere sequentie en de gevoeligheid van de qRT-PCR van differentiële kopie aantal geteste monsters te detecteren. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.
Introduction
Telomeren zijn DNA hexameer (TTAGGG) sequenties gevonden aan de uiteinden van chromosomen herhalen. In elke cel replicatie, worden deze chromosoomeinden verkort. Als ze het te kort, kan chromosomen telomeren einde fusies, afwijkende recombinatie, en degradatie ondergaan. Dus voldoende lengte van telomeren onderhoud speelt een belangrijke rol in het chromosoom stabiliteit en celbescherming 38. Lengte van telomeren onderhoud is ook cruciaal voor genen gevonden in de buurt van de uiteinden van chromosomen, omdat DNA-replicatie kan niet doorgaan tot het einde van de chromosomen 1-2. Bijgevolg kan voorkomen telomeerverkorting cel stabiliteit.
Talrijke studies hebben gemeld dat telomere length is gecorreleerd met de levensduur van een organisme en zieke toestand, zoals bij kanker 3-4, 5 diabetes en cardiovasculaire ziekte 6,7. Daarnaast zijn verkorte telomeren geassocieerd met overmatige stress of eenongezonde leefstijl 8, misschien door het bevorderen van vroegtijdige veroudering van cellen en dood 9. Anderzijds hebben sommige studies gevonden dat er geen significant verschil tussen de lengte van telomeren en levensduur en leeftijdsgebonden ziekte 39, 40, 41.
Een van de cel aangeboren mechanismen van bescherming van telomere verkorting is door activering eigen enzym telomerase reverse transcriptase (TERT). Dit enzym en subeenheid telomerase RNA (TERC), een niet-coderende RNA, gebruiken de telomeer als sjabloon telomeer herhalingen toevoegen chromosoomuiteinden 10. Hoewel telomerase activiteit afwezig verschillende soorten cellen en andere mechanismen betrokken zijn bij telomerelengte onderhoud verhoogd telomerase-activiteit gecorreleerd met verhoogde telomeren. Telomerase activering is opgericht als een van de mechanismen waarmee cellen reageren op schade en benadrukken en te voorkomen dat voortijdige veroudering en dood. Bijvoorbeeld, meer telomeres werden aangetoond in een populatie van Ashkenazi Joden uitzonderlijke levensduur 11 mutaties van TERC of TERT aangetoond bijdragen tot fatale ziekte 12 en epigenetische regulatie van telomerase is aangetoond dat een effect van leeftijd-gerelateerde ziekte 13 hebben. Sinds de ontdekking, is de lengte van telomeren is voorgesteld als een biomarker voor de gezondheidstoestand in verschillende diermodellen en in mensen, maar deze vroege studies waren moeilijk te repliceren schaal omdat de gebruikte methode was vervelend, lang en duur. In 2002 en verder afgestemd in 2009, Cawthon voorgesteld en gedemonstreerd een nieuwe, accurate, snelle en eenvoudige PCR-gebaseerde protocol om de lengte van telomeren beoordelen en zijn rol verder te onderzoeken in de verschillende aspecten van de celbiologie, veroudering en ziekte 19.
Het kiezen van de juiste telomeer meetmethode voor een studie is van essentieel belang. Momenteel zijn er verschillende methodes om telomere lengte meten, elk met zijn eigenen nadelen. Traditioneel wordt telomeerlengte gemeten middels Southern-blotanalyse van terminale restrictiefragmenten (TRF), die omvat: een. het verteren van het DNA met restrictie-enzymen die niet in telomeren herhalingen doen verlagen om TRF's te verkrijgen, b. Southern blot van deze TRF wordt gedaan door het bepalen van de gemiddelde lengte met een TRF telomere probe 14, 37. Hoewel deze werkwijze zeer nauwkeurig met een kleine variatiecoëfficiënt, is een directe maat en kan voordelig voor het meten van de distributie lengte, TRF analyse duur, arbeidsintensief en vereist minimum 3 ug DNA. Deze methode is ook ongevoelig voor korte telomeren en lengte bepaling kan worden verstoord door subtelomeric DNA, dat kan worden gedetecteerd door de probe door de (TTAGGG) n achtige sequenties Bevat 15, 42.
Een andere zeer nauwkeurige methode bij het meten van de lengte van telomeren is Single telomeren Rek Lengte Analysis (STELA), een single molecule PCR-methode die vereist slechts een kleine hoeveelheid DNA. In deze werkwijze worden primers aan de G-rijke overhang herkennen eind chromosomen en te binden aan een unieke subtelomeric volgorde op een chromosoom, die de telomeer van een specifiek chromosoom versterkt. De resulterende versterking is dan gevisualiseerd door Southern Blot. Deze werkwijze heeft het voordeel dat zeer nauwkeurige en kan korte telomeren outlier sporen 16. Helaas, aangezien niet alle chromosomen G-rijke einden en een bruikbare subtelomeric sequentie telomere lengte kan alleen worden gemeten specifieke chromosomen en deze metingen niet de lengte van de telomeren in de cel 15 vertegenwoordigen.
Een andere methode die is toegepast is het gebruik van Peptide Nucleic Acid (PNA) probes telomerelengte detecteren. Kwantitatieve Florescence in situ hybridisatie (Q-FISH) stelt ons in staat om telomeren visualiseren tijdens metafase, waar de staining van telomeren met een PNA probe in verhouding tot hun grootte maakt de vergelijking van telomeren tussen specifieke chromosomen. Deze methode kan ook worden toegepast op cellen in interfase, hier de telomere lengte afzonderlijke chromosomen kan niet worden gedetecteerd, waardoor een beperking introduceert bij het meten telomere lengte verouderend of zelden delende cellen 17. Flow FISH plaats daarvan maakt gebruik van flowcytometrie en is momenteel de meest gevoelige methode voor het meten van de lengte van telomeren van bloedcellen in de klinische setting, maar vereist hoogopgeleide technici 18.
Momenteel is de standaard methode voor het meten van de gemiddelde lengte van telomeren in ons laboratorium maakt gebruik van de precisie, gevoeligheid, en het gemak van kwantitatieve real-time PCR. Deze methode is mogelijk voor het meten van de lengte van telomeren door de ontwikkeling van nieuwe primers die de synthese van primer-dimeer afgeleide producten, die anders zou in zo geproduceerd vermijdentandaard assay vanwege de herhalende karakter van de telomeren. Voor deze test wordt de meting van de lengte van telomeren vertegenwoordigd door de T / S-ratio, de telomeer repeat aantal kopieën aan single-copy gen nummer. Aangezien er een direct evenredig verband tussen de telomere lengte en het aantal telomere gemerkte primers binden aan het DNA tijdens de beginstadia van PCR, de T / S-verhouding is recht evenredig met de lengte van telomeren. De T / S-ratio wordt gemeten door het verschil in Ct vergelijken, het fractionele cyclus nummer waarop het monster is opgebouwd bloei een drempel overschrijdt die is meerdere standaarddeviaties boven de basislijn bloei, tussen monsters met telomeren primers en SCG primers 19. Deze methode is bekritiseerd voor zijn indirecte meting van de lengte van telomeren, wat kan leiden tot onnauwkeurige metingen, bijvoorbeeld in het geval van chromosoom duplicaties of copy number variations 15. Ook vergelijking van studies vaak difficult, maar standaard oligomeren zijn ontwikkeld om absolute telomerelengte 20 meten. Deze methode werd bevorderd op door Cawthon verbeterd, met behulp van een monochroom multiplex qPCR assay. In deze test werd de PCR uitgevoerd bij lagere temperaturen voor de eerste paar cycli primer-dimeer binding voorkomen en telomeer en controle-gen werden geanalyseerd in dezelfde PCR buis fout verder voorkomen. De verkregen telomere lengte metingen sterk gecorreleerd met telomere lengte, gemeten door Southern blot analyse van TRF en hadden hogere nauwkeurigheid 15, 19, 36. Momenteel qRT-PCR de enige geschikte methode voor het testen van grote aantallen individuen en vereist slechts een kleine hoeveelheid van DNA uit te voeren. Een cruciaal onderdeel van deze methode is uitgebreide kwaliteitscontrole maatregelen, zodat wanneer het goed is gedaan, kan deze methode waardevolle vergelijkende informatie over de lengte van telomeren bieden. Bovendien was deze methode aangepast voor gebruik buiten leukocyten voor het metentelomere length in verschillende weefsels 42.
Bovendien, om verder inzicht in de biologie achter telomerelengte onderhoud en interacties tussen de twee tegengestelde effecten (effecten telomere verkorting tijdens replicatie en elongatie door telomerase enzym), we vergezeld de telomere lengte methode een extra test die telomerase-activiteit meet.
Hiervoor gebruikten we een telomere Repeat Amplification Protocol, een in vitro assay. Kort gelyseerd, conserven, enzymatisch actieve cellen gesynthetiseerd telomeer herhalingen op een ondergrond met oligonucleotide telomerase, en de producten werden geamplificeerd met behulp van PCR in de aanwezigheid van SYBR Green. De resultaten werden vervolgens geanalyseerd door het vergelijken van monster en controle-Ct drempelwaarden. Omdat telomerase is een warmtegevoelig enzym, wordt een extra warmte behandelde controle uitgevoerd langs elk monster 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Telomeren Lengte Protocol 19
- DNA isolatie
De meeste DNA isolatiemethoden worden gebruikt. Onze Lab geeft de voorkeur aan Qiagen DNeasy Kit (# 69506) voor bloed bronnen. Afhankelijk van de bron van DNA, zoals buccale of andere bronnen, kan een andere isolatiemethode worden gebruikt.
- Primers:
Alle primers zijn verdund tot een voorraad concentratie van 100pmoles/μl in PCR kwaliteit water en bewaard bij -20 ° C totdat ze nodig waren. Werkvoorraden van primers worden vers en opgeslagen bij 20 ° C gedurende een korte tijd (enkele maanden.) Standaard primers werden gebruikt voor telomeren en β-globine, SCG, zoals beschreven in O'Callaghan et al.. 20 .
Primer sequenties:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '
Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '
Opmerking: Primers worden verdund tot een werkconcentratie van 10pmoles/μl, voorafgaand aan het toevoegen aan reactiemix.
- Seriële verdunning van genomisch DNA:
Seriële verdunningen van genomisch DNA voor Telo en Single Copy Gene (SCG) zijn gemaakt om een standaard curve Ct waarde voor de test genereren. De genomische DNA gebruikt werd geëxtraheerd uit lymfocyten uit bloedmonsters. Deze verdunningen worden gemaakt door verdunnen DNA met PCR klasse H 2 0 elke concentratie met een factor van 1,68 in de twee seriële verdunningen met dezelfde genomische DNA verkregen. De uitgangsconcentraties zijn geoptimaliseerd op basis van trial and error en moet worden aangepast als er andere reagentia, instrumenten, DNA van andere species, celtypen en SCG gebruikt.
Opmerking: Seriële verdunning met genomisch DNA door voorzichtig te mengen en wachten tenminste 15 minuten tot een uur before die DNA voor de volgende verdunning. Elke verdunning vereist tijd voor genomisch DNA te distantiëren. Voor lange termijn opslag, aliquot seriële verdunningen in PCR strips voor opslag bij -80 ° C. Elke PCR-strip wordt ontdooid en een keer gebruikt om vries dooi cycli die DNA kunnen beschadigen.
- Reaction opstelling voor RT-PCR
Instrument gebruikt: Roche480 Light Renner
Reagens: Roche Light cycler SYBR-groen
Verdun test-DNA monsters tot een eindconcentratie van 10 ng / ul. We testen concentratie behulp Nanodrop of qubit. We verder verdunnen het DNA van 10ng/μl naar finale 5ng/μl. Wij concentratie niet opnieuw te testen.
Reactiecomponenten:
| TELO | 1x | SCG | 1x | |
| H 2 0 </ Td> | 6 pl | H20 | 6 pl | |
| Telo 1 | 0,2 pl | SCG 1 | 0,6 pl | |
| Telo 2 | 1.8 ul | SCG 2 | 1.4 ul | |
| Rxn mix | 10 gl | Rxn mix | 10 gl | |
| DNA of seriële verdunning | 2 pi | DNA of seriële verdunning | 2 pi |
Opmerking: Master Mix zonder DNA en met een overmaat van 5% tot 10%.
Zowel Telo en SCG tegelijkertijd worden uitgevoerd op dezelfde plaat met het volgende programma. Om te testen voor precisie, ten minste drie duplo van elk monster en de controle moet worden uitgevoerd. Variaties in de gebruikte primers kunnen hebben op de resultaten. Ons protocol is geoptimaliseerd om te werken als volgt op de Roche480 Light Renner en onze primers.
Invrijwaart de oorspronkelijke denatureren
10 min 95 ° C denatureren
Fiets
95 ° C 10 sec hold
60 ° C 5 seconden hold
72 ° C 11 seconden wacht en eenmalige acquisitie
Herhaal 45-55 keer als nodig
2. Kwantitatieve Telomerase Detection (QTD) Protocol (Gebaseerd op QTD Kit door geallieerde Biotech, Inc Cat. No MT3012)
Extract Voorbereiding
- Pellet cellen of weefsel.
- Was eenmaal met 1x PBS.
- Repellet en verwijder 1x PBS. *
- Resuspendeer de celpellet in 200 ui 1 x lysisbuffer voor elke 10 5 -10 6 cellen of 40-100 mg weefsel.
- Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Spin down het monster bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Breng 160 pi van het supernatant naar een nieuwe buis en eiwitconcentratie te bepalen.
- Aliquot en quick-bevriezing van de resterende extract op droog ijs / ethanol, bewaar bij -80 ° C.
* In tzijn toestand telomerase in bevroren cellen of weefsels is stabiel gedurende tenminste een jaar. Wanneer ontdooid voor gebruik, resuspendeer de cellen onmiddellijk in 1 x Lysis Buffer.
2.1. Assay Controls
Inactivatie control: Voor elk monster warmtebehandeling bijkomende garantie extract door incubatie bij 85 ° C gedurende 10 min voor telomerase-activiteit assay.
Standaardcurve voor TSR control template: Voer Kwantitatieve Real-Time PCR met behulp van verdunningen van TSR, een oligonucleotide met een vergelijkbare sequentie telomere primers die bij de kit om een standaardkromme te genereren.
- Bereid 01:05 seriële verdunningen van de voorraad TSR concentratie (0,5 Amoles / ul) met lyseerbuffer
- Voer de telomerase detectie standaardtest met 1 pi van elke verdunning TSR, zoals de voorraadconcentratie. Deze verdunningen kunnen bij 4 ° C gedurende ten minste 2 weken opgeslagen.
2.2. Telomerase activiteit Assaybehulp QTD Real-Time PCR
- Voor elk monster, voeg het volgende toe aan een PCR-buis of dunwandige PCR-plaat (totaal volume 25,0 pi):
- 12,5 ui 2 x QTD Premix
- 1.0 ul cel of weefsel extract
- 11,5 ui PCR Qualified Water
- Meng goed
- Programma Real-Time PCR Detection Systems volgens het onderstaande programma:
- 25 ° C gedurende 20 min (telomerase reactie)
- 95 ° C gedurende 10 min (PCR eerste activeringsstap)
35-40 cycli van:
- 95 ° C gedurende 30 seconden (denaturatie)
- 60 ° C gedurende 30 seconden (annealing)
- 72 ° C gedurende 30 seconden (verlenging) - Plaats PCR buisjes in het PCR-apparaat en start het fiets-programma.
- Verzamel de drempel cyclus of C T waarde na cycli afwerking. De drempel cyclus de cyclus waarbij een statistisch significante toename van ΔRn eerst wordt gedetecteerd.
2.3. Data Analysis
- Generatea standaard curve met behulp van de C T lezingen en vergelijk telomerase-activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van een telomere lengte qRT-PCR wordt getoond in figuur 1. Links bovenpaneel voorziene monsters in rood en groen geven de plaats van de geteste onderwerpen de 96-well plaat. Op de bovenste rechter paneel, wordt de amplificatiecurve aangetoond. Elk vak wordt getest door twee assays (Telomere en Single Copy Gene), dat wordt uitgevoerd in drievoud. Vanwege de verschillende kopie aantallen DNA geproduceerd in de twee analyses van geselecteerde personen, het aantal cycli totdat de fluorescentie detectie bereikt een exponentiële curve verschilt assays. In hoger kopieaantal buizen (bijvoorbeeld Telomere assay), de hoeveelheid fluorescentie detectie zijn exponentiële curve na 27 cycli bereikt. De tweede set lijnen vertegenwoordigt de Single Copy Gene (SCG) dat slechts een kopie van het genoom heeft en heeft dus minder mee dan de telomeer monsters en de exponentiële kromme pas na 31 cycli bereikt. De blauwe lijn geven de normkromme die is gebaseerd op een seriële verdunning van bekende monsterconcentraties. De onderste rechter paneel geeft de log concentratie van de standaard curve punten (een rechte lijn toont een optimale seriële verdunning). Deze lineaire curve wordt gebruikt om de concentratie van de geteste buizen (linker paneel) berekenen. De qRT-PCR resultaten, aanvankelijk in Cawthon handen 19 en herhaald door ons en anderen is aangetoond worden gecorreleerd met die verkregen door de terminal restrictiefragmentlengte assay. Een T / S-ratio unit (qRT-PCR-cycli van de telomeren overreden qRT-PCR-cycli van de SCG run) is daarvan een gemiddelde lengte van telomeren van 4270 bp in leukocyten 42. Verdelen de qRT-PCR cycli om de Telomere bepaling van de SCG assay in ons voorbeeld is de verhouding van 0,87, hetgeen overeenkomt met een gemiddelde van 3.715 bp. Deze meting omvat de telomere lengte van elkaar en omvat subtelomeric regio.
De qRT-pcR gedemonstreerd hier gaat zeer weinig monstervoorbereiding. In dit voorbeeld (figuur 1), werden kwalitatieve alsook kwantitatieve verschillen (weergegeven door de seriële verdunning en de overeenkomst tussen de triplo) waargenomen tussen de beide assays. De berekende uit deze testresultaten blijkt tussenliggende lengte van telomeren voor een 65-jarige onderwerp.
Een voorbeeld van telomerase-activiteit testresultaten en de mogelijke relatie tussen telomerase-activiteit en telomere length blijkt uit figuur 2. Onze voorlopige resultaten tonen aan dat een langere telomere lengte worden geassocieerd met verhoogde telomerase-activiteit.
Figuur 1. Figuur 1 de typische uitvoer van aqRT-PCR assay voor Telomeerlengte. De linkerbovenhoek toont de monsters die in een 96-well plaat in drievoud. Linksonder worden de berekende concentraties en CT waarden van elk monster, die worden gebruikt om de T / S waarden. Rechtsboven is een grafiek van de amplificatiecurve (aantal cycli versus de fluorescentie gedetecteerd CYBR groen), gebruikt om de resultaten te visualiseren. Rechtsonder in het scherm wordt de standaard curve voor de Log concentratie versus CT waarde van de seriële verdunning controle opgenomen. Een rechte lijn wordt bevestigd dat de seriële verdunning nauwkeurig gemeten en werd geladen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Gebruik voorlopige resultaten van de qRT-PCR assay voor telomerase activiteit en telomerase lengte <strong> Figuur 2 toont een directe relatie significant (p = 0,008) tussen de telomere lengte, gemeten door T / S-verhouding en telomerase-activiteit, gemeten Ct waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lengte van telomeren biedt een unieke cellulaire marker om de gestresste en veroudering cel bestuderen en biedt inzichten in de mechanismen van veroudering. Sinds haar rol in veroudering eerst was voorgesteld, hebben een veelheid van studies gedaan met betrekking tot de lengte van telomeren leeftijd, levensverwachting, leeftijd-gerelateerde ziekte, kanker, en stress. Al tientallen jaren, de gouden standaard van de lengte van telomeren metingen was terminal restrictiefragmentanalyse behulp Southern hybridisatie. Echter, onlangs een betaalbaar, snel en eenvoudig uit te voeren methode Cawthon is geëvolueerd. Met behulp van kwantitatieve real-time PCR, Cawthon bood een bruikbaar alternatief voor de lengte van telomeren te meten, waardoor studies voor grote steekproeven mogelijk.
Gebruik qRT-PCR, hebben veel studies gedaan om de verhouding tussen de lengte van telomeren en verschillende resultaten, vooral leeftijdsgebonden ziektebeelden. Meer in het bijzonder heeft deze methode toegestaan onderzoekers om grote epidemiologische stu voerensterft populaties die een correlatie tussen de lengte van telomeren en diverse hersenziekten of weigeren. Enkele, ischemische hartziekte 7, Alzheimer's Disease 22, osteocarcoma bij vrouwen 23, longkanker bij rokers 24, familiale schildklierkanker 25 noemen, zijn diabetes 5, bloeddruk 26, verouderen 27 en dementie 28 gecorreleerd met een kortere telomeren , terwijl leeftijdsgebonden maculadegeneratie 7 hebben, colorectale kanker 43 en dood door infectieziekten, kanker, hart-of cerebrovasculaire ziekte 44 aangetoond dat er geen significante relatie met telomere lengte hebben. Daarnaast zijn bepaalde spanningen aangetoond samenvallen met kortere telomeren, bijvoorbeeld een verhoogde hoeveelheid ontstekingsfactoren, TNF-α en IL-6, gecorreleerd met kortere telomere lengte in leukocyten 29. Ook stressvolle lifestyles vanwege tijdrovende werkroosters, ploegendienst, of de aard van het werk, in het bijzonder een conciërge positie voor een chronisch ziek kind, zijn geassocieerd met verschillen in de lengte van telomeren. Dit suggereert dat stress kan vroegtijdige veroudering veroorzaken bij wijze van telomeerverkorting zonder voldoende herstel 30, 31. In een recente studie, met minder sociale relaties wordt ook geassocieerd met kortere telomeren 32. Preventie van telomere lengte verkorting is ook aangetoond dat zij met gezond leven keuzes, zoals het nemen van een dagelijkse multivitamine en niet roken 24, 33. Bovendien, deze studies hebben mogelijke klinische toepassingen voor meten telomeres, bijvoorbeeld als een niet-invasieve screening test voor de mogelijke ontwikkeling van cirrose 34. In andere gevallen, waar soortgelijke studies hebben aangetoond dat er geen significante correlatie (of een bescheiden correlatie) tussen een ziekte en de lengte van telomeren, hebben onderzoekers aangemoedigd om study andere nieuwe mechanismen voor cellulaire verval en de zieke toestand 7.
Deze studies hebben kracht in aantallen en het nut van het meten van de lengte van telomeren als een van de eerste stappen in het ontcijferen van het verouderingsproces hebben aangetoond. QRT-PCR methode Cawthon was geschikt voor dit doel omdat veel mensen kunnen vergelijken, vereist een minimale DNA, en kan betrouwbaar bewijs naar een relatie tussen telomere lengte cel gezondheid. Deze studies helpen om toekomstige veroudering onderzoeksinspanningen bepaalde genen, weefsels en cellulaire processen te sturen.
Onvermijdelijk na een significant verschil in de lengte van telomeren is opgemerkt, wordt een uitleg opgevraagd. Om antwoorden op deze vragen, studies over telomerase, het enzym dat betrokken is bij telomeren onderhoud en de regelgeving, zijn vastgesteld. PCR-gebaseerde telomerase-activiteit protocollen zijn aangeboden, waardoor aanvullende informatie naar: een. het bepalen van de contributions van de afbraak van telomeren en b. falen van succesvolle lengte van telomeren onderhoud van telomerase, waardoor een nieuw hoofdstuk aan het verhaal over de vergrijzing als geheel, in het bijzonder celsenescentie.
Hoewel qRT-PCR detecteert gemiddelde lengte van telomeren, en niet op individuele basis chromosoom, deze methode is een krachtig hulpmiddel voor het bewijs in de richting van hoe de cel reageert op veroudering en stress en geeft een inleiding op het verhaal van hoe we ouder worden. Interessant is dat deze informatie al geleid tot de lengte van telomeren meting in de kliniek voor het schatten van biologische leeftijd en zal ons begrip van het verouderingsproces en onvermijdelijk leiden tot preventie of vertraging en screening van veroudering en leeftijd-gerelateerde ziekte.
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer |
| Kwantitatieve Telomerase Detection Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 |
| LightCycler 480 SYBR Green I Meester, Kant-en-klare warme start reactie mix voor SYBR Green I-gebaseerde real-time PCR met behulp van de LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantitative Telomerase Detection | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
References
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
- Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
- Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 343-350 (2012).
- Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6 (5), 639-647 (2007).
- Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 822-829 (2011).
- Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7 (5), e38374 (2012).
- Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. , In Press (2012).
- Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315 (5820), 1850-1853 (2007).
- Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
- Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5 (9), e13048 (2010).
- Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer's Disease. Aging Disease. 3 (2), 164-170 (2012).
- Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730 (1-2), 59-67 (2012).
- Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33 (2), 203-207 (2003).
- O'Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
- Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47 (2), 89-99 (2002).
- Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30 (10), e47 (2002).
- O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13 (1), 3 (2011).
- Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17 (1), 1-15 (1995).
- Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47 (2), 160-163 (2012).
- Mirabello, L., Richards, eg, Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2 (1), (2011).
- Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D. 3rd, Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73 (2), 133-137 (2011).
- Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93 (10), 3950-3957 (2008).
- Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14 (2), 124-132 (2012).
- Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61 (8), 871-873 (2006).
- Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32 (11), 1055-1060 (2011).
- O'Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6 (5), e19687 (2011).
- Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68 (8), 582-589 (2011).
- Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres? Health Psychology. , In Press (2012).
- Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89 (6), 1857-1863 (2009).
- Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. , In Press (2012).
- Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. , In Press (2012).
- Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S. 3rd, Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
- Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610 (3), 245-261 (2010).
- Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3 (8-9), 979-998 (2004).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8 (8), 860-864 (2009).
- Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A (8), 792-799 (2010).
- Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
- Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63 (8), 809-812 (2008).
- Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18 (8), 2280-2282 (2009).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A (8), 860-864 (2009).
