Summary
、正確な短い、洗練された安価な方法は、定量RT-PCRを使用して、複数の組織や種のテロメアの長さを評価することが記載されている。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単なアッセイについて説明する。
Abstract
テロメアは、先端にDNA配列を繰り返している長さおよび人間が15,000塩基対の長さに達することができるで多様である染色体終了する。テロメアは、それぞれの細胞分裂における染色体の消耗のbioprotectiveメカニズムとして機能します。一定の長さでは、テロメアは、染色体の不安定性や細胞死につながる可能性があり、プロセスの複製を可能にするには余りにも短くなる。摩滅および伸び：テロメアの長さは、2つの対向する機構によって調節される。それぞれの細胞が分裂するように消耗が発生します。対照的に、伸びは染色体の末端に繰り返し配列を付加する酵素テロメラーゼによって部分的に変調される。この方法では、テロメラーゼは、おそらくエージングメカニズムを逆転し、細胞生存率を活性化させることができる。これらは、電池寿命を維持する上で不可欠な要素であり、細胞の老化を評価するために使用される。本稿で我々は、複数の組織ではテロメアの長さを評価するため、正確な短い、洗練された安価な方法を説明するsと種。この方法は、2つの主要な要素、テロメア配列のタンデムリピート及び試験した試料の差コピー数を検出する定量RT-PCRの感度を利用しています。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単なアッセイについて説明する。
Introduction
テロメアは染色体の末端にあり、DNA量体（TTAGGG）のシーケンスを繰り返している。各セルの複製では、これらの染色体の端部が短くなる。彼らはあまりにも短くなった場合、染色体テロメア末端融合、異常再結合、および劣化を受けることができる。したがって、十分なテロメア長の維持は、染色体の安定性および細胞保護38において主要な役割を果たしている。 DNA複製が染色体1-2の非常に最後まで続けることができないため、テロメアの長さのメンテナンスは、染色体の末端の近くで見つけた遺伝子のためにも重要です。これにより、テロメアの短縮の防止は、細胞の安定性を改善することができる。
多くの研究では、テロメアの長さは、このような3-4癌、糖尿病5、および心血管疾患6,7のように、生物の寿命や病気の状態と相関していることを報告している。さらに、短縮テロメアは過度のストレスやと関連しているおそらく時期尚早細胞老化と死9を促進することにより不健康なライフスタイル8、。一方、いくつかの研究は、疾患39、40、41に関連テロメアの長さと寿命と年齢との間に有意差がないことを見出した。
テロメアの短縮からの保護の細胞の生来のメカニズムの一つは、独自の酵素テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）を活性化することによるものである。この酵素とそのサブユニット、テロメラーゼRNA（TERC）、非コードRNA、染色体へのテロメア反復を追加するためのテンプレートとしてテロメアを使うには、10を終了します。テロメラーゼ活性は、細胞やその他のメカニズムのいくつかのタイプには存在しないが、テロメア長の維持に関与している、テロメラーゼ活性の増加は、テロメアの長さの増加と相関している。テロメラーゼ活性化は、細胞が損傷やストレスに応答し、早期老化および死を回避するメカニズムの一つとして確立されている。例えば、長いテlomeresは例外的な寿命11とアシュケナジユダヤ人集団において実証された、TERCまたはTERTにおける突然変異は、加齢に伴う疾患13に影響を及ぼすことが示されている致命的な疾患12、及びテロメラーゼのエピジェネティック制御に寄与することが示されている。その発見以来、テロメアの長さは、様々な動物モデルで同様にヒトの健康状態のためのバイオマーカーとして提案されているが、使用方法は、退屈な長いと高価だったので、これらの初期の研究は広く再現することは困難であったされています。 2002年と、さらに2009年にはチューニングでは、Cawthonが提案とテロメアの長さを評価し、さらに老化や病気19、細胞生物学の様々な側面での役割を調査するための新しい、正確、迅速かつ簡単PCRベースのプロトコルを示した。
研究のために正しいテロメア測定方法を選択することが不可欠です。現在、テロメアの長さを測定するために使用される様々な方法が、それぞれに独自のがあります長所と短所。 ：伝統的に、テロメアの長さを含む末端制限断片（TRFs）のサザンブロット分析を用いて測定される。 B、TRFsを得るためにテロメア繰り返しでカットしない制限酵素でDNAを消化。これらTRFsのサザンブロットは、テロメアプローブ14、37を使用して、平均TRFの長さを決定することによって行われます。この方法は、変動係数が小さいと非常に正確であるが、直接の尺度であり、長さ分布を測定するために有利であり得る、TRF分析は、高価で労働集約的であり、DNAの少なくとも3μgのを必要とする。この方法は、短いテロメアと長さの決定に鈍感であること（TTAGGG）nは、彼らは15、42が含まれているシーケンスのような原因で、プローブにより検出することができサブテロメアDNAによって混乱することができます。
テロメアの長さを測定する際、別の非常に正確な方法は、シングルテロメア伸長の長さの分析（STELA）、SINGLですDNAのみの少量を必要とする電子分子PCRに基づく方法。この方法では、プライマーは、染色体の末端にG-リッチオーバーハングを認識し、特定の染色体のテロメアを増幅1染色体上に独特なテロメア配列に結合するようになされる。得られた増幅は、その後、サザンブロットによって可視化される。この方法は、非常に正確であるという利点を有しており、短いテロメア16外れ値を検出することができる。すべてではない染色体がG-豊富な端を持っていると使用可能なサブテロメアシーケンス以来、残念ながら、テロメアの長さは、特定の染色体上に測定することができ、これらの測定は、セル15内のすべてのテロメアの長さを表していない可能性があります。
行われている別の方法は、テロメアの長さを検出するペプチド核酸（PNA）プローブの使用である。 in situハイブリダイゼーションの定量蛍光（Q-FISH）は、私たちがST中期、時のテロメアを視覚化することができますその大きさに比例してPNAプローブとテロメアのaining、特定の染色体間のテロメアの比較を可能にします。この方法はまた間期における細胞のために使用することができるが、ここに明確な染色体のテロメアの長さのために、17老化又はまれに分裂細胞のテロメアの長さを測定する際の制限を導入し、これを検出することができない。フローFISHはなく、フローサイトメトリーを使用しており、現在は臨床の現場で血液細胞のテロメアの長さを測定するための最も感度の高い方法ですが、高度に熟練した技術者が18必要です。
現在、私たちの研究室で平均テロメアの長さを測定するための標準的な方法は、精度の感度を活用し、定量リアルタイムPCRやす。この方法は、他のように製造されたであろうプライマーダイマーに由来する生成物の合成を回避する新規なプライマーの開発によってテロメアの長さを測定するために可能になったテロメアの繰り返し性質に起因tandardアッセイ。このアッセイのために、テロメア長の測定は、単一コピー遺伝子数にT / S比は、テロメアリピートコピー数で表される。 PCRの開始段階でテロメアの長さとDNAに結合する標識されたテロメアプライマーの数との間の直接的な比例関係があるので、T / S比は、テロメアの長さに正比例する。 T / S比は、Ctは、試料を蛍光はテロメアプライマーおよびプライマーSCG 19と試料との間に、ベースライン蛍光上記のいくつかの標準偏差であるしきい値を超えて蓄積れる小数サイクル数の差を比較することによって測定される。この方法は、染色体の重複またはコピー数の変化15の場合には、不正確な測定につながる可能性テロメアの長さの、その間接的な測定は、例えばのために批判されている。また、研究間の比較では、多くの場合、ジですfficultが、標準的なオリゴマーは、絶対的なテロメアの長さ20を測定するために開発されてきた。この方法は、モノクロマルチプレックス定量PCRアッセイを用いて、Cawthonによって時改善進めたた。このアッセイでは、PCRは、プライマー二量体の結合を避けるために、最初の数サイクルの間、より低い温度で実行され、テロメア及び制御遺伝子がさらにエラーを回避するために同一のPCRチューブ中で分析した。得られたテロメア長の測定は非常TRFsのサザンブロット分析によって測定テロメアの長さと相関し、より高精度15、19、36であった。現時点では、定量RT-PCRは、大きなサンプルサイズをテストするために使用できる唯一の便利な方法であり、唯一の遂行するために少量のDNAを必要とします。この方法の重要な部分は、それが正しく行われている場合に、この方法は、テロメアの長さに関する貴重な比較情報を提供することができるように、包括的な品質管理対策である。さらに、この方法は、測定用白血球を超えての使用に適合された異なる組織の様々な42でテロメアの長さ。
さらに、さらにテロメア長の維持と対向する2つの効果（テロメラーゼ酵素による複製および伸長の間すなわちテロメア短縮）との間の相互作用の背後にある生物学を理解するために、私たちは、テロメラーゼ活性を測定し、追加のアッセイとテロメアの長さの方法を伴う。
この目的のために、我々は、テロメアリピート増幅プロトコールにおいて、in vitroアッセイを使用した。簡単に言えば、溶解、保存、酵素的に活性な細胞がテロメラーゼを用いたオリゴヌクレオチドを基板上にテロメア反復を合成し、製品はSYBRグリーンの存在下でPCRを用いて増幅した。結果は、試料および対照のCtのしきい値を比較することによって分析した。テロメラーゼは、熱に敏感な酵素であるため、追加の熱制御治療を各試料21と一緒に実行されます。
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Protocol
1。テロメアの長さプロトコル19
- DNA単離法
ほとんどのDNAの単離方法を用いることができる。私たちの研究室は、血液ソースのキアゲンDNeasyキット（＃69506）を好む。例えば口腔または他のソースとして、DNAの供給源に応じて、異なる分離法を用いることができる。
- プライマー：
必要になるまで全てのプライマーは、PCRグレード水に100pmoles/μlのストック濃度に希釈し、-20℃で保存されています。プライマーのワーキング株式は新鮮な作られており、20℃で保存する短期間（数ヶ月）のためのCの標準的なプライマーは、キャラハンらで説明したように、SCG、テロメアとβ-グロビンのために使用された20は、 。
プライマー配列：
Telo 1：5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '
Telo 2：5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1：5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2：5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '
注：プライマーは10pmoles/μlの作業濃度、反応前のミックスに追加するに希釈されています。
- ゲノムDNAの段階希釈：
TeloためのゲノムDNAおよびシングルコピー遺伝子（SCG）の連続希釈アッセイのための標準的なCT値曲線を生成するために作成されます。使用されるゲノムDNAは、血液サンプル由来のリンパ球から抽出した。これらの希釈物を同じゲノムDNAを用いた段階希釈の二組を生成するために1.68の係数で各濃度にPCRグレードH 2 0でDNAを希釈することによって作成される。出発濃度は、試行錯誤に基づいて最適化されており、異なる試薬、器具、他の種由来のDNA、細胞タイプ、および使用さSCGを使用するときに調整する必要があるかもしれません。
注：ゲノムDNAを用いて連続希釈を穏やかに混合し、1時間のbefoに少なくとも15分間待つことによって作られている次の希釈にDNAを取って再。各希釈は解離するゲノムDNAのための時間を必要とします。長期保存、-80℃で保管するためのPCRストリップにアリコート段階希釈℃で各PCRストリップを解凍し、DNAを損傷する恐れがあり、凍結融解サイクルを避けるために、一度使用されている。
- RT-PCRの反応セットアップ
使用楽器：Roche480ライトサイクラー
試薬：ロシュライトサイクラーSYBRグリーン
10 ng /μLの最終濃度を試験DNAサンプルを希釈する。私たちは、ナノドロップまたは量子ビットを用いた濃度をテストします。我々はさらに10ng/μlから最終5ng/μlにDNAを希釈。我々は再び集中をテストしていない。
反応成分：
| TELO | 1X | SCG | 1X | |
| H 2 0 </ TD> | 6μL | H20 | 6μL | |
| Telo 1 | 0.2μL | SCG 1 | 0.6μL | |
| Telo 2 | 1.8μL | SCG 2 | 1.4μL | |
| RXNミックス | 10μlの | RXNミックス | 10μlの | |
| DNAまたはシリアル希釈 | 2μlの | DNAまたはシリアル希釈 | 2μlの |
注：マスターミックスは、DNAなしで、5％〜10％を超えるとなる。
TeloとSCGの両方が次のプログラムを使用して、同じプレート上で同時に実行されています。精度をテストするには、少なくとも3つの各サンプルの複製および制御が実行されるべきである。使用したプライマーのばらつきが結果に影響を与えることができる。 Roche480ライトサイクラーと私たちのプライマーで、次のように我々のプロトコルが動作するように最適化されています。
でitial変性
10分間変性95℃
サイクリング
95℃で10秒保持
60°C 5秒間ホールド
72℃11秒のホールドとシングル買収
必要に応じて45から55回繰り返します
2。定量テロメラーゼ検出（QTD）プロトコル（アライドバイオ社カタログ番号MT3012によってQTDキットに基づく）
準備を抽出
- ペレットは、細胞または組織。
- 1×PBSで1回洗浄します。
- Repelletと削除1X PBS。*
- ごとに10 5〜10 6細胞または組織の40-100 mgのための1つのxの溶解緩衝液200μlの細胞ペレットを再懸濁します。
- 氷上で30分間インキュベートする。
- 4℃で30分間12,000 xgでサンプルをスピンダウン
- 新鮮なチューブに上清160μlのを転送し、タンパク質濃度を決定する。
- アリコートとクイック·フリーズドライアイス/エタノールの残りのエキス、-80℃で保存
T中*彼の状態は、凍結細胞または組織におけるテロメラーゼは、少なくとも1年間は安定です。使用するために解凍すると、1×溶解緩衝液中、直ちに細胞を再懸濁します。
2.1。アッセイコントロール
熱不活性化制御：各サンプルについて、事前のテロメラーゼ活性アッセイに10分間85℃でインキュベートすることにより、追加の制御エキスを扱う加熱。
TSRコントロールテンプレートの標準曲線：標準の曲線を生成するキットに含まれているテロメアプライマーと同様に配列にTSR、オリゴヌクレオチドの希釈液を用いた定量的リアルタイムPCRを行います。
- 溶解緩衝液で在庫TSR濃度の1時05分の段階希釈（0.5 amoles /μL）を準備
- ストック濃度を含め、各TSR希釈液1μlを用いたテロメラーゼ検出標準アッセイを行う。これらの希釈物を、少なくとも2週間、4℃で保存することができる。
2.2。テロメラーゼ活性アッセイQTDリアルタイムPCR使用
- 各サンプルについて、PCRチューブまたは薄肉PCRプレート（総量25.0μL）に以下を追加します。
- 2×QTDプレミックスの12.5μlの
- 細胞または組織抽出物の1.0μL
- PCR修飾水11.5μL
- 徹底的にミックス
- 次のプログラムに係るプログラムのリアルタイムPCR検出システム。
- 25℃で20分（テロメラーゼ反応）のための
- 10分（PCR初期活性化ステップ）、95°C
の35〜40サイクル：
- 95℃で30秒間（変性）
- 60℃で30秒間（アニーリング）
- 72℃で30秒間（拡張子） - サーマルサイクラーでPCRチューブをセットし、サイクリングプログラムをスタートする。
- サイクル終了後の閾値サイクルまたはC T値を収集します。閾値サイクルは、ΔRnが統計的に有意な増加が最初に検出されるサイクルである。
2.3。データ解析
- GeneratEA標準曲線はC Tの測定値を使用し、テロメラーゼ活性を比較します。
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Representative Results
テロメアの長さ定量RT-PCRアッセイの例を図1に示されている。左上のパネルで、赤と緑でラベルサンプルは、96ウェルプレート上でテストされた被写体の位置を表しています。右上のパネルでは、増幅曲線が示されています。各被験者は、三重で行われる2つのアッセイ（テロメアとシングルコピー遺伝子）によってテストされています。選択された個体の2つのアッセイで製造異なるDNAコピー数のために、蛍光が検出されるまでのサイクル数は、指数関数曲線がアッセイの間で異なる達する。高いコピー数のチューブ（ すなわちテロメアアッセイ）、蛍光検出の量は、27サイクル後に、その指数曲線に達する。行の2番目のセットはゲノムで唯一つのコピーを持っているシングルコピー遺伝子（SCG）を表し、したがって、はるかに少ない部数テロメアサンプルよりを持っており、唯一の31サイクル後に、その指数曲線に達する。茶色の線は標準を表す既知の試料濃度の連続希釈に基づいているカーブ。右下のパネルは、標準曲線点（直線が最適な連続希釈を示す）の対数濃度を表す。この直線は、テストチューブ（左下のパネル）の濃度を計算するために使用されている。最初に定量RT-PCRの結果、Cawthonの手の中に19、私たち等によって繰り返さは、末端制限断片長のアッセイにより得られたものと相関することが示されている。 One T / S比ユニット（SCGランの定量RT-PCRサイクルにわたってテロメアランの定量RT-PCRサイクルは）白血球42で4,270塩基対の平均テロメアの長さに相当します。この例ではSCGアッセイによるテロメアアッセイに定量RT-PCRサイクルを分割すると3,715 BPの平均に相当する、0.87の比率となった。この測定では、単独のテロメアの長さで構成されており、サブテロメア領域を含んでいません。
定量RT-PCRはここで非常に少ない試料調製を関与を明らかにした。この例（ 図1）において、定性的ならびに定量的な差（連続希釈との間の三重コンコーダンスで表される）2つのアッセイの間に観察された。このテストから計算された結果は、65歳の被験者の中間のテロメアの長さを示しています。
テロメラーゼ活性アッセイの結果とテロメラーゼ活性およびテロメアの長さの間の可能な関係の一例を図2によって示される。我々の予備的な結果は、より長いテロメアの長さを増加テロメラーゼ活性に関連付けることができることを示している。
図1図1は、AQからの典型的な出力を示しテロメアの長さのためにRT-PCRは、アッセイ。左上隅には、トリプリケートで、96ウェルプレートに配置された試料を示す。左下隅には、T / Sの値を計算するために使用されている各サンプルに対して計算された濃度とCT値を示します。右上には、結果を視覚化するために使用される増幅曲線（CYBR緑色から検出された蛍光対サイクル数）のグラフである。右下に、段階希釈制御のCT値に対するログ濃度の標準曲線は、グラフ化され。直線は、段階希釈を正確に測定され、ロードされたことを確認します。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。テロメラーゼ活性とテロメラーゼ長の定量RT-PCRアッセイ、<からの予備的な結果を使用強い>図2は、Ct値に よって測定される直接、重大なT / S比で測定したテロメアの長さとの間の関係（pは= 0.008）と、テロメラーゼ活性を示します。
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Discussion
テロメアの長さはストレスや老化細胞を研究するためのユニークな細胞のマーカーを提供し、老化のメカニズムについての洞察を提供しています。高齢化におけるその役割が最初に示唆されていたので、研究の多くは、年齢にテロメアの長さ、長寿、加齢に伴う疾患、癌、ストレスに関連行われている。何十年もの間、テロメアの長さ測定のゴールドスタンダードは、サザンハイブリダイゼーションを使用して、端末制限断片分析だった。しかし、最近になってCawthonにより、手頃な価格の迅速、かつ実行しやすい方法が進化してきました。定量リアルタイムPCRを使用して、Cawthonは大きなサンプルサイズについての研究が可能となり、テロメアの長さを測定するための有用な代替手段を提供する。
定量RT-PCRを用いて、多くの研究は、テロメアの長さ、特に結果、加齢に伴う種々の疾患の関係を調べるために行われている。より具体的には、この方法は、研究者が大きな疫学学生の実行を許可されているテロメアの長さや種々の疾患の間の相関関係を実証するか拒否集団で死ぬ。少数の、虚血性心疾患7、アルツハイマー病22、女性23、喫煙者24の肺がんでosteocarcomaに名前を付けるには、家族性甲状腺27老化癌25、糖尿病5、血圧26と、認知症28は短いテロメアの長さと相関している、加齢性黄斑変性症7、結腸直腸癌43、および感染性疾患、癌、心臓または脳血管疾患による死亡44は、テロメアの長さとの重要な関係を持たないことが示されているが。さらに、特定の応力は、例えば、短いテロメアの長さ、炎症マーカー量の増加、TNF-αとIL-6と一致することが示されている、白血球29が短いテロメアの長さと相関している。また、ストレスの多いLIF時間のかかる作業スケジュール、シフト勤務、または作業の性質estylesは、慢性的な病気の子供のための特定の管理人の位置に、テロメアの長さの違いと関連している。これは、ストレスが十分回復30、31なしでテロメアの短縮により早期老化を引き起こす可能性を示唆している。最近の研究では、少数の社会的な関係を持つことも、短いテロメア32に関連付けられています。テロメア長短縮の防止はまた、毎日マルチビタミンではなく喫煙24、33を取るなど健康的な生活の選択肢、と相関することが示されている。さらに、これらの研究は肝硬変34の可能な開発のための非侵襲的スクリーニング検査としては、例えば、測定テロメアの可能な臨床用途を明らかにした。同様の研究は、疾患とテロメアの長さの間には有意な相関（または控えめな相関）を示さなかった他のケースでは、研究者は、STに励まされています細胞の減少や病的状態7 UDY他の新規メカニズム。
これらの研究は、数字で強さを持っており、老化プロセスを解読の最初のステップの一つとして、テロメアの長さを測定する有用性を実証している。それは多くの人を比較することができますので、Cawthonの定量RT-PCR法は、この目的のために有用であった、最小限のDNAを必要とし、テロメアの長さと細胞の健康との関係に向けて信頼性のある証拠を与えることができます。これらの研究は、特定の遺伝子が、組織および細胞プロセスへの将来の高齢化の研究努力を操縦するのに役立ちます。
テロメアの長さに有意な差が認めれた後、必然的に、説明が照会されます。答えにこれらの質問、テロメラーゼの研究、テロメア維持とその調節に関与する酵素は、確立されている。 PCRベースのテロメラーゼ活性プロトコルは向かって追加の情報を与えて、提供されています。続きを決定テロメアの劣化のributionsと、b。テロメラーゼによって成功したテロメア長の維持の失敗は、このように特定の細胞老化で、全体として高齢化の話に別の章を提供しています。
定量RT-PCRは、平均テロメアの長さを検出して、ではない個々の染色体に基づいていますが、この方法では、細胞が老化やストレスに反応し、どのように私たちの年齢の話にプリアンブルを提供する方法に向けた証拠のための強力なツールです。興味深いことに、この情報はすでに生物学的年齢を推定するための診療所におけるテロメア長測定につながっていると老化プロセスの我々の理解を促進し、必然的に老化や加齢に伴う疾患の予防または遅延とスクリーニングにつながる。
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 |
| 定量的なテロメラーゼ検出アライドバイオ | MT3012 | |
| キアゲンDNeasyキット | キアゲン | 69506 |
| ライトサイクラー480 SYBR Green Iをマスター、ライトサイクラー480インストゥルメントを使用するSYBR Green IをベースのリアルタイムPCR用のすぐに使用できるホットスタート反応ミックス | ロシュ·ダイアグノスティックス | 4707516 |
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantitative Telomerase Detection | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
References
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