Telomerlängd och telomerasaktivitet, A Yin och Yang av cellåldrande

Summary

En noggrann, kort, sofistikerad och billig metod beskrivs som bedömer telomerlängd i flera vävnader och arter med QRT-PCR. Dessutom kommer vi att beskriva en enkel analys för att bedöma telomerasaktiviteten som ett komplement ryggrad test för telomerlängd.

Abstract

Telomererna upprepande DNA-sekvenser vid spetsen kromosomernas ändar som är olika i längd och i människor kan nå en längd av 15.000 baspar. Telomeren fungerar som en bioskyddande mekanism av kromosom avgång vid varje celldelning. Vid en viss längd, telomererna blir för kort för att möjliggöra replikering, en process som kan leda till kromosom instabilitet eller celldöd. Telomerelängden regleras av två motsatta mekanismer: attrition och förlängning. Slitage uppstår eftersom varje cell delar. I motsats härtill är töjning delvis moduleras av enzymet telomeras, som lägger repeterande sekvenser till ändarna av kromosomerna. På detta sätt kunde telomeras vända möjligen en åldrande mekanism och vitaliserar cellernas livskraft. Dessa är avgörande faktorer för att upprätthålla cellens liv och används för att bedöma cellulära åldrandet. I detta manuskript kommer vi att beskriva en exakt, kort, sofistikerad och billig metod för att bedöma telomerlängd i flera vävnaders och arter. Denna metod tar fördel av två viktiga delar, tandemupprepningsregionen av telomer sekvensen och känsligheten hos QRT-PCR för att detektera antalet differentiella kopia av prover. Dessutom kommer vi att beskriva en enkel analys för att bedöma telomerasaktiviteten som ett komplement ryggrad test för telomerlängd.

Introduction

Telomererna upprepande DNA hexamer (TTAGGG) sekvenser som finns i ändarna av kromosomerna. I varje cell replikering, dessa kromosom ändarna förkortas. Om de blir för kort kan kromosomer genomgå telomer end fusioner, aberrant rekombinationsställen, och nedbrytning. Således tillräcklig telomerlängd underhåll spelar en viktig roll i kromosom stabilitet och cellskydd ^38. Telomerlängd underhåll är också avgörande för gener som finns nära ändarna av kromosomer, eftersom DNA-replikation inte kan fortsätta till slutet av kromosomer ^1-2. Följaktligen kan förebyggande av telomerförkortning förbättra cellernas stabilitet.

Ett flertal studier har rapporterat att telomerlängd är korrelerad med en organisms livslängd och sjukt tillstånd, t.ex. vid cancer ^3-4, diabetes ⁵ och hjärtkärlsjukdom ^6,7. Dessutom har förkortade telomerer förknippats med överdriven stress ellerohälsosam livsstil ^8, kanske genom att främja tidig cellernas åldrande och död ^9. Å andra sidan har vissa studier funnit att det inte finns någon signifikant skillnad mellan telomerlängd och livslängd och åldersrelaterad sjukdom ^{39, 40, 41.}

En av cellens inneboende mekanismer för skydd mot telomerförkortning är genom att aktivera sin egen enzymet transkriptas telomeras omvänt (tert). Detta enzym och dess subenhet, telomeras RNA (TERC), en icke-kodande RNA, använd telomeren som en mall för att lägga till telomer upprepningar till kromosom ändar ^10. Även telomerasaktivitet är frånvarande från flera typer av celler och andra mekanismer är involverade i telomerlängd underhåll, är ökad telomerasaktivitet korrelerade med ökad telomerlängd. Telomeras aktivering har etablerats som en av de mekanismer som gör att celler svarar på skada och stress och undvika för tidigt åldrande och död. Exempelvis längre telomeres visades i en population av Ashkenazi judar med exceptionell livslängd ^11, har mutationer i TERC eller tert visats bidra till dödlig sjukdom ^12, och epigenetisk reglering av telomeras har visat sig ha effekt på åldersrelaterade sjukdomar ^13. Sedan dess upptäckt, har telomerlängd föreslagits som en biomarkör för hälsotillståndet i olika djurmodeller samt hos människor, men dessa tidiga studier var svåra att allmänt replikera eftersom metoden som användes var tråkiga, långa och dyra. Under 2002 och ytterligare stämda 2009 föreslog Cawthon och demonstrerade en ny, korrekt, snabb och enkel PCR-baserat protokoll för att bedöma telomerlängd och ytterligare undersöka dess roll i olika aspekter av cellbiologi, åldrande och sjukdom ^19.

Välja rätt metod telomere mätning för en studie är nödvändig. För närvarande finns det olika metoder som används för att mäta telomerlängd, alla med sin egenfördelar och nackdelar. Traditionellt är telomerlängd mäts med Southern blot-analys av fragment terminal begränsning (TRFs), vilket innebär: en. uppslutning av DNA med restriktionsenzym som inte skär i telomere upprepningar för att få TRFs, b.. Southern blöt av dessa TRFs görs genom bestämning av medelvärdet TRF längd med användning av en telomer sond ^{14, 37.} Även om denna metod är mycket exakt med en liten variationskoefficient, är ett direkt mått, och kan vara fördelaktigt för mätning längdfördelning är TRF analys kostsamt, arbetskrävande och kräver minst tre ig DNA. Denna metod är också okänslig för korta telomerer och längd bestämning kan förväxlas med subtelomeric DNA, vilket kan detekteras av sonden på grund av (TTAGGG) n liknande sekvenser de innehåller ^{15, 42.}

En annan mycket noggrann metod för att mäta telomerlängd är singel Telomere Förlängning Längd Analysis (STELA), en single molekyl PCR-baserad metod som endast kräver en liten mängd DNA. I denna metod används primrar görs för att erkänna det G-rika överhäng i slutet av kromosomer och att binda till en unik subtelomeric sekvens på en kromosom, som förstärker telomeren av en specifik kromosom. Den erhållna amplifieringen visualiseras sedan genom Southern blöt. Denna metod har fördelen av att vara mycket noggrann och kan upptäcka korta utanförliggande telomerer ^16. Tyvärr, eftersom inte alla kromosomer har G-rika ändarna och en användbar subtelomeric sekvens, kan telomerlängd endast mätas på specifika kromosomer, och dessa mätningar får inte representera längden på alla telomerer i cellen ^15.

En annan metod som har utövats är användningen av peptidnukleinsyra (PNA) prober för att detektera telomerlängd. Kvantitativ Florescence in situ hybridisering (Q-FISH) tillåter oss att visualisera telomererna under metafas, där staining av telomerer med en PNA-sonden i förhållande till deras storlek tillåter jämförelse av telomerer mellan specifika kromosomer. Även om denna metod kan också användas för celler i interfas, här den telomerlängd för distinkta kromosomer inte kan upptäckas, som inför en begränsning vid mätning av telomerlängd i åldrande eller sällan delande celler ^17. Flow FISH använder istället flödescytometri och är för närvarande den mest känsliga metoden för att mäta telomerlängd i blodceller i klinisk miljö, men kräver högt kvalificerade tekniker ^18.

För närvarande tar standardmetoden för mätning av genomsnittlig telomerlängd i vårt labb fördel av precision, känslighet och enkel kvantitativ realtids-PCR. Denna metod blev möjligt för mätning av telomerlängd genom utveckling av nya primrar som undviker syntesen av primer-dimer-härledda produkter, som annars skulle ha producerats i somtandard analys på grund av den repeterande karaktären hos telomerer. För denna analys utförs mätningen av telomerlängd representeras av T / S-förhållandet, telomeren upprepa kopietalet till singel-kopia gen nummer. Eftersom det finns ett direkt proportionellt förhållande mellan telomerlängd och antalet märkta telomer primrar bindning till DNA under början stadier av PCR, är T / S-förhållandet direkt proportionell mot telomerlängd. T / S-förhållandet mäts genom att jämföra skillnaden i Ct, korsar fraktionerad cykelantalet vid vilken provet ackumulerade blomningstid en tröskel som är flera standardavvikelser över baslinjen blomningstid, mellan prover med telomere primers och SCG primers ^19. Denna metod har kritiserats för dess indirekt mätning av telomerlängd, vilket kan leda till felaktiga mätningar, till exempel i fallet med kromosom dubbelarbete eller kopiera variationer nummer ^15. Dessutom är jämförelsen mellan studier ofta difficult, men standard oligomerer har utvecklats för att mäta absolut telomerlängd ^20. Denna metod har furthered förbättrats av Cawthon, med användning av en monokrom assay multiplex qPCR. Vid denna analys var PCR köras vid lägre temperaturer för de första få cykler för att undvika primerdimerer bindande och telomeren och kontroll-genen analyserades i samma PCR-rör för att ytterligare undvika fel. De resulterande telomerlängd mätningar korreleras starkt med telomerlängd mätt med Southern blot-analys av TRFs och hade högre noggrannhet ^{15, 19, 36.} Just nu är QRT-PCR den enda bekväm metod för att testa stora provstorlekar och endast kräver en liten mängd DNA för att utföra. En viktig del av denna metod är omfattande åtgärder för kvalitetskontroll, så att när det är gjort på rätt sätt, kan denna metod ge värdefull jämförande information om telomerlängd. Dessutom hade denna metod är anpassad för användning utöver leukocyter för att mätatelomerlängd i en variation av olika vävnader ^42.

Dessutom, i syfte att ytterligare förstå biologin bakom telomerlängd underhåll och interaktioner mellan de två motsatta effekter (dvs. telomerförkortning vid replikering och töjning av telomeras enzym), tillsammans vi den telomerlängd metoden med en ytterligare analys som mäter telomerasaktivitet.

För detta ändamål använde vi en telomerisk protokoll Repeat Förstärkning, en in vitro-analys. Kortfattat lyseras, konserverade, enzymatiskt aktiva celler syntetiserade telomeric upprepningar på en oligonukleotid substrat med telomeras, och produkterna förstärktes med PCR i närvaro av SYBR Green. Resultaten analyserades sedan genom att jämföra prov-och kontroll-Ct-tröskelvärden. Eftersom telomeras är ett värmekänsligt enzym, är en ytterligare värmebehandlas kontroll löpa parallellt varje prov ^21.

Protocol

Ett. Telomerlängd protokoll ¹⁹

1. DNA-isolering

De flesta DNA-isolering metoder får användas. Vår Lab föredrar Qiagen DNeasy Kit (# 69506) för blod källor. Beroende på källan av DNA, såsom buckala eller andra källor, kan en annan isolering metod användas.

2. Primrar:

Alla primers späds ut till en stamkoncentration av 100pmoles/μl i PCR-kvalitet vatten och lagrades vid -20 ° C fram till användning. Arbetande lager av primrar görs färskt och lagras vid 20 ° C under en kort tid (några månader.) Standard primers användes för telomerer och β-globin, SCG, såsom beskrivs i O'Callaghan et al. ²⁰ .

Primer sekvenser:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Obs: Primrar späds till en arbetskoncentration av 10pmoles/μl, före tillsats till reaktionsblandningen.

3. Serieutspädning av genomiskt DNA:

Serieutspädningar av genomiskt DNA för Telo och enkelkopiegen (SCG) är skapade för att generera en standardkurva Ct värde kurva för analysen. Det genomiska DNA som användes extraherades från lymfocyter från blodprover. Dessa spädningar är skapade genom utspädning DNA med PCR-kvalitet H ₂ 0 till varje koncentration med en faktor av 1,68 för att ge de två uppsättningarna av serieutspädningar med användning av samma genomiska DNA. Utgångspunkterna koncentrationer har optimerats utifrån trial and error och kan behöva justeras vid användning av olika reagenser, instrument, DNA från andra arter, celltyper och SCG används.

Obs: Seriespädningar användning genomiskt DNA görs genom att blanda försiktigt och väntar minst 15 min till en timme before ta DNA för nästa spädning. Varje utspädning kräver tid för genomisk DNA att dissociera. För långtidsförvaring, alikvot serieutspädningar till PCR-remsor för lagring vid -80 ° C. Varje PCR strip tinas och används en gång för att undvika cykler frysa tina som kan skada DNA.

4. Reaktion inställning för RT-PCR

Instrument som används: Roche480 Ljus Cycler

Reagens: Roche Ljus cykler SYBR-grön

Späd prover som test-DNA till en slutlig koncentration av 10 ng / ul. Vi testar koncentration med Nanodrop eller Qubit. Vi späd ytterligare DNA från 10ng/μl till final 5ng/μl. Vi testar inte koncentrationen igen.

Reaktionskomponenter:

TELO	1x		SCG	1x
H 2 0 </ Td>	6 | il		H20	6 | il
Telo en	0,2 | il		SCG ett	0,6 | il
Telo 2	1,8 | il		SCG 2	1,4 | il
Rxn mix	10 pl		Rxn mix	10 pl
DNA eller seriell spädning	2 pl		DNA eller seriell spädning	2 pl

Obs: Master Mix görs utan DNA och med ett överskott av 5% till 10%.

Både Telo och SCG drivs tillsammans på samma plattan med hjälp av följande program. För att testa om precision, minst tre replikat av varje prov och kontroll ska köras. Variationer i de använda primrarna kan påverka resultaten. Vår protokoll har optimerats för att fungera på följande sätt på Roche480 Ljus Cycler och våra primers.

Iitial denaturera
10 min denaturera 95 ° C
Cykling
95 ° C 10 sek hold
60 ° C 5 sek hold
72 ° C 11 sek hold och enskilda förvärvet
Upprepa 45 till 55 gånger så krävs

2. Kvantitativ Telomerase Detection (QTD) Protokoll (Baserat på QTD Kit från Allied Biotech, Inc. Kat. Nr MT3012)

Extrahera Framställning

1. Pellets celler eller vävnad.
2. Tvätta en gång med 1 x PBS.
3. Repellet och avlägsna 1x PBS. *
4. Resuspendera cellpelleten i 200 | il av 1 x lyseringsbuffert för varje 10 ⁵ -10 ⁶ celler eller 40 till 100 mg av vävnad.
5. Inkubera på is under 30 minuter.
6. Centrifugera ner provet vid 12.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C.
7. Överför 160 ìl av supernatanten till ett nytt rör och bestämma protein koncentration.
8. Fördela och snabb-frysa kvarvarande extraktet på torris / etanol, förvara vid -80 ° C.

* I thans tillstånd, är telomeras i frysta celler eller vävnader stabil under minst ett år. När tinas för användning, återsuspendera cellerna omedelbart i 1 x lyseringsbuffert.

2.1. Analyskontroller

Värmeinaktivering kontroll: För varje prov, värmebehandla en ytterligare kontroll extrakt genom inkubation vid 85 ° C under 10 min före telomerasaktivitet analys.

Standardkurva för TSR styrmall: Utför kvantitativ realtids-PCR med utspädningar av TSR, en oligonukleotid med en liknande sekvens till telomere primers som medföljer satsen för att generera en standardkurva.

1. Förbered 1:05 spädningar av beståndet TSR koncentration (0.5 amoles / mikroliter) med lyseringsbuffert
2. Utför telomeras mätbar standard med 1 pl av varje TSR utspädning, inklusive stamkoncentration. Dessa spädningar kan lagras vid 4 ° C i minst 2 veckor.

2.2. Telomerasaktivitet Assayanvändning QTD Real-Time PCR

1. För varje prov, lägg till följande i en PCR-rör eller tunnväggiga PCR-platta (total volym 25,0 l):
   • 12,5 pl 2 x QTD förblandning
   • 1,0 pl av cell eller vävnad Extract
   • 11,5 | il av PCR-Kvalificerad Vatten
2. Blanda noggrant
3. Program realtids-PCR Detection Systems enligt nedanstående program:
   - 25 ° C under 20 min (telomeras reaktion)
   - 95 ° C under 10 min (PCR initialt aktiveringssteg)
   35-40 cykler av:
   - 95 ° C under 30 sekunder (denaturering)
   - 60 ° C under 30 sekunder (annealing)
   - 72 ° C under 30 sekunder (förlängning)
4. Placera PCR-rören i termocyklern och starta cyklingen programmet.
5. Samla tröskeln cykel eller C _T-värde efter cykler finish. Tröskeln cykel är cykel vid vilken en statistiskt signifikant ökning av ARn detekteras först.

2.3. Data Analysis

1. Generatea standardkurva använder C _T avläsningar och jämför telomerasaktivitet.

Representative Results

Ett exempel på en telomerlängd QRT-PCR-analysen visas i figur 1. På den övre vänstra panelen, prover märkta i rött och grönt representerar placeringen av de testade ämnena på 96-brunnar. På den övre högra panelen, är amplifieringskurva påvisas. Varje ämne testas av två analyser (Telomere och enkelkopiegen), vilket görs i triplikat. På grund av olika DNA-kopia siffror som produceras i de två analyser av utvalda personer, når antalet cykler tills blomningstid upptäckt dess exponentiell kurva skiljer mellan analyser. I högre rören kopietal (dvs. Telomer analys), når mängden fluorescens detektion dess exponentiell kurva efter 27 cykler. Den andra uppsättningen linjer representerar enkelkopiegen (SCG) som bara har ett exemplar i genomet, och har därmed mycket mindre kopior än de telomere prover och når sin exponentiell kurva först efter 31 cykler. De bruna linjen representerar den standardkurva som är baserad på en serieutspädning av kända koncentration i proverna. Den undre högra panelen representerar log-koncentration av standardkurvan punkter (en rak linje visar en optimal serieutspädning). Denna linjära kurva används för att beräkna koncentrationen av de testade rören (nedre vänstra panelen). De QRT-PCR-resultat, initialt i Cawthon händer ^19, och upprepas av oss och andra, har visat sig vara korrelerade med de som erhållits genom terminalen begränsning fragment length analys. En T / S-förhållande enhet (QRT-PCR-cykler av telomeren överkörd QRT-PCR-cykler av SCG run) är ekvivalent med en genomsnittlig telomerlängd av 4270 bp i leukocyter ^42. Dividera QRT-PCR-cykler för Telomere analysen av SCG analys i vårt exempel resulterade i ett förhållande av 0,87, vilket motsvarar ett genomsnitt på 3,715 bp. Denna mätning består av telomerlängd ensam och inkluderar inte subtelomeric regioner.

Den QRT-PCR visade här involverade väldigt liten provberedning. I detta exempel (figur 1), har såväl kvalitativa som kvantitativa skillnader (representerad av den seriella utspädning och överensstämmelsen mellan de tre exemplar) observerades mellan de två analyserna. Beräknas resultatet från detta test visar mellanliggande telomerlängd för ett 65 år gammalt ämne.

Ett exempel på analysresultat telomerasaktivitet resultat och det möjliga förhållandet mellan telomerasaktivitet och telomerlängd framgår av figur 2. Våra preliminära resultat visar att en längre telomerlängd kan vara förknippade med ökad telomerasaktivitet.

Figur 1. Figur 1 representerar den typiska utsignalen från aqRT-PCR-analys för Telomerelängden. Det övre vänstra hörnet visar samplen anordnade i en 96-brunnars platta i tre exemplar. Den nedre vänstra hörnet listar de beräknade koncentrationerna och Ct-värden för varje prov, som används för att beräkna T / S-värden. Den övre högra är ett diagram över förstärkningen kurvan (antal cykler kontra blomningstid detekteras från CYBR grön), som används för att visualisera resultaten. På den nedersta höger, är den standardkurva för Log koncentration kontra CT värde serieutspädningen kontrollen plottas. En rak linje bekräftar att serieutspädningen noggrant mättes och laddad. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Använda preliminära resultat från QRT-PCR-analys för telomerasaktivitet och telomeras längd <strong> Fig. 2 visar en direkt, signifikant samband (p = 0,008) mellan telomerlängd, mätt med T / S-förhållandet, och telomerasaktivitet, mätt med Ct-värdet.

Discussion

Telomerlängd ger en unik cellulär markör för att studera den stressade och åldrande cellen och erbjuder insikter i mekanismerna för åldrande. Sedan dess roll i åldrandet hade först föreslagits, har en mängd studier gjorts om telomerlängd till ålder, livslängd, åldersrelaterade sjukdomar, cancer, och stress. Under årtionden var guldmyntfoten av telomerlängd mätningar terminal restriktionsfragment analys med Southern hybridisering. Men nyligen en prisvärd, snabb och lätt att utföra metoden genom Cawthon har utvecklats. Använda kvantitativ realtids-PCR, erbjöd Cawthon ett användbart alternativ för att mäta telomerlängd, vilket gör studier för stora urvalsstorlekar möjligt.

Använda QRT-PCR, har många studier gjorts för att undersöka sambandet mellan telomerlängd och en rad resultat, särskilt åldersrelaterade sjukdomar. Mer specifikt har denna metod får forskare att utföra stora epidemiologiska studör på populationer som visar eller neka en korrelation mellan telomerlängd och en mängd olika sjukdomar. För att nämna några, ischemisk hjärtsjukdom ^7, Alzheimers sjukdom ^22, osteocarcoma i kvinnlig ^23, lungcancer bland rökare ^24, familjär sköldkörtelcancer ^25, har diabetes ^5, blodtryck ^26, åldras ^27, och demens ²⁸ varit korrelerade med kortare telomerlängd , medan åldersrelaterad makuladegeneration ^7, kolorektal cancer ^43, och död från smittsam sjukdom, cancer, hjärt-eller cerebrovaskulär sjukdom ⁴⁴ har visat sig ha någon signifikant samband med telomerlängd. Dessutom har vissa påkänningar visats sammanfalla med kortare telomerlängd, till exempel, en ökad mängd av inflammatoriska markörer, TNF-α och IL-6, har korrelerats med kortare telomerelängder av leukocyter ^29. Också, stressande LIFestyles grund tidskrävande arbetsscheman, skiftarbete eller typen av arbete, i synnerhet en vaktmästare läge för en kroniskt sjuka barn, har förknippats med skillnader i telomerlängd. Detta tyder på att stress kan orsaka för tidigt åldrande genom telomereförkortning utan tillräcklig återhämtning ^{30, 31.} I en nyligen genomförd studie, är att ha färre sociala relationer också förknippad med kortare telomerer ^32. Förebyggande av telomerlängd matfettet har också visat sig korrelera med hälsosamma livsval, som att ta en daglig multivitamin och inte röka ^{24, 33.} Dessutom visade dessa studier möjliga kliniska användningsområden för mätning telomerer, till exempel, som en icke-invasiv screening för eventuell utveckling av skrumplever ^34. I andra fall där liknande studier har inte visat någon signifikant korrelation (eller en blygsam korrelation) mellan en sjukdom och telomerlängd har forskare uppmuntras att stUdy andra nya mekanismer för cellulär nedgång och sjukdomstillståndet ^7.

Dessa studier har styrka i antal och har visat nyttan av att mäta telomerlängd som ett av de första stegen i att dechiffrera åldrandet. Cawthon s QRT-PCR-metoden var användbara för detta ändamål eftersom den kan jämföra ett stort antal människor, kräver minimal DNA, och kan ge tillförlitliga bevis mot ett samband mellan telomerlängd och cell hälsa. Dessa studier hjälper till att styra framtida åldrande forskningsinsatser för att vissa gener, vävnader och cellulära processer.

Oundvikligen, efter en avsevärd skillnad i telomerlängd noteras, ges här en förklaring ifrågasätts. Till svar på dessa frågor, undersökningar om telomeras har enzymet involverat i telomer underhåll och dess reglering, fastställts. PCR-baserade telomerasaktivitet protokoll har erbjudits, vilket ger ytterligare information till: a. bestämning av fortsributions av nedbrytningen av telomerer, och b. misslyckande framgångsrika telomerlängd underhåll av telomeras, ger alltså ytterligare ett kapitel till berättelsen om åldrandet som en helhet, i synnerhet cellåldrande.

Även QRT-PCR upptäcker genomsnittliga telomerlängd, och inte på en enskild kromosom basis, är denna metod ett kraftfullt verktyg för bevis mot hur cellen reagerar på åldrande och stress och ger en inledning till historien om hur vi åldras. Intressant nog har denna information redan lett till telomerlängd mätning på kliniken för att uppskatta biologiska ålder och kommer att öka vår förståelse för åldrandet och oundvikligen leda till förebyggande eller försening och screening av åldrande och åldersrelaterade sjukdomar.

Reagensets namn	Company	Katalognummer
Kvantitativ Telomeras Detection Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Mästare, Ready-to-använda varmt startreaktion mix för SYBR Green I-baserat realtids-PCR med LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516