Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Published: May 22, 2013 doi: 10.3791/50246

Summary

Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Abstract

Telomer ucunda DNA dizileri tekrarlıyor uzunluğunda ve insanlarda çeşitlidir kromozom 15.000 baz çifti uzunluğunda ulaşabilirsiniz biter. Telomer her hücre bölünmesi de kromozom yıpratma Bio koruyucu mekanizması olarak hizmet vermektedir. Belirli bir süre de, telomerlerin çoğaltma, kromozom istikrarsızlık ya da hücre ölümüne yol açabilir bir süreç sağlamak için çok kısa olur. Yıpratma ve uzama: telomer uzunluğu iki karşıt mekanizmalarla düzenlenir. Her hücrenin bölünmesinden olarak yıpratma oluşur. Buna karşılık, uzama kromozomların uçlarına tekrar dizileri ekler enzim telomeraz, kısmen modüle edilir. Bu şekilde, telomeraz muhtemelen bir yaşlanma mekanizması ters ve hücre canlılığı gençleştirir olabilir. Bu hücre yaşam sürdürmek çok önemli unsurlardır ve hücresel yaşlanma değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda biz birden fazla dokuda telomer uzunluğu değerlendirmek için doğru, kısa, gelişmiş ve ucuz yöntem anlatacağıms ve tür. Bu yöntem, telomer dizisinin tandem tekrar ve test örneklerinin diferansiyel kopya sayıları tespit etmek için Mah-PCR duyarlılığı, iki temel unsuru yararlanır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Introduction

Telomer kromozomların uçlarında bulunan DNA hexamer (TTAGGG) dizileri tekrarlıyor. Her hücre çoğaltma, bu kromozom uçları kısalır. Onlar çok kısa kalırsanız, kromozomların telomer sonunda füzyon, anormal rekombinasyon ve bozulma tabi olabilir. Bu nedenle yeterli telomer uzunluğu bakım kromozom istikrar ve hücre koruma 38 önemli bir rol oynar. Telomer uzunluğu bakım da kromozom uçları yanında bulundu genler için çok önemlidir, çünkü DNA replikasyonu kromozom 1-2 sonuna kadar devam edemez. Sonuç olarak, telomer kısalması önlenmesi hücre istikrarı artırabilir.

Çeşitli çalışmalar telomer uzunluğu, 3-4, diyabet 5 ve kalp-damar hastalıkları 6,7 kanser gibi bir organizmanın uzun ömür ve hastalıklı devlet ile ilişkili olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, kısaltılmış telomer aşırı stres ya da bir ile ilişkilendirilmiştirbelki erken hücre yaşlanma ve ölüm 9 teşvik ederek sağlıksız yaşam tarzı 8,. Öte yandan, bazı çalışmalarda hastalık 39, 40, 41 ilgili telomer uzunluğu ve uzun ömür ve yaş arasında anlamlı bir fark olduğunu bulduk.

Telomer kısalması korunma hücrenin doğal mekanizmalardan biri kendi enzim telomeraz ters transkriptaz (TERT) aktive gereğidir. Bu enzim ve alt birimi, telomeraz RNA (TERC), bir kodlayıcı olmayan RNA, 10 sona erer kromozom telomer tekrar eklemek için bir şablon olarak telomer kullanın. Telomeraz aktivitesi hücreleri ve diğer mekanizmalar çeşitli telomer uzunluğu bakım katılan eksik olmasına rağmen, artan telomeraz aktivitesi artmış telomer uzunluğu ile ilişkilidir. Telomeraz aktivasyonu hücre hasarına cevap ve stres ve erken yaşlanma ve ölüm önlemek hangi mekanizmalardan biri olarak kurulmuştur. Örneğin, daha uzun telomeres olağanüstü ömrü 11 ile Aşkenazi Yahudilerin bir popülasyonda gösterildi, TERC veya TERT mutasyonlar yaşa bağlı hastalık 13 üzerinde bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir ölümcül hastalığı 12 ve telomeraz epigenetik düzenleme katkıda gösterilmiştir. Yılında keşfedilmesinden bu yana, telomer uzunluğu çeşitli hayvan modellerinde hem de insanlarda sağlık durumu için bir belirteç olarak önerdi, ancak kullanılan yöntem, sıkıcı uzun ve pahalı olduğu için bu ilk çalışmalarda yaygın olarak çoğaltmak için zordu edilmiştir. 2002 daha 2009 yılında ayarlanmış olarak, Cawthon önerilen ve telomer uzunluğu değerlendirmek ve daha fazla yaşlanma ve hastalık 19, hücre biyolojisi çeşitli yönleri rolünü araştırmak için yeni, doğru, hızlı ve basit bir PCR tabanlı protokol gösterdi.

Bir çalışma için doğru telomer ölçüm metodu seçilmesi esastır. Şu anda, telomer uzunluğunu ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler kendi her vardıravantaj ve dezavantajları. A: Geleneksel olarak, telomer uzunluğu içerir terminal sınırlama parçaları Southern Blot analizi (TRFs) kullanılarak ölçülür. b TRFs elde etmek için tekrar telomer kesilmiş olmayan kısıtlama enzimleri ile DNA sindirici. Bu TRFs Southern Blot bir telomerik prob 14, 37 kullanılarak ortalama TRF uzunluğunu belirleyerek yapılır. Bu yöntem, bir varyasyon katsayısı ile son derece küçük bir doğru olmasına rağmen, doğrudan bir ölçüsüdür ve uzunluk dağılımı ölçmek için avantajlı olabilir, TRF analizi, emek yoğun maliyetlidir ve DNA bölgesinin en az 3 mg gerektirir. Bu yöntem prob tarafından nedeniyle (TTAGGG) n onlar, 42 15 içeren dizileri gibi tespit edilebilir subtelomerik DNA, karmakarışık hale olabilir kısa telomer ve uzunluk tayin duyarsız.

Telomer uzunluğu ölçüm başka bir derece doğru bir yöntem Tek Telomer Uzama Uzunluk Analizi (STELA), bir singl olduğusadece DNA küçük bir miktar gerektirir E molekülü PCR tabanlı bir yöntemdir. Bu yöntemde, primerler kromozom sonunda G-zengin çıkıntı tanımak için ve belirli bir kromozom telomer güçlendirir bir kromozom üzerinde eşsiz bir subtelomerik sekansına bağlanmak için yapılır. Elde edilen amplifikasyon sonra Southern Blot tarafından görüntülenmiştir. Bu yöntem son derece doğru olma avantajına sahiptir ve kısa aykırı telomerlerin 16 tespit edebiliyor. Tüm kromozomlar G-zengin uçları ve kullanılabilir bir subtelomerik dizisi yazık ki, telomer uzunluğu sadece belirli kromozom üzerinde ölçülebilir ve bu ölçümlerin hücre 15 tüm telomer uzunluğu temsil olmayabilir.

Uygulanmakta olan diğer bir yöntem telomer uzunluğu tespit etmek için, peptit nükleik asit (PNA) probların kullanılmasıdır. In situ Hibridizasyon Kantitatif floresans (Q-FISH) bize st metafaz sırasında telomerlerin görüntülemenizi sağlarbüyüklüklerine orantılı olarak bir PNA prob ile telomerlerin Aining belirli kromozom arasındaki telomer karşılaştırılması izin verir. Bu yöntem aynı zamanda interfaz hücreleri için de kullanılabilir, ancak burada farklı bir kromozom için telomer uzunluğu 17 yaşlı veya seyrek bölünen hücreleri telomer uzunluğu ölçülürken bir sınırlama getirmektedir ki, tespit edilemez. Akış BALIK yerine akım sitometri kullanır ve şu anda klinik ortamda kan hücrelerinin telomer uzunluğu ölçmek için en hassas yöntemdir, ancak çok yetenekli teknisyenler 18 gerektirir.

Şu anda, bizim laboratuvarda ortalama telomer uzunluğu ölçmek için standart bir yöntem hassas, duyarlılık yararlanır ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kolaylığı. Bu yöntem, aksi olarak üretilen olurdu primer-dimer-türevi ürünlerin sentezini önlemek yeni primerler gelişimi ile telomer uzunluğu ölçme mümkün oldutelomerlerin tekrar doğası gereği tandard testi. Bu tahlil için, telomer uzunluğunun ölçülmesi tek kopyalı gen sayısı için T / S oranı, telomer tekrar kopya sayısı ile temsil edilir. Telomer uzunluğu ve PCR başlangıç ​​aşamalarında esnasında DNA bağlama telomer etiketli primerlerin sayısı arasında doğru orantılı bir ilişki olduğu için, T / S oranı telomer uzunluğu ile doğrudan orantılıdır. T / S oranı Ct fark karşılaştırılarak ölçülür, örnek floresans birikmiş hangi fraksiyonel döngü sayısı telomer astar ile örnekleri ve astar 19 SCG arasında, taban floresans yukarıda birkaç standart sapma bir eşiği geçer. Bu yöntem, kromozom mükerrer veya kopya sayısı varyasyonları 15 durumunda, yanlış ölçümlere yol açabilir telomer uzunluğu dolaylı ölçümü, örneğin için eleştirilmiştir. Ayrıca, çalışmalar arasında karşılaştırma genellikle di olanfficult, ancak standart oligomerler mutlak telomer uzunluğu 20 ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, tek renkli çok katlı qPCR testi kullanılarak, Cawthon tarafından üzerine geliştirilmiş daha da ileriye edildi. Bu deneyde, PCR primer-dimer bağlanma önlemek için ilk birkaç devir için daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilir ve telomer ve kontrol geni daha fazla hata önlemek için, aynı PCR tüpü içinde analiz edildi. Ortaya çıkan telomer uzunluğu ölçümleri güçlü TRFs Southern blot analizi ile ölçülen telomer uzunluğu ile ilişkilidir ve yüksek doğruluk 15, 19, 36 oldu. Şu anda, QRT-PCR büyük çaplı test etmek için kullanılabilen tek uygun yöntem olup tek yürütmek için DNA küçük bir miktar gerektirir. Bu yöntemin çok önemli bir bölümü, bu doğru bitince, bu yöntem telomer uzunluğu hakkında değerli karşılaştırmalı bilgi sağlayabilir, böylece kapsamlı kalite kontrol önlemleri olduğunu. Buna ek olarak, bu yöntem ölçmek için lökositlerin dışında kullanım için adapte edilmişfarklı çok çeşitli dokulardan 42 telomer uzunluğu.

Ayrıca, daha da telomer boyu bakım ve iki karşıt etkileri (telomeraz enzimi tarafından çoğaltma ve uzama sırasında yani telomer kısalması) arasındaki etkileşimleri arkasındaki biyoloji anlamak için, biz telomeraz aktivitesini ölçer ek yöntemi ile telomer uzunluğu yöntemi eşlik etti.

Bu amaçla, bir Telomer Tekrar amplifıkasyon protokolü, bir in vitro deney kullanılabilir. Kısaca, lize, konserve, enzimatik olarak aktif hücrelerin telomeraz kullanılarak bir oligonükleotid alt tabaka üzerine telomerik tekrar sentezlenir ve ürünlerin SYBR Green mevcudiyetinde PCR ile amplifiye edildi. Sonuçlar daha sonra örnek karşılaştırma ve kontrol Ct eşik değerleri ile analiz edildi. Telomeraz bir ısıya duyarlı enzim olduğundan, ek bir ısı kontrol tedavi her bir örnek 21 ile birlikte çalıştırılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Telomer uzunluğu Protokol 19

  1. DNA izolasyonu

En DNA izolasyon yöntemleri kullanılabilir. Bizim Lab kan kaynakları için Qiagen DNeasy Kiti (# 69506) tercih ediyor. Örneğin bukkal ya da diğer kaynaklardan gelen DNA, bir kaynağına bağlı olarak, farklı bir izolasyon yöntemi de kullanılabilir.

  1. Astarlar:

Tüm primerler PCR sınıf suda 100pmoles/μl 'lik bir stok konsantrasyonu seyreltildi ve kullanılana kadar -20 ° C'de saklanır. Primerlerin çalışma stokları kısa bir süre için taze yapılmış ve 20 ° C 'de muhafaza edilmektedir (bir kaç ay). Standart primerler olarak O'Callaghan ve diğ, telomer ve β-globin, SCG kullanılmıştır. 20 .

Primer dizileri:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Not: Primerler önce reaksiyon karışımına ilave edilmeden, 10pmoles/μl çalışan bir konsantrasyona seyreltilir.

  1. Genomik DNA seri seyreltme:

Telo ve tek kopya Gene (SCG) genomik DNA seri seyreltileri tahlili için standart bir eğri oluşturmak Ct değeri oluşturulur. Kullanılan genomik DNA kan örneklerinden lenfositlerden elde edildi. Bu seyreltmeler, aynı genomik DNA kullanılarak seri seyreltme iki set vermek üzere 1.68 faktörüyle her bir konsantrasyonu için PCR sınıf H 2 0, DNA seyreltilerek oluşturulur. Başlangıç ​​konsantrasyonu deneme ve yanılma göre optimize edilmiş ve farklı reaktif madde, araçlar, diğer türler arasından, DNA, hücre tipi ve kullanılan SCG kullanılıyorsa ayarlanması gerekebilir.

Not: genomik DNA kullanılarak seri seyreltme yavaşça karıştırılması ve bir saat befo en azından 15 dakika beklendikten sonra yapılırBir sonraki seyreltme için DNA alarak yeniden. Her seyreltme ayırmak için genomik DNA için zaman gerektirir. -80 Depolama için PCR şeritler ° C içine uzun süreli depolama, kısım seri dilüsyonları için Her PCR şerit çözülmüş ve DNA zarar verebilir donma çözülme döngüleri önlemek için bir kez kullanılır.

  1. RT-PCR için Reaksiyon kurulum

Kullanılan alet: Roche480 Işık Cycler

Reaktif: Roche Işık döngü SYBR-yeşil

10 ng / ml arasında bir nihai konsantrasyona testi DNA örnekleri seyreltilir. Biz Nanodrop veya Qubit kullanarak konsantrasyonu test edin. Biz daha 10ng/μl nihai 5ng/μl için DNA sulandırmak. Biz yine konsantrasyon test yok.

Reaksiyon bileşenleri:

TELO 1x SCG 1x
Y 2 0 </ Td> 6 ul H20 6 ul
Telo 1 0.2 ul 1 SCG 0.6 ul
Telo 2 1.8 ul 2 SCG 1.4 ul
Rxn karışımı 10 ul Rxn karışımı 10 ul
DNA ya da seri seyreltme 2 ul DNA ya da seri seyreltme 2 ul

Not: Ana Karışım DNA olmadan ve% 5 ila% 10 arasında bir fazlalığı ile yapılır.

Telo ve SCG ikisi de aşağıdaki programı kullanarak aynı plaka üzerinde birlikte işletilmektedir. , Hassas test etmek için en az üç her numunenin çoğaltır ve kontrol çalıştırılmalıdır. Kullanılan primerler değişimler sonuçlarını etkileyebilir. Bizim protokol Roche480 Işık Cycler ve astar üzerinde aşağıdaki gibi çalışmak üzere optimize edilmiştir.

Içindeitial denatüre
10 dakika 95 ° C denatüre
Bisiklete binme
95 ° C 10 saniye tutun
60 ° C 5 saniye tutun
72 ° C 11 saniye tutun ve tek satın alma
Gerektiği gibi 45-55 kez tekrarlayın

2. Kantitatif Telomeraz Algılama (QTD) Protokolü (Müttefik Biyoteknoloji, Inc Kat. No MT3012 tarafından QTD Seti dayanarak)

Hazırlık Özü

  1. Pelet hücre veya doku.
  2. 1x bir kez PBS ile yıkayın.
  3. Repellet ve kaldır 1x PBS. *
  4. Her 10 5 -10 6 hücre veya doku 40-100 mg 1 x Lizis Tampon 200 ul hücre pelletini.
  5. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  6. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 x g'de örnek dönerler
  7. Yeni bir tüp içine 160 ul süpernatan aktarın ve protein konsantrasyonu belirlenir.
  8. Kısım ve -80 kuru buz / etanol hızlı dondurma kalan özü, mağaza ° C

* T içindeonun durumu, dondurulmuş hücre veya dokularda telomeraz en az bir yıl boyunca stabildir. Kullanım için içine yerleştirildiği zaman, 1 x Liziz Tamponu içinde hücrelerin hemen tekrar süspansiyon.

2.1. Testi Kontroller

Isı inaktivasyonu kontrolü: her bir numune için, önceden telomeraz aktivitesi deneyi için 10 dakika boyunca 85 ° C'de inkübe ederek ek kontrol özü tedavi ısı.

TSR denetimi şablon için standart eğri: standart bir eğri oluşturmak için kiti ile birlikte telomer astar benzer bir dizi ile TSR, bir oligonükleotid dilüsyonları kullanarak Kantitatif Real-Time PCR gerçekleştirin.

  1. Lizis Tampon ile stok TSR konsantrasyon 01:05 seri dilüsyonları (0.5 amoles / ml) hazırlayın
  2. Stok konsantrasyonu da dahil olmak üzere, her TSR seyreltme 1 ul kullanarak telomeraz algılama standart tahlil gerçekleştirin. Bu seyreltiler, en az 2 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.

2.2. Telomeraz Aktivitesi TestiQTD Real-Time PCR kullanarak

  1. Her numune için, bir PCR tüp veya ince duvar PCR plate (toplam hacim 25.0 ul) için aşağıdakileri ekleyin:
    • 2 x QTD Premix 12.5 ul
    • Hücre veya Doku Extract 1.0 ul
    • PCR Nitelikli Su 11.5 ul
  2. Iyice karıştırın
  3. Aşağıdaki programa göre Programı Real-Time PCR Tespit Sistemleri:
    - 25 ° C'de 20 dakika (telomeraz reaksiyonu) için
    - 95 10 dakika (PCR ilk aktivasyon adım) ° C
    35-40 döngüleri:
    - 95 ° C 30 saniye (denatürasyon)
    - 60 ° C'de 30 saniye boyunca (tavlama)
    - 72 ° C 30 saniye (uzatma)
  4. Termal döngü içinde PCR tüpleri yerleştirin ve bisiklet programını başlatın.
  5. Döngüleri bitirmek sonra eşik döngüsü veya C T değeri toplayın. Eşik döngüsü ΔRn bir istatistiksel olarak anlamlı artış ilk tespit edildiği döngüdür.

2.3. Veri Analizi

  1. Generatadet standart eğri C T okuma kullanarak ve telomeraz aktivitelerini karşılaştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Telomer uzunluğu QRT-PCR bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Sol üst paneli üzerinde, kırmızı ve yeşil İşaretlenmiş örnekler 96 oyuklu plaka üzerine test deneklerin yeri temsil eder. Sağ üst panelinde, kuvvetlenme eğrisinin gösterilmiştir. Her konuda triplicates yapılır iki testleri (Telomer ve Tek Kopya Gen), tarafından test edilir. Seçilen bireylerin iki tahlil içinde üretilen farklı DNA kopya sayısı nedeniyle, floresans algılama kadar çevrim sayısı ve logaritmik eğrisi tahliller arasında farklılık ulaşır. Yüksek kopya sayısı tüplerde (yani Telomer testi), floresan algılama miktarı 27 döngüleri sonra üstel eğri ulaşır. Hatları ikinci seti genom tek bir kopya sahip tek kopya Gene (SCG) temsil eder, ve böylece telomer örnekleri daha az kopyası vardır ve yalnızca 31 devir sonra üstel değerine ulaşıldığında. Kahverengi çizgiler standart temsilÖrnek bilinen konsantrasyonlarda bir seri seyreltme esas eğrisi. Sağ alt panelde standart eğri noktaları (düz bir çizgi optimal bir seri seyreltme gösteren) bir günlük konsantrasyonu temsil eder. Bu doğrusal bir eğri test tüpleri (alt sol panel) konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılmaktadır. Başlangıçta Cawthon elleri 19, ve bize ve başkaları tarafından tekrar, terminal restriksiyon parça uzunluk yöntemi ile elde edilen ile ilişkili olduğu gösterilmiştir yılında Mah-PCR sonuçları,. Bir T / S oranı birimi (SCG çalıştırmak Mah-PCR döngüleri üzerinde telomer çalıştırmak Mah-PCR döngüleri) lökosit 42 4.270 bp bir ortalama telomer uzunluğu eşdeğerdir. Bizim örneğimizde SCG yöntemi ile Telomer testi için Mah-PCR döngüleri bölme 3.715 bp ortalama eşdeğerdir 0.87 oranında, sonuçlandı. Bu ölçüm, tek başına telomer uzunluğu oluşur ve subtelomerik bölge içermez.

Mah-PCR çok az numune hazırlama dahil burada gösterdi. Bu örnekte, (Şekil 1), nitel hem de nicel farklar (seri seyreltme ve üçlü suretler halinde arasındaki uyum ile temsil edilir), iki tahliller arasında gözlenmiştir. Bu test hesaplanan sonuçları 65 yaşındaki konu için ara telomer uzunluğu gösterir.

Telomeraz aktivitesi test sonuçları ve telomeraz aktivitesi ve telomer uzunluğu arasındaki olası ilişki bir örnek Şekil 2 ile gösterilmiştir. Bizim ilk sonuçlar daha uzun telomer uzunluğu artmış telomeraz aktivitesi ile ilişkili olabileceğini göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Şekil 1 aq gelen tipik bir çıkış temsilTelomer uzunluğu için RT-PCR testi ile ölçüldü. Sol üst köşesinde üç kez, 96 oyuklu bir plaka içinde düzenlenmiş örnekleri göstermektedir. Sol alt köşesinde T / S değerleri hesaplamak için kullanılır, her numune için hesaplanan konsantrasyonu ve CT değerleri, listeler. Üst sağ sonuçları görselleştirmek için kullanılan amplifikasyon eğrisi (CYBR yeşil floresans tespit karşı devir sayısı), bir grafiğidir. Sağ alt, seri seyreltme kontrolü CT değeri karşı Oturum konsantrasyonu için standart eğri grafikle edilir. Düz bir çizgi seri seyreltme doğru ölçülüp yüklenmiş olduğunu onaylar. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. , Telomeraz aktivitesi ve telomeraz uzunluğu için Mah-PCR ilk sonuçlarına kullanarak <strong> Şekil 2 Ct değeri ile ölçülen bir doğrudan, önemli bir T / S oranı ile ölçülen telomer uzunluğu arasında bir ilişki (p = 0.008), ve telomeraz aktivitesi, gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Telomer uzunluğu stresli ve yaşlanma hücre incelemek için eşsiz bir hücresel işaretleyici sağlar ve yaşlanma mekanizmaları irdeliyoruz. Yaşlanma rolü ilk önerilmiştir olmadığından, çalışmalar çok sayıda yaşı telomer uzunluğu ile yapılmıştır, uzun ömürlü, yaş ile ilgili hastalık, kanser ve stres. On yıllardır, telomer uzunluğu ölçümleri altın standart Güney melezleme kullanarak terminal kısıtlama parçası analizi oldu. Ancak, son zamanlarda Cawthon tarafından, ekonomik, hızlı ve gerçekleştirmek için kolay bir yöntem gelişti. Kantitatif Real-Time PCR kullanarak, Cawthon olası büyük örneklem büyüklüğü için çalışmalar yapmak, telomer uzunluğunu ölçmek için bir alternatif sundu.

Mah-PCR kullanarak, birçok çalışma telomer uzunluğu ve sonuçlar, çeşitli özellikle yaşa bağlı hastalıklar arasındaki ilişkiyi araştırmak için yapılmıştır. Daha spesifik olarak, bu yöntem, araştırmacılar büyük epidemiyolojik Stu gerçekleştirmek için izin verditelomer uzunluğu ve çeşitli hastalıklara arasında anlamlı bir ilişki ya da inkar nüfus ölür. Birkaç, iskemik kalp hastalığı 7, Alzheimer Hastalığı 22, kadın 23, sigara içen 24 arasında akciğer kanseri, ailesel tiroid kanseri 25 osteocarcoma isim, diyabet 5, kan 27 yaşlanma basıncı 26, ve demans 28 daha kısa telomer uzunluğu ile ilişkili olan , yaşla ilgili maküler dejenerasyon 7, kolorektal kanser 43 ve enfeksiyöz hastalık, kanser, kalp veya serebrovasküler hastalık 44 ölüm telomer süresini anlamlı bir ilişki olduğu gösterilmiştir varken. Ayrıca, belirli bir gerilme örneğin kısa telomer uzunluğu, inflamatuvar belirteçleri artış miktarı, TNF-α ve IL-6 ile aynı olduğu gösterilmiştir, lökositler 29 kısa telomer uzunlukları ile ilişkili olmuştur. Ayrıca, stresli lifzaman alıcı çalışma programları, vardiyalı çalışma, ya da işin doğası gereği estyles, bir kronik hasta çocuk için özel bir bakıcı konumda, telomer uzunluğunda farklılıklar ile ilişkili bulunmuştur. Bu stres yeterli kurtarma 30, 31 olmadan telomer kısalması yoluyla erken yaşlanmaya neden olabilir göstermektedir. Yeni bir çalışmada, daha az sosyal ilişkileri olan aynı zamanda daha kısa telomer 32 ile ilişkilidir. Telomer uzunluğu kısalması önlenmesi aynı zamanda bir günlük multivitamin ve sigara içmeme 24, 33 alarak sağlıklı yaşam seçenekleri, ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, bu çalışmalar, siroz 34 olası gelişimi için invazif olmayan bir tarama testi, örneğin, ölçme telomer olası klinik kullanımları ortaya çıkardı. Diğer durumlarda, nerede benzer çalışmalar bir hastalık telomer uzunluğu arasında anlamlı bir ilişki (ya da mütevazı bir korelasyon) göstermiştir, araştırmacılar st için teşvik edilmiştirhücresel düşüş ve hastalıklı devlet 7 udy diğer yeni mekanizmalar.

Bu çalışmalar sayıda gücü ve yaşlanma sürecini deşifre ilk adımlardan biri olarak telomer uzunluğu ölçme programı göstermiştir. Cawthon en Mah-PCR yöntemi çok sayıda insanın karşılaştırabilirsiniz çünkü, bu amaç için yararlı oldu az DNA gerektirir ve telomer uzunluğu ve hücre sağlığı arasında bir ilişki doğru güvenilir kanıt verebilir. Bu çalışmalar bazı genlerin, doku ve hücresel süreçleri gelecek yaşlanma araştırma çabalarını yönlendirmek için yardımcı olur.

Telomer uzunluğu önemli bir fark olduğunu kaydetti sonra Kaçınılmaz olarak, bir açıklama sorgulanır. Cevap için bu sorulara, telomeraz çalışmaları, telomer bakım ve düzenleme ile ilgili enzim, kurulmuştur. PCR tabanlı telomeraz aktivitesi protokolleri yönelik ek bilgi vererek, teklif edilmiştir: a. devam belirlenmesitelomerlerin bozulması ve b ributions. telomeraz tarafından başarılı telomer uzunluğu bakım yetersizliği, böylece belirli bir hücre yaşlılık döneminde, bir bütün olarak yaşlanma üzerinde hikaye başka bir bölüm sağlar.

Mah-PCR bireysel kromozom bazda ortalama telomer uzunluğu değil, algılar da, bu yöntem yaşlanma ve stres için hücre nasıl tepki vereceğini yönelik kanıt için güçlü bir araçtır ve nasıl yaş hikayenin bir başlangıç ​​sağlar. İlginçtir, bu bilgiler zaten biyolojik yaş tahmin için klinikte telomer uzunluğu ölçümü yol açmıştır ve yaşlanma sürecinin daha iyi tanımamıza ve kaçınılmaz önlenmesi veya gecikme ve yaşlanma ve yaşa bağlı hastalık tarama yol açacaktır.

Reaktif adı Şirket Katalog numarası
Kantitatif Telomeraz Algılama Müttefik Biyoteknoloji MT3012
Qiagen DNeasy Kiti Qiagen 69506
LightCycler 480 SYBR Green I Usta, LightCycler 480 Enstrüman kullanarak SYBR Green I-tabanlı gerçek zamanlı PCR için hazır kullanımlı sıcak başlangıç ​​reaksiyon karışımı Roche Diagnostics 4707516

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantitative Telomerase Detection Allied Biotech MT3012
Qiagen DNeasy Kit Qiagen 69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
  2. Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
  3. Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
  4. Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
  5. Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 343-350 (2012).
  6. Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6 (5), 639-647 (2007).
  7. Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 822-829 (2011).
  8. Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7 (5), e38374 (2012).
  9. Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. , In Press (2012).
  10. Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315 (5820), 1850-1853 (2007).
  11. Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
  12. Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5 (9), e13048 (2010).
  13. Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer's Disease. Aging Disease. 3 (2), 164-170 (2012).
  14. Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  15. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730 (1-2), 59-67 (2012).
  16. Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33 (2), 203-207 (2003).
  17. O'Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
  18. Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47 (2), 89-99 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30 (10), e47 (2002).
  20. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13 (1), 3 (2011).
  21. Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17 (1), 1-15 (1995).
  22. Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47 (2), 160-163 (2012).
  23. Mirabello, L., Richards, eg, Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2 (1), (2011).
  24. Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D. 3rd, Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73 (2), 133-137 (2011).
  25. Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93 (10), 3950-3957 (2008).
  26. Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14 (2), 124-132 (2012).
  27. Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61 (8), 871-873 (2006).
  28. Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32 (11), 1055-1060 (2011).
  29. O'Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6 (5), e19687 (2011).
  30. Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68 (8), 582-589 (2011).
  31. Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101 (49), 17312-17315 (2004).
  32. Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres? Health Psychology. , In Press (2012).
  33. Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89 (6), 1857-1863 (2009).
  34. Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. , In Press (2012).
  35. Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. , In Press (2012).
  36. Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S. 3rd, Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
  37. Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610 (3), 245-261 (2010).
  38. Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3 (8-9), 979-998 (2004).
  39. Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8 (8), 860-864 (2009).
  40. Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A (8), 792-799 (2010).
  41. Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
  42. Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63 (8), 809-812 (2008).
  43. Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18 (8), 2280-2282 (2009).
  44. Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A (8), 860-864 (2009).

Tags

Genetik Sayı 75 Moleküler Biyoloji Hücresel Biyoloji Tıp Biyomedikal Mühendisliği Genomik telomer uzunluğu telomeraz aktivitesi telomeraz telomer telomer DNA PCR polimeraz zincir reaksiyonu Mah-PCR sıralama yaşlanma telomeraz testi
Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, More

Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence. J. Vis. Exp. (75), e50246, doi:10.3791/50246 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter