Summary
Un protocole pour la séparation de l'ectoderme embryonnaire visage et le mésenchyme est décrite. Nous utilisons dispase II pour traiter les embryons entiers d'abord, disséquer l'ensemble du visage protubérances sur, puis séparer l'ectoderme facial et le mésenchyme.
Abstract
Fentes orofaciales sont les défauts les plus fréquents cranio-faciales, qui touchent 1,5 en 1000 1,2 nouveau-nés dans le monde entier. Clefting orofaciale est causée par 3 un développement anormal du visage. Chez l'homme et la souris, la croissance initiale et structuration de la face repose sur plusieurs petits bourgeons de tissu pour le visage, les proéminences 4,5. Le visage est dérivée à partir de six protubérances frontales principales paires: les processus nasaux (FNP), les protubérances maxillaires (MXP) et des proéminences mandibulaires (MdP). Ces protubérances sont constitués de gonflements de mésenchyme qui sont enfermés dans un épithélium sus-jacent. Etudes de multiples espèces ont montré que la signalisation diaphonie entre ectoderme et le mésenchyme facial est essentiel pour façonner la face 6. Pourtant, les détails mécanistiques concernant les gènes impliqués dans ces relais de signalisation font défaut. Une façon d'acquérir une compréhension globale de l'expression des gènes, facteur de transcription liant, et les marques associées à la chromatine le déveectoderme ping visage et le mésenchyme est d'isoler et de caractériser les différents types de tissus séparés.
Nous présentons ici une méthode pour séparer l'ectoderme facial et mésenchyme au jour embryonnaire (E) 10,5, une étape critique du développement de la formation de la souris pour le visage qui précède la fusion des protubérances. Notre méthode est une adaptation de l'approche que nous avons utilisée précédemment pour disséquer les protubérances du visage 7. Dans cette étude, plus tôt nous avions utilisé C57BL consanguine / 6 souris que cette souche est devenu un standard pour la génétique, la morphologie du visage et de la génomique 8. Ici, cependant, en raison des quantités plus limitées de tissus disponibles, nous avons utilisé le consanguine souche CD-1 qui est moins cher à l'achat, plus robuste pour l'élevage, et qui tend à produire plus d'embryons (12-18) par portée que n'importe quel consanguine souche de souris 8. Suite à l'isolation embryon, neutre protéase dispase II a été utilisé pour traiter l'embryon entier. Ensuite, les protubérances faciales ont été disséquered dehors, et l'ectoderme facial a été séparé du mésenchyme. Cette méthode permet de conserver à la fois l'ectoderme facial et le mésenchyme intacte. Les échantillons obtenus selon cette méthode ne peut être utilisé pour des techniques telles que la détection de protéines, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) analyse, études de puces à ADN et l'ARN-seq.
Protocol
1. Préparer dispase II
- Préparer une nouvelle solution saline tamponnée Hepes (EBM) (50 mM de HEPES / KOH à pH 7,4, NaCl 150 mM). Ajouter 2 ml 0,5 M HEPES / KOH pH 7,4 et 1,2 ml 2,5 M de NaCl dans 16,8 ml ultrapure H O. 2
- Faire 10 mg / ml dispase II. Peser 0,2 g dispase II (Roche, Cat # 4942078001) et dissoudre dans 20 ml de HBS. Préparer des aliquotes de 1,0 ml dans des tubes Eppendorf individuelles et conserver à -20 ° C pour stockage à long terme.
- Diluer 10 mg / ml dispase II 1:10 dans PBS avant de les utiliser. Mettez le diluée dispase II sur la glace.
2. Disséquer CD-1 embryons E10.5 Femme enceinte de
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le soin des animaux Université du Colorado à Denver (UCD) et le Comité d'utilisation. Souris CD-1 (ICR) ont été obtenus auprès de Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
- Nettoyez la zone de dissection et les outils avec de l'éthanol à 70%.
- Euthanasier enceintes CD-1 femelles à l'aide approuvantprotocoles éd.
- Vaporiser l'abdomen avec de l'éthanol 70% puis ouvrez l'abdomen. Utilisez un jeu de pinces pour tirer l'utérus et l'autre pour arracher le mésomètre de l'utérus. Enlever l'utérus du corps. Répétez l'opération pour corne utérine de l'autre côté de l'abdomen.
- Rincer brièvement l'utérus avec PBS glacé dans un plat de 10 cm de Petri pour laver le sang.
- Transfert de l'utérus dans un nouveau plat de Pétri avec du PBS glacé. Séparer en un embryon de fragments en coupant entre les sites d'implantation.
- Transfert d'un embryon dans du PBS glacé sous un stéréomicroscope. Utilisez une pince fine à arracher la paroi musculaire de l'utérus à partir de l'un des sites de coupe pour exposer l'embryon avec le sac vitellin. Retirez le sac vitellin et l'amnios. Transfert d'embryons disséqué dans un plat de Pétri de 6 cm avec du PBS sur la glace. Continuez jusqu'à ce que tous les embryons ont été collectés de cette façon.
3. Dispase II Traitement
- Lavez tous les embryons avec du PBS dans un plat de Pétri de 6 cm. RemplacerPBS avec 10 ml diluée dans du PBS II Dispase. Couvrir la boîte de Pétri et incuber à 37 ° C pendant 25 min - une infection bactérienne incubateur ou la pièce chaude devrait suffire - nous n'avons pas utilisé de CO 2 incubateur de culture tissulaire pour cette étape.
- Prenez la boîte de Pétri et observer l'embryon sous un stéréomicroscope. L'ectoderme aurait dû se détacher, caractérisée par un écart évident entre cette couche de tissu et le mésenchyme sous-jacent. Sinon, incuber pendant 5 minutes supplémentaires à 37 ° C. Ensuite, mettre la boîte de Pétri sur de la glace.
4. Disséquer les protubérances intactes du visage
- Utiliser une pipette de verre jetable (VWR, Cat # 14672-380) pour transférer un dispase II traités embryon dans du PBS glacé dans un plat de Pétri de 6 cm sous un stéréomicroscope.
- Utilisez une paire de pinces pour tenir l'embryon. Utilisez une autre paire de pinces fines pour couper soigneusement les limites des protubérances du visage attachés à la tête (figure 1 montre les limites deles saillies du visage). Commencer à partir d'un côté de la MNP, puis le MxP, et le dernier FNP. Faites la même chose de l'autre côté de disséquer les protubérances du visage sur intactes (figure 2A).
5. L'ectoderme séparée du visage à partir de mésenchyme
- Respecter les protubérances du visage sous un stéréomicroscope avec distance de travail 3x. Utilisez un long pipette Pasteur en verre délicatement pipeter les proéminences du visage de haut en bas 5 fois. Après cela, l'ectoderme est facile à décoller.
- Utilisez une paire de pinces pour tenir les protubérances du visage. Utilisez l'autre paire de pinces pour détacher l'ectoderme très lentement. Figure 2B montre les feuilles séparées de l'ectoderme facial.
- Utiliser une nouvelle pipette Pasteur en verre longue de transférer l'ectoderme facial dans un tube Eppendorf de 1,5 ml avec du PBS sur la glace. Transférer le mésenchyme dans un autre tube Eppendorf de 1,5 ml avec du PBS sur la glace.
- Utilisez la nouvelle PBS glacé pour chaque dissection. Prélever des échantillons.
- Laver til échantillons avec du PBS. Centrifuger à 4 ° C, 500 g pendant 3 min.
- Aspirer le PBS à l'aide de longues pipettes Pasteur en verre. Si les échantillons doivent être utilisés pour le dosage ChIP, passez à l'étape 6.1. Pour l'extraction d'ARN, passez à l'étape 6.2. Pour l'extraction des protéines, passez à l'étape 6.3.
6. Les échantillons pour l'expérimentation de processus plus
- Les échantillons pour analyse ChIP
- Ajouter 1 ml de PBS avec du formaldéhyde à 1% de réticulation. Homogénéiser les échantillons.
- Incuber à température ambiante pendant 10 min avec rotation.
- Ajouter 110 ul de 1,25 M glycine dans chaque tube pour étancher formaldéhyde n'ayant pas réagi.
- Mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Centrifuger à 500 xg à 4 ° C pendant 3 min. Retirer le surnageant.
- Ajouter 1 ml de PBS froid pour laver les tissus.
- Centrifuger à 500 xg à 4 ° C pendant 3 min.
- Retirer du PBS et PBS laver une fois répéter.
- Retirer le surnageant, Snap geler les tissus dans de l'azote liquide. Rangez la samples à -80 ° C pour la mise en commun et le traitement ultérieur.
- Les échantillons destinés à l'extraction d'ARN
- Placez l'ectoderme du visage et du mésenchyme dans des tubes contenant le RNAlater (Ambion).
- Incuber les échantillons dans une solution RNAlater nuit à 4 ° C pour permettre la pénétration en profondeur des tissus.
- Conserver à -20 ° C pour la mise en commun et le traitement ultérieur.
- Les échantillons destinés à l'extraction des protéines
Ajouter un tampon de lyse à l'échantillon pour un traitement ultérieur. Ou prenez geler les tissus dans de l'azote liquide. Stocker les échantillons à -80 ° C pendant la mise en commun et le traitement ultérieur.
Remarques
- Les contraintes de temps. Prévoyez 4-6 heures à partir du début de la dissection jusqu'au début de l'article 6.
- Lorsque compétent, il faut ~ 10-15 min par embryon d'effectuer sections 4 et 5 (dissection importance et la séparation ectoderme).
- Si les échantillons sont pour l'ARN isolement, tous les solution doit être traité avec diéthylpyrocarbonate premier. Aussi nettoyer les pinces et la zone de travail avec RNase Away.
- Conserver les échantillons sur la glace en tout temps sauf pour le traitement dispase II et dissections. Changer à nouveau PBS glacée pour chaque dissection pour s'assurer que le PBS utilisé pour la dissection est froid.
- Pinces pointues sont essentiels pour obtenir une dissection précise. Nettoyer la pince complètement pour éviter toute contamination.
- Pour prélever des échantillons de différentes saillies, disséquer chaque proéminence séparément après dispase II de traitement. Puis séparer l'ectoderme et le mésenchyme.
- Après traitement à la dispase II, l'ectoderme facial est facile à décoller. Portez une attention particulière à la contamination de l'ectoderme autre. Jetez tous les tissus potentiellement contaminés.
- Une fois que vous commencez, ne vous arrêtez pas jusqu'à ce que les échantillons parviennent au point approprié dans la section 6. Terminer la séparation de l'ectoderme facial et mésenchyme pour tous les embryons aussi rapidement que vous le pouvez.
- L'enzyme activités de dispase II peut être différent entre les lots et les marques. Il est nécessaire d'ajuster le temps de traitement pour les différentes marques et les lots de dispase II.
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Representative Results
Après dispase II le traitement, l'ectoderme de l'embryon tend à être lâche. Les protubérances du visage doivent être intacts après dissection (figure 2A). L'ectoderme isolé du visage est clair et exempt de tissu mésenchyme (figure 2B). Pour déterminer l'efficacité du protocole et de détecter toute contamination croisée, nous dosés pour prosencéphale exprimé ZIC3 9, ectodermique spécifique CDH1 5 et mésenchymateuses spécifique SOX10 10 à l'aide de la transcriptase inverse PCR. Nos études ont confirmé que les deux ectoderme facial et le mésenchyme exprimé les gènes attendus et étaient exempts de contamination croisée (figure 3).
Figure 1. Schéma montrant la souris E10.5 protubérances faciales. Vue latérale (à gauche) de la tête et vue rostrale (à droite) de la tête d'embryons E10.5. Red dotted lignes indiquent la limite des proéminences du visage. Proéminence fronto-nasal (FNP), la proéminence maxillaire (MXP), la proéminence mandibulaire (MdP).
Figure 2. Apparition de protubérances disséqués E10.5 entières du visage et l'ectoderme facial. (A) Le total des protubérances du visage. (B) ectoderme du visage. Panneaux A et B sont même grossissement. Insérer dans B montre un plus fort grossissement de l'un des ectoderme facial dans le panneau B. Proéminence fronto-nasal (FNP), la proéminence maxillaire (MXP), la proéminence mandibulaire (MdP).
Figure 3. Transcriptase inverse PCR a confirmé que les deux ectoderme facial et le mésenchyme sont libres de croix contamination. L'ARN total a été extrait à partir de l'ectoderme facial (E) et le mésenchyme (M). L'ARN a été transcrit en inverse son ADN complémentaire (ADNc), suivie d'une PCR avec des amorces spécifiques pour détecter l'expression de la bêta-actine (actine-B), ZIC3, CDH1 et SOX10. Les séquences des amorces dans le tableau 1 ont été obtenus à partir de la banque d'amorce ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d'agarose à 2%. Echelle d'ADN (L).
| Gène | Nom Primer | séquences | Taille de produit |
| Bêta-actine | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 pb |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| ZIC3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 pb |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 pb |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| SOX10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 pb |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tableau 1. Les séquences des amorces.
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Discussion
Ce protocole fournit une méthode simple pour séparer l'ectoderme embryonnaire de la souris pour le visage et le mésenchyme basée sur une première étape de traitement dispase II. Dans des études antérieures, nous avons procédé à la dissection des protubérances du visage avant dispase II du traitement, mais nous avons toujours trouvé que le mésenchyme devient "collante" et plus difficile à manipuler. Notre nouveau protocole permet d'éviter ce problème. Combinaison dispase II le traitement avec la force physique douce par pipetage de haut en bas rend la séparation de l'ectoderme et le mésenchyme plus facile. En outre, ce protocole fonctionne aussi bien pour la séparation d'autres échantillons ectoderme et le mésenchyme embryonnaire, comme l'ectoderme et le mésenchyme du bourgeon de membre avec plus courte dispase II de traitement. De même, il peut être utilisé à d'autres stades de développement - par exemple, pour séparer E11.5 ectoderme facial et le mésenchyme avec un traitement plus dispase II.
La taille de l'échantillon obtenu à partir d'une souris E10.5 PROMIN visagerence est assez petit et donc nous avons tendance à stocker des lots pour la suite du traitement et de l'analyse. À cet égard, il est nécessaire de mettre en commun les échantillons ectodermiques 100 à 150 embryons pour obtenir 10 mg de tissu. Une plus grande quantité de mésenchyme est dérivée de chaque embryon nécessitant moins de mise en commun. Le rendement de l'ADN génomique traité par ultrasons pour le dosage ChIP est d'environ 80 mg, de 10 mg ectoderme facial. Le rendement d'ARN total est d'environ 20 mg à 10 mg par ectoderme facial. D'un dosage de Bradford protéines comparative, nous estimons que nous pouvons obtenir jusqu'à 1 mg de protéine par 10 mg ectoderme facial. Une fois l'ARN, chromatine, ou échantillons de protéines sont dans la main, ils peuvent être utilisés pour de nombreux essais, y compris la détection de protéines, dosage ChIP, l'analyse des microréseaux, et de l'ARN-seq. Par conséquent, ce protocole permet une analyse approfondie de l'expression différentielle des gènes, modification épigénétique, et la liaison des facteurs de transcription responsables de la diaphonie moléculaire entre l'ectoderme et le mésenchyme facial pendant le développement embryonnaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt concurrents ou d'autres conflits associés avec le contenu de cet article.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Irene Choi pour illustrer les chefs d'embryons dans la figure 1 et les autres membres du laboratoire de l'aide et de discussion. Ce travail est soutenu par le NIH subvention DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
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