Summary
Een protocol voor het scheiden van embryo gezichts ectoderm en mesenchym beschreven. We gebruiken Dispase II om eerst te behandelen hele embryo's, hele gezicht protuberansen ontleden, en dan scheiden de gezichts-ectoderm en mesenchym.
Abstract
Orofaciale schisis zijn de meest voorkomende craniofaciale defecten, waarvan 1,5 op 1.000 pasgeborenen wereldwijd 1,2. Orofaciale clefting wordt veroorzaakt door abnormale gezichtskenmerken ontwikkeling 3. Bij mens en muis, initiële groei en patroonvorming van het gezicht voert verschillende knopjes weefsel, het gezicht protuberansen 4,5. Het gezicht is afgeleid van zes grote protuberansen: gepaarde frontale neus processen (FNP), maxillaire protuberansen (MXP) en mandibulaire protuberansen (MDP). Deze uitsteeksels bestaan uit zwellingen mesenchym die zijn ingekapseld in een bovenliggende epitheel. Studies in meerdere species is gebleken dat signalering overspraak tussen gezichts ectoderm en mesenchym is cruciaal voor het vormen van het vlak 6. Toch zijn mechanistische gegevens over de genen die betrokken zijn bij deze signalering relais ontbreekt. Een manier om een beter begrip van gen-expressie te krijgen, transcriptiefactor binding en chromatine markeringen in verband met de ontwikping gezichts ectoderm en mesenchym is het isoleren en karakteriseren van de gescheiden weefselcompartimenten.
Hier wordt een werkwijze voor het scheiden gezichts ectoderm en mesenchym op embryonale dag (E) 10.5 kritisch ontwikkelingsstadium muis gezicht formatie fusie van de uitsteeksels voorafgaat. Onze methode is een bewerking van de aanpak die we eerder hebben gebruikt voor het ontleden van het gezicht uitsteeksels 7. In deze eerdere studie hadden we werkzaam inteelt C57BL / 6 muizen als deze stam is uitgegroeid tot een standaard voor de genetica, genomics en gezicht morfologie 8. Hier echter, vanwege de beperktere hoeveelheden weefsel beschikbaar hebben we gebruik gemaakt van de outbred CD-1 stam die goedkoper in aanschaf, robuuster voor veeteelt, en de neiging om meer embryo (12-18) per nest dan inteelt produceren muizenstam 8. Na isolatie embryo werd neutraal protease Dispase II gebruikt om de hele embryo behandelen. Vervolgens werden de gezichts uitsteeksels ontledened uit en het gezicht ectoderm werd gescheiden van het mesenchym. Deze methode houdt zowel de gezichts ectoderm en mesenchym intact. Monsters die met deze methode kan worden gebruikt voor technieken zoals eiwitdetectie, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assay, microarray studies en RNA-seq.
Protocol
1. Bereid Dispase II
- Bereid Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Voeg 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 en 1,2 ml 2,5 M NaCl in 16,8 ml Ultrapure H 2 O.
- Maak 10 mg / ml Dispase II. Weeg 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) en los op in 20 ml HBS. Bereid 1,0 ml aliquots in individuele Eppendorf buizen en bij -20 ° C voor lange termijn opslag.
- Verdun 10 mg / ml Dispase II 1:10 in PBS voor gebruik. Zet de verdunde Dispase II op ijs.
2. Ontleden CD-1 E10.5 embryo's uit Zwanger Vrouw
Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen goedgekeurd door de Universiteit van Colorado Denver (UCD) Animal Care en gebruik Comite. CD-1 (ICR) muizen werden verkregen van Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
- Reinig de dissectie gebied en gereedschappen met 70% ethanol.
- Euthanaseren zwanger CD-1 vrouw met behulp van Goedkeuringed protocollen.
- Spuit de buik met 70% ethanol open de buik. Gebruik een set van een tang om de baarmoeder en een andere trekken om los te rukken van de mesometrium uit de baarmoeder. Verwijderen van de baarmoeder van het lichaam. Herhaal dit voor baarmoedertak aan de andere kant van de buik.
- Kort spoelen de baarmoeder met ijskoude PBS in een 10-cm petrischaal te spoelen bloed.
- Breng de baarmoeder in een nieuwe petrischaal met ijskoude PBS. Scheiden in een embryo-fragmenten door te snijden tussen implantatieplaatsen.
- Breng een embryo in ijskoude PBS onder een stereomicroscoop. Gebruik fijne tang af te rukken de spierwand van de baarmoeder te beginnen bij een van de snede sites om de embryo bloot met de dooierzak. Verwijder de dooierzak en amnion. Overdracht ontleed embryo een 6-cm Petrischaal met PBS op ijs. Doorgaan totdat alle embryo's zijn die op deze manier.
3. Dispase II Behandeling
- Was alle embryo's met PBS in een 6-cm petrischaal. VervangPBS met 10 ml verdunde Dispase II in PBS. Bedek de petrischaal en incubeer bij 37 ° C gedurende 25 min - een bacteriële incubator of warme kamer moet voldoende - we hebben geen gebruik gemaakt van een CO 2 weefselkweekincubator voor deze stap.
- Neem de petrischaal uit en observeer het embryo onder een stereomicroscoop. Het ectoderm zou zijn losgeraakt, gekenmerkt door een duidelijke kloof tussen dit weefsel laag en de onderliggende mesenchym. Zo niet, incubeer nog 5 min bij 37 ° C. Zet dan de petrischaal op ijs.
4. Prepareer de Intact Facial Protuberansen
- Gebruik een wegwerp glazen pipet (VWR, Cat # 14672 tot 380) een Dispase II behandeld embryo in ijskoude PBS in een 6-cm Petrischaal dragen onder een stereomicroscoop.
- Gebruik een tang om de embryo te houden. Zorgvuldig een ander paar fijne pincetten om de grenzen van het gezicht uitsteeksels aan kop (figuur 1 zijn de grenzen van uitgesnedenhet gezicht protuberansen). Start van de ene kant van het MNP, dan is de MXP, en de laatste van de FNP. Doe hetzelfde aan de andere kant van de gezichts-protuberansen uit intacte (Figuur 2A) ontleden.
5. Aparte Facial ectoderm van mesenchym
- Let op het gezicht protuberansen onder een stereomicroscoop met 3x werkafstand. Gebruik een lange glazen Pasteur pipet om voorzichtig pipetteren het gezicht protuberansen op en neer 5 keer. Hierna het ectoderm gemakkelijk loskomen.
- Gebruik een pincet om het gezicht protuberansen te houden. De overige tang losraken de ectoderm langzaam. Figuur 2B toont de gescheiden vellen gezicht ectoderm.
- Gebruik een nieuwe lange glazen Pasteur pipet om het gezicht ectoderm over in een 1,5 ml Eppendorf buis met PBS op ijs. Breng het mesenchym op een 1,5 ml Eppendorf buis met PBS op ijs.
- Gebruik nieuwe ijskoude PBS voor elke dissectie. Verzamel monsters.
- Was thij monsters met PBS. Centrifugeer bij 4 ° C, 500 xg gedurende 3 minuten.
- Zuig het PBS met behulp van lange glazen Pasteurpipetten. Als de monsters moeten worden gebruikt voor chip test, gaat u verder met stap 6.1. Voor RNA-extractie, gaat u verder met stap 6.2. Voor Eiwit extractie, gaat u verder met stap 6.3.
6. Proces Monsters voor verdere experimenten
- Monsters voor ChIP assay
- Voeg 1 ml PBS met 1% formaldehyde te verknopen. Homogeniseer de monsters.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min met rotatie.
- Voeg 110 ul van 1,25 M Glycine aan elke buis om ongereageerde formaldehyde blussen.
- En incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Spin bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 3 minuten. Verwijder supernatant.
- Voeg 1 ml koude PBS tot de weefsels te wassen.
- Spin bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 3 minuten.
- Verwijder PBS en herhaal PBS een keer te wassen.
- Verwijder supernatant, Snap bevriezen weefsel in vloeibare stikstof. Bewaar de samples bij -80 ° C voor latere bundelen en verwerken.
- Monsters voor RNA-extractie
- Plaats het gezicht ectoderm en mesenchym in buizen die RNAlater (Ambion).
- Incubeer de monsters in RNAlater oplossing overnacht bij 4 ° C om een volledige penetratie van het weefsel mogelijk te maken.
- Bij -20 ° C voor latere bundelen en verwerken.
- Monsters voor eiwitextractie
Toevoegen lysis buffer om het monster voor verdere verwerking. Of snap bevriezen weefsel in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters bij -80 ° C voor latere bundelen en verwerken.
Opmerkingen
- Tijdsdruk. Plan op 4-6 uur na het begin van dissectie tot het begin van hoofdstuk 6.
- Als bedreven, het duurt ~ 10-15 minuten per embryo uit te voeren secties 4 en 5 (prominentie dissectie en ectoderm scheiding).
- Als de monsters voor RNA-isolatie, elke solution moet worden behandeld met diethylpyrocarbonaat eerste. Ook het reinigen van de tang en het werkgebied met RNase Away.
- Houd de monsters op ijs te allen tijde behalve de Dispase II behandeling en dissecties. Ga verder met nieuwe ijskoude PBS voor elke dissectie te zorgen dat de PBS wordt gebruikt voor dissectie koud is.
- Scherpe tang zijn cruciaal voor nauwkeurige dissectie te verkrijgen. Volledig schoon tang om verontreiniging te voorkomen.
- Voor het verzamelen van monsters van verschillende uitsteeksels, afzonderlijk te ontleden elk bekendheid na Dispase II behandeling. Haal dan de ectoderm en mesenchym.
- Na behandeling met Dispase II, het gezicht ectoderm is eenvoudig los te laten. Besteed speciale aandacht aan besmetting van andere ectoderm. Gooi alle mogelijk besmette weefsel.
- Als je eenmaal begint, niet stoppen totdat de monsters bereikt het juiste punt in hoofdstuk 6. Finish scheiding van gezichts-ectoderm en mesenchym voor alle embryo's zo snel als je kunt.
- De enzyme activiteiten van Dispase II kan anders tussen partijen en merken. Het is noodzakelijk de behandeling aan te passen voor verschillende merken en partijen Dispase II.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na Dispase II behandeling, het ectoderm van het embryo meestal los. Het gezicht uitsteeksels moet intact na sectie (Figuur 2A). De geïsoleerde gezicht ectoderm is helder en vrij van mesenchym weefsel (figuur 2B). De werkzaamheid van het protocol bepalen en kruisbesmetting we getest voorhersenen detecteren uitgedrukt Zic3 9, ectodermale specifieke CDH1 5 en mesenchymale specifieke sox10 10 met reverse transcriptase PCR. Ons onderzoek bevestigde dat zowel gezichts ectoderm en mesenchym de verwachte genen tot expressie en waren vrij van kruisbesmetting (figuur 3).
Figuur 1. Schematische weergave van de muis E10.5 gezicht uitsteeksels. Zijaanzicht (links) van het hoofd en rostrale uitzicht (rechts) van de E10.5 embryo hoofd. Red dotted lijnen geven de grens van het gezicht uitsteeksels. Frontonasal prominentie (FNP), Maxillary voorgrond (MXP), Mandibulaire voorgrond (MDP).
Figuur 2. Uiterlijk van ontleed hele E10.5 gezicht uitsteeksels en gezicht ectoderm. (A) Hele gezicht uitsteeksels. (B) Facial ectoderm. Panels A en B zijn dezelfde vergroting. Plaats in B toont een grotere vergroting van een van de gezichts ectoderm in paneel B. Frontonasal prominentie (FNP), Maxillary voorgrond (MXP), Mandibulaire voorgrond (MDP).
Figuur 3. Reverse transcriptase PCR bevestigd dat zowel gezichts-ectoderm en mesenchym vrij zijn van cross contamination. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit gezicht ectoderm (E) en mesenchym (M). Het RNA werd omgekeerd getranscribeerd in zijn complementaire DNA (cDNA), gevolgd door PCR met specifieke primers om de expressie van beta-actine (B-actine), Zic3, CDH1 en sox10 detecteren. De primer sequenties in tabel 1 werden verkregen van primer bank ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). De PCR producten werden gescheiden op een 2% agarose gel. DNA Ladder (L).
| Gen | Primer naam | sequenties | Grootte van het product |
| Beta-actine | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bp |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bp |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bp |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bp |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tabel 1. Primersequenties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een eenvoudige methode om embryonale muis gezicht ectoderm en mesenchym op basis van een eerste Dispase II behandeling stap te scheiden. In eerdere studies hebben we uitgevoerd ontleding van het gezicht verhevenheden vóór Dispase II behandeling, maar we hebben consistent gevonden dat het mesenchym wordt "sticky" en moeilijk te manipuleren. Onze nieuwe protocol voorkomt dit probleem. Combinatie Dispase II behandeling met zachte fysieke geweld door en neer te pipetteren maakt scheiding van ectoderm en mesenchym gemakkelijker. Verder is dit protocol werkt ook goed voor het scheiden van andere embryonale ectoderm en mesenchym monsters, zoals ledematen ectoderm en mesenchym met kortere Dispase II behandeling. Ook kan het gebruikt worden in andere stadia van ontwikkeling - bijvoorbeeld voor het scheiden E11.5 gezichts ectoderm en mesenchym een langere Dispase II behandelingsstap.
De steekproefgrootte is verkregen van een E10.5 muis gezichtsbehandeling Prominheid is vrij klein en daarom hebben we de neiging om partijen op te slaan voor eventueel de verwerking en analyse. In dit verband moet pool ectodermale samples 100-150 embryo's te verkrijgen 10 mg weefsel. Een grotere hoeveelheid mesenchym is afgeleid van elk embryo die minder pooling. De opbrengst van gesoniceerd genomisch DNA voor ChIP assay is ongeveer 80 ug van 10 mg gezicht ectoderm. De totale RNA opbrengst is ongeveer 20 ug per 10 mg gezicht ectoderm. Uit een vergelijkende Bradford eiwittest schatten we dat we verkrijgen tot 1 mg eiwit per 10 mg gezicht ectoderm. Zodra de RNA, chromatine of eiwitmonsters in kant kunnen ze worden gebruikt voor verschillende assays waaronder eiwitdetectie, ChIP assay, microarray en RNA-seq. Daarom is dit protocol maakt een grondige analyse van differentiële genexpressie, epigenetische modificatie, en transcriptie factor binding die verantwoordelijk is voor de moleculaire overspraak tussen gezichts-ectoderm en mesenchym tijdens de embryonale ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende belangen of andere conflicten in verband met de inhoud van dit artikel.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Irene Choi bedanken voor het illustreren van embryo hoofden in figuur 1 en de andere leden van het laboratorium voor hulp en discussie. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
