Summary
Ein Protokoll für die Trennung von Embryos Gesichts Ektoderm und Mesenchym beschrieben. Wir verwenden Dispase II ganzen Embryonen ersten Behandlung, sezieren gesamten Gesichtsbereich Protuberanzen aus, und trennen Sie dann den Gesichtsausdruck Ektoderm und Mesenchym.
Abstract
Orofazialen Spalten sind die häufigsten kraniofazialen Defekten, die 1,5 Einfluss von 1.000 Neugeborenen weltweit 1,2. Orofazialen Spaltbildung durch abnorme Entwicklung des Gesichtes 3 verursacht. Im menschlichen und Maus, anfängliche Wachstum und Strukturieren des Gesichts basiert auf mehreren kleinen Knospen von Gewebe, die Gesichtszüge Protuberanzen 4,5. Gepaart frontal Nasenfortsätze (FNP), Kiefer Protuberanzen (MXP) und Unterkiefer Protuberanzen (MDP): Das Gesicht wird von sechs Protuberanzen abgeleitet. Diese Protuberanzen aus Schwellungen des Bindegewebes, die eingehüllt in eine darüberliegende Epithel sind. Studies in mehreren Arten haben gezeigt, dass Signalisierung Übersprechen zwischen Gesichts Ektoderm und Mesenchym ist entscheidend für die Gestaltung der Fläche 6. Dennoch sind mechanistische Details hinsichtlich der Gene in diesen Melderelais beteiligt fehlen. Ein Weg, um ein umfassendes Verständnis der Genexpression zu gewinnen, Transkriptionsfaktorbindungsstellen und Chromatin Marken mit dem entwickelte assoziiertping Gesichts Ektoderm und Mesenchym ist zu isolieren und zu charakterisieren, die getrennten Gewebegruppen.
Hier stellen wir ein Verfahren zum Trennen Gesichts Ektoderm und Mesenchym am embryonalen Tag (E) 10.5, eine kritische Entwicklungsstadium in Maus Gesichts Formation, die Fusion der Protuberanzen vorausgeht. Unsere Methode wird aus dem Ansatz, den wir zuvor zum Präparieren Gesichts Protuberanzen 7 verwendet haben, angepasst. In dieser früheren Studie hatten wir Inzucht C57BL eingesetzt / 6 Mäusen als dieser Sorte hat sich zu einem Standard für Genetik, Genomik und Gesichtsmorphologie 8. Hier jedoch aufgrund der beschränkten Mengen mehr von Gewebe vorhanden, haben wir die outbred CD-1-Stamm, der billiger ist erhältlich, robuster für Tierhaltung genutzt, und die dazu neigt, mehr Embryonen (12-18) pro Wurf als jede Inzuchtlinie produzieren Mausstamm 8. Nach Embryos Isolierung wurde neutrale Protease Dispase II verwendet werden, um den gesamten Embryo zu behandeln. Dann wurden die Gesichts Protuberanzen sezierened aus, und die Gesichtszüge Ektoderm wurde aus dem Mesenchym getrennt. Diese Methode hält sowohl die Gesichts Ektoderm und Mesenchym intakt. Die Proben unter Verwendung dieser Methodik kann für Techniken einschließlich Protein-Erkennung, Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Assay, Microarray-Studien und RNA-seq verwendet werden.
Protocol
Ein. Planen Dispase II
- Ansetzen Hepes-gepufferter Kochsalzlösung (HBS) (50 mM Hepes / KOH, pH 7,4, 150 mM NaCl). 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 und 1,2 ml 2,5 M NaCl in 16,8 ml Reinstwasser H 2 O.
- Machen Sie 10 mg / ml Dispase II. Wiegen 0,2 g Dispase II (Roche, Kat. Nr. 4942078001) und löst in 20 ml HBS. Bereiten Sie 1,0 ml Aliquots in einzelnen Eppendorf-Röhrchen und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung.
- Verdünnte 10 mg / ml Dispase II 1:10 in PBS vor der Verwendung. Legen Sie die verdünnte Dispase II auf Eis.
2. Dissect CD-1 E10.5 Embryonen aus Schwangere Frauen
Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der University of Colorado Denver (UCD) Animal Care & Verwendungen gebilligten durchgeführt. CD-1 (ICR)-Mäuse wurden von Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) erhalten.
- Reinigen Sie die Dissektion Bereich und Werkzeuge mit 70% Ethanol.
- Einschläfern schwangere CD-1 female mit FREIGABEed Protokolle.
- Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol öffnen Sie dann den Bauch. Verwenden Sie eine Reihe von Zangen, um die Gebärmutter und ein anderes zu ziehen, um losreißen die mesometrium aus der Gebärmutter. Entfernen der Gebärmutter aus dem Körper. Wiederholen Sie dies für Uterushorn auf der anderen Seite des Bauches.
- Kurz abspülen die Gebärmutter mit eiskaltem PBS in einem 10-cm-Petrischale zu waschen Blut.
- Übertragen des Uterus in eine neue Petrischale mit eiskaltem PBS. Trennen in ein-Embryo-Fragmente durch Schneiden zwischen Nidationsstellen.
- Übertragen eines Embryos in eiskaltes PBS unter einem Stereomikroskop. Verwenden feinen Pinzette zum Abreißen der muskulösen Wand der Gebärmutter beginnt an einem der cut Websites, um den Embryo mit dem Dottersack aussetzen. Peel off der Dottersack und Amnion. Übertragen seziert Embryos zu einer 6-cm-Petrischale mit PBS auf Eis. Fortschreiten, bis alle Embryonen auf diese Weise gesammelt worden sind.
3. Dispase II Treatment
- Waschen Sie alle Embryonen mit PBS in einer 6-cm-Petrischale. ErsetzenPBS mit 10 ml verdünntem Dispase II in PBS. Decken Sie die Petrischale und bei 37 ° C für 25 min - eine bakterielle Inkubator oder warmen Raum sollte ausreichen - wir haben keine CO 2 Gewebekultur-Inkubator für diesen Schritt verwendet.
- Nehmen Sie die Petrischale aus und beobachten Sie den Embryo unter einem Stereomikroskop. Das Ektoderm sollten gelockert haben, verkörpert durch eine deutliche Kluft zwischen diesem Gewebe Schicht und der darunterliegenden Mesenchym. Wenn nicht, werden für weitere 5 min bei 37 ° C inkubieren Dann legen Sie die Petrischale auf Eis.
4. Sezieren Sie die Intact Facial Protuberanzen
- Verwenden Sie eine Einweg-Glaspipette (VWR, Kat. Nr. 14672-380) übertragen ein Dispase II behandelten Embryos in eiskaltem PBS in einem 6-cm-Petrischale unter einem Stereomikroskop.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Embryo zu halten. Verwenden Sie ein anderes Paar von feinen Pinzette vorsichtig auf die Grenzen der Gesichtsmuskeln Protuberanzen an Kopf (Abbildung 1 zeigt die Grenzen der geschnittendie Gesichtszüge Protuberanzen). Starten Sie von einer Seite des MnP, dann der MxP und zuletzt der FNP. Machen Sie dasselbe auf der anderen Seite die Gesichts Protuberanzen aus intakten (2A) zu sezieren.
5. Separate Facial Ektoderm aus Mesenchym
- Beachten Sie die Gesichts Protuberanzen unter einem Stereomikroskop mit 3x Arbeitsabstand. Verwenden Sie eine lange Glas-Pasteur-Pipette vorsichtig pipettieren die Gesichtszüge Protuberanzen nach oben und unten 5 mal. Danach ist das Ektoderm leicht abziehbar.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Gesichtszüge Protuberanzen zu halten. Mit der anderen Pinzette zum Abziehen der Ektoderm sehr langsam. 2B zeigt die getrennten Platten von Gesichts-Ektoderm.
- Verwenden Sie einen neuen langen Glas Pasteur Pipette, um die Gesichtszüge Ektoderm in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen übertragen mit PBS auf Eis. Übertragen Sie das Mesenchym um weitere 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit PBS auf Eis.
- Verwenden Sie neue eiskaltem PBS für jede Präparation. Die Proben.
- Waschen ter Proben mit PBS. Zentrifuge bei 4 ° C, 500 × g für 3 min.
- Saugen Sie die PBS mit langen Glas Pasteur Pipetten. Wenn die Proben für ChIP-Assay verwendet werden, gehen auf 6,1 fort. Für die RNA-Extraktion, fahren 6,2 fort. Für Protein-Extraktion, fahren 6,3 fort.
6. Prozess Proben für weitere Experimente
- Proben für ChIP-Assay
- 1 ml PBS mit 1% Formaldehyd zu vernetzen. Homogenisieren der Proben.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min mit der Drehung.
- Fügen Sie 110 ul 1,25 M Glycin in jedes Röhrchen, um nicht umgesetzte Formaldehyd zu stillen.
- Mischen und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
- Spin bei 500 × g bei 4 ° C für 3 min. Überstand entfernen.
- 1 ml kaltem PBS, um das Gewebe zu waschen.
- Spin bei 500 × g bei 4 ° C für 3 min.
- Entfernen PBS und wiederholen PBS einmal zu waschen.
- Überstand abnehmen, Schnellfrostmedium das Gewebe in flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie das samples bei -80 ° C für die anschließende Bündelung und Verarbeitung.
- Proben zur RNA-Extraktion
- Legen Sie die Gesichts Ektoderm und Mesenchym in Röhrchen mit RNAlater (Ambion).
- Inkubieren Sie die Proben in RNAlater Lösung über Nacht bei 4 ° C, um eine gründliche Durchdringung des Gewebes ermöglichen.
- Lagerung bei -20 ° C für die anschließende Bündelung und Verarbeitung.
- Beispiele für Protein-Extraktions-
Fügen Lysepuffer zur Probe für die anschließende Verarbeitung. Oder Schnellfrostmedium das Gewebe in flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die Proben bei -80 ° C für die anschließende Bündelung und Verarbeitung.
Aufzeichnungen
- Zeitdruck. Planen Sie auf 4-6 Stunden ab Beginn der Dissektion bis zum Beginn des Abschnitts 6.
- Wenn beherrschen, dauert es ~ 10-15 min pro Embryo den Abschnitten 4 und 5 (Prominenz Dissektion und Ektoderm Trennung) durchzuführen.
- Wenn die Proben zur RNA-Isolierung, jedes solution sollte mit Diethylpyrocarbonat zuerst behandelt werden. Reinigen Sie auch die Pinzette und die Arbeitsfläche mit RNase Away.
- Bewahren Sie die Proben auf Eis zu allen Zeiten mit Ausnahme der Dispase II Behandlung und Dissektionen. Umstellung auf neue eiskaltem PBS für jeden Dissektion sicherstellen, dass die PBS für die Präparation verwendet kalt ist.
- Sharp Pinzette sind entscheidend, um genaue Sezieren zu erhalten. Reinigen Sie die Zange vollständig, um eine Kontamination zu verhindern.
- Zum Sammeln von Proben aus verschiedenen Protuberanzen, sezieren jeden Prominenz separat nach Dispase II Behandlung. Dann trennen Sie die Ektoderm und Mesenchym.
- Nach der Behandlung mit Dispase II, ist die Gesichts Ektoderm leicht abziehbar. Achten Sie besonders auf Kontamination mit anderen Ektoderm. Entsorgen Sie alle potentiell kontaminierten Gewebe.
- Sobald Sie anfangen, nicht aufhören, bis die Proben den entsprechenden Punkt in Abschnitt 6 zu erreichen. Fertig Trennung von Gesichts Ektoderm und Mesenchym für alle Embryonen, so schnell wie du kannst.
- Die Enzyme Aktivitäten Dispase II könnte anders sein, zwischen den Chargen und Marken. Es ist notwendig, die Behandlung bei verschiedenen Marken und Chargen Dispase II einzustellen.
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Representative Results
Nach Dispase II Behandlung, neigt das Ektoderm des Embryos locker zu sein. Die Gesichtszüge Protuberanzen sollte intakt sein nach der Sektion (Abbildung 2A). Die isolierte Gesichts Ektoderm ist klar und frei von Mesenchym Gewebe (Abbildung 2B). Um die Wirksamkeit des Protokolls zu bestimmen und um eine Kreuzkontamination wir getestet Vorderhirn detektieren ausgedrückt Zic3 9, ektodermalen spezifischen CDH1 5 und mesenchymalen spezifischen Sox10 10 mittels Reverse-Transkriptase-PCR. Unsere Studien bestätigt, dass sowohl Gesichts Ektoderm und Mesenchym die erwarteten Gene exprimiert und waren frei von Kreuzkontamination (Abbildung 3).
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Maus E10.5 Gesichts Protuberanzen. Seitenansicht (links) des Kopfes und rostral (rechts) des E10.5 Embryos Kopf. Red dotted Linien zeigen die Grenzen der Gesichtsmuskeln Protuberanzen. Frontonasalen Prominenz (FNP), Kiefer Prominenz (MXP), Unterkiefer Prominenz (MDP).
Abbildung 2. Aussehen seziert ganzen E10.5 Gesichts Protuberanzen und Gesichts Ektoderm. (A) insgesamt Gesichts Protuberanzen. (B) Facial Ektoderm. Felder A und B sind die gleichen Vergrößerung. Einlage im B zeigt höherer Vergrößerung eines der Gesichts Ektoderm in Panel B. Frontonasalen Prominenz (FNP), Kiefer Prominenz (MXP), Unterkiefer Prominenz (MDP).
Abbildung 3. Reverse-Transkriptase-PCR bestätigt, dass sowohl Gesichts Ektoderm und Mesenchym frei von Cross Zusammenarbeit sindntamination. Gesamt-RNA wurde aus Gesichts Ektoderm (E) und Mesenchym (M) extrahiert. Die RNA wurde revers in seine komplementäre DNA (cDNA), die durch PCR mit spezifischen Primern gefolgt, um die Expression von Beta-Aktin (B-Actin), Zic3, CDH1 und Sox10 detektieren transkribiert. Die Primersequenzen in Tabelle 1 wurden aus Primer Bank (erhalten http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). Die PCR-Produkte wurden auf einem 2% igen Agarosegel abgetrennt. DNA Ladder (L).
| Gen | Primer Namen | Sequenzen | Produkt-Größe |
| Beta-Actin | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bp |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bp |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bp |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| Sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bp |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tabelle 1. Primersequenzen.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um embryonale Maus Gesichts Ektoderm und Mesenchym auf einer anfänglichen Dispase II Behandlungsschritt Basis zu trennen. In früheren Studien haben wir Dissektion der Gesichtsmuskeln Protuberanzen vor Dispase II Behandlung durchgeführt, aber wir haben immer wieder festgestellt, dass das Mesenchym "klebrig" und schwieriger zu manipulieren wird. Unser neues Protokoll vermeidet dieses Problem. Kombination Dispase II Behandlung mit sanfte körperliche Gewalt durch Auf-und Abpipettieren macht die Trennung von Ektoderm und Mesenchym einfacher. Ferner dieses Protokoll funktioniert auch gut zur Trennung von anderen embryonalen Ektoderm und Mesenchym Proben wie Gliedmaßenknospe Ektoderm und Mesenchym mit kürzeren Dispase II Behandlung. Ebenso kann es in anderen Stadien der Entwicklung verwendet werden - zum Beispiel zur Trennung E11.5 Gesichts Ektoderm und Mesenchym mit einer längeren Dispase II Behandlungsschritt.
Der Stichprobenumfang von einem E10.5 Maus Gesichts Promin erhaltenENCE ist recht klein und daher neigen wir dazu, Chargen für eventuell Verarbeitung und Analyse zu speichern. In dieser Hinsicht ist es erforderlich, Pool ektodermalen Proben 100 bis 150 Embryonen bis 10 mg Gewebe zu erhalten. Eine größere Menge an Mesenchym wird von jedem Embryo erfordert weniger Bündelung abgeleitet. Die Ausbeute von beschallten genomische DNA für ChIP-Assay ist etwa 80 ug von 10 mg Gesichts Ektoderm. Die Gesamt-RNA Ausbeute beträgt ca. 20 g pro 10 mg Gesichts Ektoderm. Aus einer vergleichenden Bradford-Protein-Assay, schätzen wir, dass wir erhalten bis zu 1 mg Protein pro 10 mg Gesichts Ektoderm. Nachdem die RNA, Chromatin oder der Proteinproben in Hand sind, können sie für zahlreiche Assays einschließlich Proteinnachweis, ChIP Assay, Mikroarray-Analyse und RNA-seq ausgenutzt werden. Daher ermöglicht dieses Protokoll eine gründliche Analyse der differentiellen Genexpression, epigenetische Modifikation und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen für die molekulare Übersprechen zwischen Gesichts Ektoderm und Mesenchym während der embryonalen Entwicklung.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen oder andere Konflikte mit dem Inhalt dieses Artikels verbunden.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Irene Choi zur Veranschaulichung Embryos Köpfe in Abb. 1 und den anderen Mitgliedern des Labors für Hilfe und Diskussion danken. Diese Arbeit wird durch NIH DE012728 (TW) unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
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