Summary
פרוטוקול להפרדה של אקטודרם וmesenchyme פן עובר מתואר. אנו משתמשים Dispase השני לטיפול בעוברים שלמים ראשון, לנתח בליטות פן שלמות, ואז להפריד אקטודרם וmesenchyme הפנים.
Abstract
בתרי Orofacial הם מומי Craniofacial השכיחים ביותר, אשר משפיעים על 1.5 ב1,2 1,000 תינוקות ברחבי העולם. clefting Orofacial נגרם על ידי 3 פיתוח פנים לא נורמלים. באדם ובעכבר צמיחה, ראשונית ודפוסים של הפנייה מסתמך על מספר קטנות של רקמת בלוטות, את בליטות פן 4,5. הפנים נגזרו משש בליטות עיקריות: תהליכי אף קדמיים לזווג (FNP), בליטות לסת עליונות (MXP) ובליטות בלסת תחתונה (MDP). בליטות אלה מורכבות מנפיחויות של mesenchyme שנארזות האפיתל שמעליה. מחקרים במינים רבים הראו כי איתות דיבור בין אקטודרם וmesenchyme פנים היא קריטית לעיצוב פני 6. עם זאת, פרטים הנוגעים מכניסטית של הגנים המעורבים בממסרי איתות אלה חסרים. אחת דרכים להגיע להבנה מקיפה של ביטוי גנים, גורם שעתוק מחייב, וסימנים הקשורים לכרומטין develoאקטודרם וmesenchyme פן פינג הוא לבודד ולאפיין את תאי רקמות המופרדות.
כאן אנו מציגים שיטה להפרדת אקטודרם וmesenchyme פן ביום עוברי (E) 10.5, שלב ההתפתחותי קריטי בהיווצרות פן עכבר שמקדימה היתוך של הבליטות. השיטה שלנו מותאמת לגישה ששמשנו בעבר לביתור בליטות פן 7. במחקר מוקדם יותר שהעסקנו C57BL לדה / 6 עכברים כזן זה הפך להיות סטנדרט לגנטיקה, גנומיקה והמורפולוגיה של פנים 8. כאן, לעומת זאת, בשל כמויות המוגבלות יותר של רקמה זמינה, יש לנו מנוצלים מתח outbred תקליטור-1 שהוא זול יותר לרכישה, חזק יותר לגידול בעלי, ונוטים לייצר יותר עוברים (12-18) בכל המלטה מאשר כל לדה עכבר זן 8. בעקבות בידוד עובר, פרוטאז ניטראלי Dispase השני שמש לטיפול בכל העובר. ואז, את בליטות פן היו לנתחאד החוצה, ואקטודרם הפנים הופרדו מmesenchyme. שיטה זו שומרת גם אקטודרם וmesenchyme הפנים ללא פגע. הדגימות שהתקבלו באמצעות מתודולוגיה זו יכולה לשמש לטכניקות כוללים זיהוי חלבון, הכרומטין assay immunoprecipitation (שבב), מחקרי microarray, ו-RNA-seq.
Protocol
1. הכן Dispase השני
- הכן טרי Hepes שנאגר מלוח (HBS) (50 מ"מ / Hepes KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). הוסף 2 המ"ל 0.5 מ 'Hepes / KOH pH 7.4 ו -1.2 המ"ל M NaCl 2.5 ל16.8 המ"ל ultrapure H 2 O.
- הפוך 10 מ"ג / מיליליטר Dispase שני. שוקל 0.2 גרם Dispase השני (רוש, חתול # 4942078001) ולהתמוסס ב20 המ"ל HBS. הכן 1.0 aliquots מ"ל בצינורות הבודדים Eppendorf ולאחסן ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
- לדלל 10 מ"ג / מיליליטר Dispase השני 1:10 ב PBS לפני השימוש. שים Dispase השני המדוללת על קרח.
2. לנתח CD 1-עוברי E10.5 מנקבה בהריון
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו דנבר (UCD) טיפול בבעלי החיים ושימוש בועדה. התקליטור-1 (ICR), התקבלו מעכברי הרלן מעבדות (אינדיאנפוליס, אינדיאנה).
- נקה את אזור הנתיחה וכלים עם אתנול 70%.
- להרדים נשי CD-1 הריון באמצעות approvפרוטוקולי אד.
- לרסס את הבטן עם אתנול 70% ואז לפתוח את הבטן. השתמש במערכת אחת של מלקחיים למשוך את הרחם ועוד לקרוע mesometrium מהרחם. להוציא את הרחם מהגוף. חזור לקרן רחם בצד השני של הבטן.
- בקצרה שטיפת הרחם עם הקרח הקר PBS בצלחת פטרי 10-סנטימטר לשטוף את הדם.
- להעביר את הרחם לצלחת פטרי חדשה עם הקרח הקר PBS. נפרד לרסיסים, שעוברים אחד על ידי חיתוך בין אתרי השתלה.
- העברה עוברת אחד לתוך PBS קר כקרח תחת stereomicroscope. השתמש במלקחיים עדינים לקרוע את הדופן השרירי של רחם מתחיל באחד מהאתרים לגזור כדי לחשוף את העובר וצק החלמון. לקלף את צק החלמון וamnion. חזרת עוברים גזורים לצלחת פטרי 6-סנטימטר עם PBS על קרח. המשך עד שכל העוברים שנאספו בדרך זו.
3. Dispase השני טיפול
- שטוף את כל העוברים בעלי PBS בצלחת פטרי 6-סנטימטר. להחליףPBS עם 10 מ"ל Dispase השני מדוללות ב PBS. מכסה את התבנית ולדגור פטרי על 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות - חממת חיידקים או חדר חם צריכה להספיק - אנחנו לא השתמשנו CO 2 רקמת תרבות חממה לצעד זה.
- קח צלחת פטרי החוצה ולצפות את העובר תחת מיקרוסקופ סטראוסקופי. אקטודרם צריך להיות משוחרר, מאופיין בפער ברור בין שכבה זו רקמה וmesenchyme הבסיסי. אם לא, דגירה במשך 5 דקות נוספות ב 37 ° C. ואז לשים את צלחת פטרי על קרח.
4. לנתח את בליטות פן אינטקט
- השתמש בכוס טפטפה פנוי (VWR, חתול # 14672-380) להעביר את אחד Dispase השני התייחס לעובר PBS קר כקרח בצלחת פטרי 6-סנטימטרים מתחת stereomicroscope.
- השתמש בזוג אחד של מלקחיים להחזיק את העובר. השתמש בזוג נוסף של מלקחיים עדינים בזהירות לחתוך את גבולות בליטות פנים המצורפים לראש (איור 1 מציג את הגבולותאת בליטות פנים). התחל מצד אחד של MNP, אז MXP, והאחרון FNP. לעשות את אותו הדבר לצד השני כדי לנתח את בליטות פן החוצה ללא פגע (איור 2 א).
5. אקטודרם פן נפרד מmesenchyme
- שים לב לבליטות פן תחת stereomicroscope עם מרחק עבודת 3x. השתמש בזכוכית ארוכה פסטר פיפטה עדינות פיפטה מעלה ומטה 5 פעמים את בליטות פן. אחרי זה, אקטודרם קל לקלף.
- השתמש בזוג אחד של מלקחיים להחזיק את בליטות פן. השתמש בזוג השני של מלקחיים להתקלף אקטודרם לאט מאוד. 2B האיור מציג את הגיליונות הנפרדים של אקטודרם פנים.
- השתמש בזכוכית ארוכה פסטר פיפטה חדשה להעביר אקטודרם הפנים לתוך 1.5 מ"ל אפנדורף צינור עם PBS על קרח. העברת mesenchyme ל1.5 מ"ל אפנדורף צינור אחר עם PBS על קרח.
- השתמש בקרח הקר PBS החדש לכל נתיחה. לאסוף דגימות.
- שטוף tהוא דוגם עם PBS. צנטריפוגה ב 4 ° C, 500 XG ל3 דקות.
- לשאוב PBS באמצעות pipettes ארוך הזכוכית פסטר. אם הדגימות הן לשמש לבדיקת שבבים, המשך לשלב 6.1. להפקת RNA, המשך לשלב 6.2. להפקת חלבון, המשך לשלב 6.3.
6. דוגמאות לתהליך ניסויים נוספים
- דגימות לבדיקת שבב
- הוסף 1 המ"ל PBS עם פורמלדהיד 1% לcrosslink. הומוגני הדגימות.
- דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ברוטציה.
- הוסף 110 μl של 1.25 מ 'גליצין לכל מבחנה כדי להרוות פורמלדהיד unreacted.
- לערבב ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- ספין ב 500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הסרת supernatant.
- הוסף 1 המ"ל PBS הקר כדי לשטוף את הרקמות.
- ספין ב 500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
- הסר PBS ולחזור PBS לשטוף פעם אחת.
- הסרת supernatant, צמד להקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי. אחסן samples ב-80 ° C לאיגום ועיבוד שלאחר מכן.
- דוגמאות לרנ"א חילוץ
- הנח אקטודרם וmesenchyme הפנים בצינורות המכילים RNAlater (Ambion).
- דגירת הדגימות בפתרון בין הלילה ב 4 ° C כדי לאפשר חדיר יסודית של רקמת RNAlater.
- חנות ב -20 ° C לאיגום ועיבוד שלאחר מכן.
- דוגמאות למיצוי חלבון
הוסף חיץ תמוגה לדוגמא לעיבוד שלאחר מכן. או להישבר להקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס במשך איגום עוקב ועיבוד.
הערות
- אילוצי זמן. מתכנן על 4-6 שעות ממועד תחילת הנתיחה דרך לתחילת הסעיף 6.
- כשבקיא, זה לוקח ~ 10-15 דקות לעובר לביצוע סעיפים 4 ו 5 (דיסקציה בולטות והפרדת אקטודרם).
- אם דגימות לבידוד RNA, כל solution צריך להיות מטופלים עם Diethylpyrocarbonate הראשון. גם לנקות את המלקחיים ואזור עבודה עם RNase Away.
- שמור את הדגימות על קרח בכל העת, פרט לטיפול וניתוחי Dispase השני. שינוי לקרח הקר PBS החדש לכל נתיחה לוודא PBS משמש לנתיחה הוא קר.
- מלקחיים חדים הם קריטיים להשגת נתיחה מדויקת. נקה את המלקחיים לחלוטין כדי למנוע כל זיהום.
- לאיסוף דגימות מבליטות שונות, לנתח את כל גדולה בנפרד לאחר הטיפול השני Dispase. לאחר מכן נפרד אקטודרם וmesenchyme.
- לאחר הטיפול בDispase השני, אקטודרם פן קל לקלף. שים לב במיוחד לזיהום מאקטודרם האחר. תמחק את כל הרקמות המזוהמות פוטנציאלי.
- ברגע שתתחיל, לא להפסיק עד שהדגימות תגענה לנקודה המתאימה בסעיף 6. סיום הפרדת אקטודרם פנים וmesenchyme לכל העוברים מהר ככל שאתה יכול.
- הדוארפעילויות nzyme של Dispase השני עשויות להיות שונות בין קבוצות ומותגים. זה הכרחי כדי להתאים את זמן הטיפול למותגים ולקבוצות של Dispase השני שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר הטיפול השני Dispase, אקטודרם של העובר נוטה להיות רופף. את בליטות פן צריכות להיות שלמות לאחר נתיחה (איור 2 א). אקטודרם הפנים המבודדים ברור וללא רקמות mesenchyme (איור 2 ב '). כדי לקבוע את היעילות של הפרוטוקול ולזהות זיהום לחצות אנחנו assayed למוח הקדמי הביעו Zic3 9, ectodermal cdh1 5 ספציפיים וsox10 10 ספציפיים mesenchymal באמצעות transcriptase PCR ההפוך. המחקרים שלנו אשרו שגם אקטודרם וmesenchyme פנים הביעו את הגנים הצפויים והיו נקיים מזיהום צולב (איור 3).
איור 1. תרשים סכמטי מראה בליטות עכבר E10.5 פן. נוף צדדי (משמאל) של הראש והמבט מקורי (מימין) של ראש עובר E10.5. האדום dotteקווי d מציינים את הגבול של בליטות פן. בולטות Frontonasal (FNP), בולטות לסת עליונות (MXP), בולטות mandibular (MDP).
איור 2. מראה של בליטות נתחו בE10.5 פן ואקטודרם פנים. () בליטות פן שלמות. (ב) אקטודרם פן. פנלי A ו-B הם אותה גדלה. הכנס בB מראה גבוהה יותר גדלה של אחד אקטודרם הפנים בפנל ב '. בולטות Frontonasal (FNP), בולטות לסת עליונות (MXP), בולטות mandibular (MDP).
איור 3. Reverse transcriptase PCR אשר כי גם אקטודרם וmesenchyme פנים הם ללא שיתוף צלבסך רנ"א ntamination. היה שחולץ מן אקטודרם פנים (E) וmesenchyme (M). RNA היה עבד הפוך לתוך הדנ"א שלו משלים (cDNA), ואחרי PCR עם פריימרים ספציפיים כדי לזהות את הביטוי של בטא יקטין (B-יקטין), Zic3, cdh1 וsox10. רצפי פריימר בטבלת 1 נלקחו מבנק פריימר (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). מוצרי PCR הופרדו על ג'ל agarose 2%. סולם הדנ"א (L).
| גן | שם פריימר | רצפים | גודל מוצר |
| בטא תקטין | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 נ"ב |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 נ"ב |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| cdh1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 נ"ב |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 נ"ב |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
טבלת 1. רצפי פריימר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה להפריד אקטודרם העוברי עכבר פנים וmesenchyme מבוסס על צעד טיפול ראשוני Dispase השני. במחקרים קודמים, שבוצענו נתיחה של בליטות פן לפני הטיפול השני Dispase, אבל אנחנו עקביים מצאנו כי mesenchyme הופך להיות "דביק" וקשה יותר לתמרון. הפרוטוקול החדש שלנו מונע את הבעיה הזו. טיפול בכוח פיזי מתון על ידי pipetting למעלה ולמטה שילוב Dispase השני עושה הפרדת אקטודרם וmesenchyme קל יותר. יתר על כן, בפרוטוקול זה גם עובד היטב להפרדת דגימות אחרות עובריות אקטודרם וmesenchyme, כגון אקטודרם גפת ניצן וmesenchyme עם טיפול השני Dispase קצר יותר. כמו כן, ניתן להשתמש בו בשלבים אחרים של התפתחות - למשל, להפרדת אקטודרם וmesenchyme פן E11.5 בצעד השני Dispase טיפול ארוך יותר.
גודל המדגם שהתקבל מE10.5 עכבר פן prominence הוא די קטן, ולכן אנו נוטים לאגור יצוות לעיבוד וניתוח סופו של דבר. בהקשר זה יש צורך דגימות ברכת ectodermal 100-150 עוברים לקבל 10 מ"ג של רקמה. כמות גדולה של mesenchyme נגזרת מכל עובר דורש פחות pooling. התשואה של הדנ"א הגנומי sonicated עבור assay שבבים היא כ 80 מיקרוגרם מאקטודרם 10 מ"ג פן. סה"כ תשואת RNA היא כ 20 מיקרוגרם לאקטודרם 10 מ"ג פן. מבדיקת חלבון ברדפורד השוואתית, אנו מעריכים כי אנו יכולים להשיג עד לחלבון 1 מ"ג לאקטודרם 10 מ"ג פן. ברגע שרנ"א, הכרומטין, או דגימות חלבון הוא ביד, הם יכולים להיות מנוצלים עבור מבחנים רבים, כולל זיהוי חלבון, בדיקת שבבים, ניתוח microarray, ו-RNA-seq. לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מעמיק של ביטוי גן הפרש, שינוי epigenetic, ומחייב גורמים שעתוק האחראים לcrosstalk המולקולרי בין אקטודרם וmesenchyme פנים במהלך התפתחות עוברית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין אינטרסים מתחרים או קונפליקטים אחרים הקשורות לתוכן של מאמר זה.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לאיירין צ'וי להמחשת ראשי עובר באיור 1 ושאר חברי המעבדה לעזרה ודיון. עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
