Summary
Embriyo yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılması için bir protokol tanımlanmıştır. Biz, ilk bütün embriyolar tedavisinde tüm yüz çıkıntıları üzerinden incelemek dispase II kullanın ve sonra yüz ektoderm ve mezenşimi ayırın.
Abstract
Orofasiyal yarıkların 1000 bebekten dünya çapında 1,2 1,5 etkileyen en sık kraniofasiyal defektlerin vardır. Orofasiyal yarıklaşmanın anormal yüz gelişme 3 neden olur. Yüz insan ve fare, ilk büyüme ve desenlendirme içindeki doku birkaç küçük tomurcukları, 4,5 yüz çıkıntıları dayanır. Eşleştirilmiş frontal burun süreçler (FNP), maksiller çıkıntıların (MXP) ve mandibular çıkıntıların (MdP): yüz altı ana çıkıntıların türetilmiştir. Bu çıkıntılar bir örten epitel kaplı bulunmaktadır mezenşimi ve şişlikler oluşur. Birden fazla tür çalışmalar yüz ektoderm ve mezenşimi arasındaki karışma sinyal yüzünü 6 şekillendirme için kritik olduğunu göstermiştir. Ancak, bu sinyal röleleri Genlerdeki ilgili mekanistik ayrıntıları eksiktir. Bir gen ekspresyonu kapsamlı bir anlayış kazanmak için bir yol, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve develo ile ilişkili kromatin işaretleriping yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılmış doku kompartmanları izole ve karakterize etmektir.
Burada embriyonik gün (E) 10.5, çıkıntıların füzyon öncesinde fare yüz oluşumunda kritik bir gelişimsel aşamada yüz ektoderm ve mezenşimi ayırmak için bir yöntem mevcut. Bizim yöntemi daha önce yüz çıkıntıları 7 diseksiyon için kullanmış yaklaşımı uyarlanmıştır. Bu önceki çalışmada kendilenmiş C57BL istihdam vardı / Bu zorlanma gibi 6 farelerin genetik, genomik ve yüz morfolojisi 8 için bir standart haline gelmiştir. Burada, buna rağmen, uygun bir doku daha sınırlı miktarlarda nedeniyle, biz hayvancılık için, daha sağlam satın almak daha ucuzdur outbred CD-1 suşu kullanılmıştır ve herhangi kendilenmiş daha çöp başına daha fazla embriyo (12-18) üretmek eğilimi var fare zorlanma 8. Embriyo izolasyon takiben, nötr proteaz dispase II bütün embriyo tedavi etmek için kullanılmıştır. Sonra, yüz çıkıntıları teşrih edildied dışarı ve yüz ektodermden mezenşimi ayrıldı. Bu yöntem, yüz ektoderm ve mezenşim her ikisi de bozulmadan muhafaza eder. Bu yöntemi kullanarak elde edilen örneklerin protein tespiti, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tayini, mikroarray çalışmalar ve RNA-seq dahil teknikleri kullanılabilir.
Protocol
1. Dispase II hazırlayın
- Hazırlama taze Hepes-tamponlu salin (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). 16.8 ml Ultra Saf H 2 O içine 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7.4 ve 1.2 ml 2.5 M NaCl ekle
- 10 mg / ml dispase II olun. 0.2 g dispase II (Roche, Kedi # 4942078001) tartılır ve 20 ml HBS içinde çözülür. Uzun süreli depolama için -20 ° C'de bireysel Eppendorf tüpleri ve mağaza içinde 1.0 ml alikotları hazırlayın.
- Kullanımdan önce PBS içinde 10 mg / ml dispase II 1:10 seyreltin. Buz üzerinde seyreltilmiş dispase II koyun.
2. Hamile Kadın CD-1 E10.5 Embriyolar teşrih
Tüm hayvan deneyleri Colorado Denver Üniversitesi (UCD) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde yapıldı. CD-1 (ICR) fareler Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) elde edildi.
- % 70 etanol ile diseksiyon alanı ve araçları temizleyiniz.
- Approv kullanarak hamile CD-1 kadın Euthanizeed protokolleri.
- % 70 etanol ile karın püskürtün sonra karın açın. Rahim mesometrium uzakta gözyaşı rahim ve başka bir çekmek için forseps bir set kullanın. Gövde, uterus çıkarın. Karın diğer tarafında uterin horn için tekrarlayın.
- Kısaca kan yıkamak için 10 cm Petri kabındaki buz PBS ile rahim durulayın.
- Buz gibi soğuk PBS ile bir yeni bir Petri kabı içine rahim aktarın. Implantasyon siteler arasında keserek tek embriyo parçalara ayırın.
- Bir stereomikroskop altında buz gibi soğuk PBS içine bir embriyo transfer. Yolk kesesi ile embriyonun maruz kesim sitelerinden birini başlayan rahim kas duvarı yırttınız ince forseps kullanın. Yolk kesesi ve amniyon soyun. Buz PBS ile 6 cm Petri kabı disseke embriyo transfer. Tüm embriyolar bu şekilde toplanan edilene kadar devam edin.
3. Dispase II Tedavisi
- 6-santimetrelik bir petri tabağına PBS ile tüm embriyolar yıkayın. DeğiştirmekPBS içinde seyreltilmiş 10 mL dispase II ile PBS ile yıkandı. 25 dakika boyunca 37 ° C'de Petri kabı ve inkübe Kapak - bakteriyel bir inkübatör veya sıcak bir odada yeterli olmalıdır - bu adım için bir CO 2 doku kültürü inkübatör kullanmadım.
- Petri kabı çıkarın ve bir stereomikroskop altında embriyo gözlemlemek. Ektoderm gevşek olması gerektiği, bu doku tabakası ve altta yatan mezenşimi arasında açık bir uçurum tiplemesindeki. Aksi takdirde, 37 bir ek 5 dakika ° C de inkübe Sonra buz üzerinde Petri kabı koyun.
4. Bozulmamış Yüz çıkıntıların üzerinden teşrih
- (VWR, Kedi # 14.672-380) atılabilir cam pipet kullanın Bir stereomikroskop altında bir dispase II 6-santimetrelik bir petri tabağına buz gibi soğuk PBS içine embriyo tedavi aktarmak için.
- Embriyo tutmak için forseps bir çift kullanın. Kafa ve yüz çıkıntıların sınırları (Şekil 1 sınırlarını göstermektedir kesmek için dikkatli bir şekilde ince forseps bir çift kullanımıyüz çıkıntıları). Bir MNP bir tarafında, daha sonra MXP, ve son olarak FNP başlatın. Bozulmamış üzerinden yüz çıkıntıları (Şekil 2A) incelemek için diğer tarafa aynı işlemi uygulayın.
5. Mesenchyme Ayrı Yüz Ektoderm
- 3x çalışma mesafesi ile bir stereomikroskop altında yüz çıkıntıları gözlemleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı 5 kez yüz çıkıntıları Pipeti uzun bir cam Pasteur pipeti kullanın. Bundan sonra, ektoderm soyulmasına kolaydır.
- Yüz çıkıntıları tutun forseps bir çift kullanın. Çok yavaş ektoderm kalkmasına forseps diğer çifti kullanın. Şekil 2B yüz ektoderm ayrılmış sayfaları gösterir.
- Buz PBS ile bir 1.5 ml Eppendorf tüp içine yüz ektoderm aktarmak için yeni bir uzun cam Pasteur pipeti kullanın. Buz PBS ile başka bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne mezenşimi aktarın.
- Her diseksiyon için yeni buz soğuk PBS kullanın. Örnekleri toplayın.
- T yıkayınPBS ile o örnekleri. 4 ° C, 3 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin.
- Uzun cam Pasteur pipetler kullanarak PBS aspire. Örnekler ChIP tahlil için kullanılacak ise, 6.1 adım devam edin. RNA ekstraksiyonu için 6.2 adıma geçin. Protein ekstraksiyonu için 6.3 adıma geçin.
6. Daha Deney için Proses Örnekleri
- ChIP tahlil için örnekler
- Çapraz bağ ile% 1 formaldehit ile 1 ml PBS ekleyin. Örnekler homojenize edilir.
- Rotasyon ile 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
- Tepkimeye girmemiş formaldehit gidermek için her tüpe 1.25 M Glisin 110 ul ekleyin.
- Karıştırılır ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 3 dk için 4 ° C sıcaklıkta 500 x g'de Spin. Süpernatantı.
- Dokulara yıkamak için 1 ml soğuk PBS ekleyin.
- 3 dk için 4 ° C sıcaklıkta 500 x g'de Spin.
- PBS çıkarın ve PBS kez yıkayın tekrarlayın.
- Süpernatantı, sıvı azot içinde doku dondurma oturtun. Sa Mağaza-80 ° C daha sonraki havuzu ve işlenmesi için mples.
- RNA ekstraksiyonu için Örnekler
- RNAlater (Ambion) ihtiva eden tüplerde yüz ektoderm ve mezenşimi yerleştirin.
- ° C doku tam nüfuz izin vermek için gece boyunca 4 RNAlater Çözelti, numuneyi inkübe edin.
- Sonraki havuzu ve işlenmesi için -20 ° C'de saklayın.
- Protein ekstraksiyonu için Örnekler
Sonraki işlemler için örnek lizis tamponu ekleyin. Veya sıvı azot içinde doku dondurma oturtun. -80 ° C daha sonraki havuzu ve işlenmesi için örnekler saklayın.
Notlar
- Zaman kısıtlamaları. Yoluyla diseksiyon baştan Bölüm 6 başlangıcına 4-6 saat üzerinde planlayın.
- Zaman yetkin, bu bölümleri 4 ve 5 (öne diseksiyon ve ektoderm ayırma) gerçekleştirmek için embriyo başına ~ 10-15 dakika sürer.
- Örnekleri RNA izolasyonu, her eriyik için isen ilk Diethylpyrocarbonate ile tedavi edilmelidir. Ayrıca forseps and Away RNaz ile çalışma alanı temizleyin.
- Dispase II tedavi ve diseksiyonu dışında her zaman buz üzerinde örnekler tutun. Diseksiyon için kullanılan PBS soğuk olduğundan emin olmak için her diseksiyon için yeni buz PBS değiştirin.
- Sharp forseps hassas diseksiyon elde etmek için önemlidir. Herhangi bir bulaşmayı önlemek için tamamen forseps temizleyin.
- Farklı çıkıntıların örnekler toplamak için dispase II tedaviden sonra ayrı ayrı öne teşrih. Sonra ektoderm ve mezenşimi ayırın.
- Dispase II ile tedaviden sonra, yüz ektoderm soyulmasına kolaydır. Diğer ektodermden kontaminasyon özellikle dikkat edin. Tüm potansiyel olarak kontamine doku atın.
- Sonra örnekleri 6. Bölümde uygun noktaya ulaşana kadar durmak yok, başlar. Yüz ektoderm ayrılması bitirin ve elinizden geldiğince hızlı olarak tüm embriyolar için mezenşimin.
- Edispase II nzyme faaliyetlerini gruplar ve markalar arasında farklı olabilir. Farklı marka ve dispase II partiler için tedavi süresini ayarlamak için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dispase II Tedaviden sonra, embriyonun ektoderm gevşek olma eğilimindedir. Yüz çıkıntıları diseksiyonu (Şekil 2A) sonra sağlam olmalıdır. İzole yüz ektoderm net ve mezenşimi doku (Şekil 2B) ücretsizdir. Protokolünün etkinliğini belirlemek için ve biz önbeyin için tahlil çapraz kontaminasyon tespit Zic3 9, ektodermal belirli cdh1 5 ve ters transkriptaz PCR kullanarak mezenkimal belirli sox10 10 dile getirdi. Çalışmalarımız yüz ektoderm ve mezenşimi hem beklenen genlerin ifade ve çapraz kontaminasyon (Şekil 3) serbest olduğunu doğruladı.
Şekil 1. Şematik fare E10.5 yüz çıkıntıları gösteren. E10.5 embriyonun baş baş ve rostral görünümü (sağda) Yandan görünüş (sol). Kırmızı dotted çizgi yüz çıkıntıların sınır göstermektedir. Frontonasal öne (FNP), Maksiller önem (MXP), mandibular çıkıntı (MdP).
Şekil 2. Disseke bütün E10.5 yüz çıkıntıları ve yüz ektoderm görünmesi. (A) Tüm yüz çıkıntıları. (B) Yüz ektoderm. Paneller A ve B aynı büyütme vardır. B ekleme panel B olarak yüz ektoderm birinin yüksek bir büyütme göstermektedir. Frontonasal öne (FNP), Maksiller önem (MXP), mandibular çıkıntı (MdP).
Şekil 3,. Transkriptaz PCR Ters yüz ektoderm ve mezenşimi hem çapraz co ücretsiz olduğunu doğruladıntamination. Toplam RNA yüz ektoderm (E) ve mezenşim (M) elde edildi. RNA ters beta-aktin (B-aktin), Zic3, cdh1 ve sox10 ifadesi tespit etmek için spesifik primerler kullanılarak PCR ile takip onun tamamlayıcı DNA 'nm (cDNA), transkripsiyonu edildi. Tablo 1 'de primer dizilerinden primer bankası (elde edilmiştir http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). PCR ürünleri bir% 2 agaroz jeli üzerinde ayrıldı. DNA Ladder (L).
| Gen | Astar adı | diziler | Ürün boyutu |
| Beta-aktin | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bp |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bp |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| cdh1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bp |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bp |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tablo 1. Primer dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, bir ilk dispase II işlenme adımını esas fare embriyonik yüz ektoderm ve mezenşim ayırmak için basit bir yöntem sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarda, önceden dispase II tedavi yüz çıkıntıları diseksiyonu uygulandı, ama biz sürekli mezenşimi "yapışkan" ve işlemek için daha zor hale gelmesidir bulduk. Bizim yeni protokol bu sorunu önler. Kombinasyon dispase II aşağı yukarı pipetleme ve tarafından nazik fiziksel gücü ile tedavi ektoderm ve kolay mezenşimi ayrımı yapar. Ayrıca, bu protokol aynı zamanda kısa dispase II tedavisi ile ekstremite tomurcuğu ektoderm ve mezenşimi gibi diğer embriyonik ektodermden ve mezenşimi örnekleri, ayrılması için iyi çalışır. Benzer şekilde, diğer gelişme aşamalarında kullanılabilmektedir - örneğin, daha uzun bir dispase II muamele adımı ile E11.5 yüz ektoderm ve mezenşim ayrılması için.
Bir E10.5 fare yüz göze çarpan belirgin elde örneklem büyüklüğüence oldukça küçüktür ve bu nedenle sonunda, işleme ve analizi için toplu depolama eğilimindedir. Bu bakımdan, doku, 10 mg elde etmek için 100-150 embriyolardan havuz ektodermal örnekleri için gereklidir. Mezenşimi bir büyük miktarda gerektiren az havuzlama her bir embriyo elde edilir. ChIP tahlil için sonike genomik DNA verimi 10 mg yüz ektoderm yaklaşık 80 ug olup. Toplam RNA verimi 10 mg yüz ektoderm başına yaklaşık 20 mikrogram olduğunu. Karşılaştırmalı Bradford protein tayini itibaren biz 10 mg yüz ektoderm başına 1 mg protein kadar elde edebileceği tahmin. RNA, kromatin veya protein örneklerinin elle girdikten sonra, onlar protein tespiti, ChIP tahlil, mikroarray analizi ve RNA-seq dahil çok sayıda deneyleri için kullanılabilir. Dolayısıyla, bu protokol diferansiyel gen ekspresyonu, epigenetik modifikasyon ve embriyonik gelişim sırasında yüz ektoderm ve mezenşimi arasındaki moleküler karışma sorumlu transkripsiyon faktörü bağlayıcı ayrıntılı bir analiz sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması veya bu makalenin içeriği ile ilişkili diğer çatışmalar var.
Acknowledgments
Yazarlar Şekil 1 ve yardım ve tartışma için laboratuvarın diğer üyeleri embriyonun kafaları göstermek için Irene Choi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe DE012728 (TW) tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
