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Immunology and Infection

La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l'imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

Published: March 20, 2013 doi: 10.3791/50251

Summary

Suivi des cellules en utilisant l'IRM a attiré l'attention remarquable dans les dernières années. Ce protocole décrit le marquage des cellules dendritiques avec le fluor (

Abstract

Progrès continus en matière modalités d'imagerie non invasives comme l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ont grandement amélioré notre capacité à étudier les processus physiologiques ou pathologiques dans les organismes vivants. IRM s'avère également être un outil précieux pour la capture des cellules transplantées in vivo. Les premières stratégies de marquage cellulaire pour utilisation d'agents de contraste IRM qui influencent les temps de relaxation MR (T1, T2, T2 *) et conduire à une amélioration (T1) ou l'épuisement (T2 *) du signal où les cellules marquées sont présentes. T2 agents d'amélioration * tels que les agents ultrapetites d'oxyde de fer (USPIO) ont été utilisés pour étudier la migration cellulaire et certains ont également été approuvé par la FDA pour une application clinique. Un inconvénient de T2 * agents est la difficulté de distinguer l'extinction du signal créé par les cellules marquées d'autres artefacts tels que des caillots de sang, des saignements ou des micro-bulles d'air. Dans cet article, nous décrivons une nouvelle technique pour le suivi in vivo des cellules quisont basées sur le marquage des cellules avec du fluor (19 F)-particules riches. Ces particules sont préparées par émulsification d'hydrocarbures perfluorés (PFC) et de composés ensuite utilisé pour marquer les cellules, qui peuvent ensuite être visualisées par 19 F IRM. Les avantages importants de PFC pour le suivi des cellules in vivo comprennent (i) l'absence de carbone lié à 19 F in vivo, ce qui donne alors des images sans fond et complète de cellules selectivityand (ii) la possibilité de quantifier le signal de la cellule de 19 F spectroscopie MR .

Protocol

Toutes les procédures sur les animaux doivent être approuvés par le comité local des animaux des établissements bien-être avant l'exécution. Pendant les mesures MR un niveau adéquat d'anesthésie et le monitorage physiologique (température du corps, rythme respiratoire) sont des conditions indispensables.

1. Génération de moelle osseuse de souris des cellules dendritiques dérivées

  1. Extrait cellules de moelle osseuse de souris C57BL / 6 tel que décrit précédemment 12. Ce protocole remonte à 1992 13 et a été initialement décrite par le groupe de Ralph M. Steinman (1943-2011), découvreur de la cellule dendritique 14.
  2. En bref, extraire tibia et du péroné peu de temps après sacrifier des souris. Travaillant sous la hotte à flux laminaire (pour éviter la contamination microbienne), rincer la moelle osseuse dans une petite boîte de Petri avec un milieu de lavage (5% de FBS, HEPES 1% de pénicilline / streptomycine et 1% dans du RPMI) 12.
  3. Transférer la suspension cellulaire à travers une stra celluleiner (100 um de maille, de nylon) dans un tube à centrifuger de 50 ml stérile afin de retirer les os et les tissus restants. Après plusieurs étapes de lavage et une étape de lyse 12, compter le nombre de cellules viables en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre.
  4. Resuspendre les cellules de moelle osseuse à une concentration de 400.000 cellules ml -1 dans le milieu de culture (RPMI supplémenté avec 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine, HEPES 1% et 1% de L-glutamine) contenant 75 ng ml -1 de la souris granulocytes macrophage-colony stimulating factor (mGM-CSF) obtenu à partir de surnageants de cellules HEK transfectées avec un 293FT GMCSF souris plasmide. Transférer 10 ml de suspension cellulaire (4 x 10 6 cellules) dans des boîtes de Pétri (100 mm x 20 mm) et incuber dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Au jour 3, reconstituer ancien milieu avec 10 ml de milieu frais (en gardant concentration finale de mGM-CSF à 75 ng ml -1). Au jour 6, enlever 10 ml de milieu de vieux et de reconstitueravec 10 ml de milieu frais (concentration finale mGM-CSF = 75 ng ml -1). Au jour 8, enlever 10 ml de milieu de vieux et de reconstituer avec 10 ml de milieu frais (concentration finale mGM-CSF = 150 ng ml -1).
  5. Au jour 10, le DC matures différenciées avec 1 pg ml -1 lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 heures.

2. Étiquetage des cellules dendritiques avec 19 F-particules riches en

  1. Au cours de l'étape de maturation h 24 (1.5), l'étiquette du DC avec 1 mM de fluor riche perfluoro-15-couronne-5-éther (PFCE) des particules (500-560 nm) également pour 24 heures. Préparer de grandes particules marquées par du fluor émulsifiant PFCE en Pluronic F-68 (volume total 2,5 ml) en utilisant une sonotrode cellule de perturbation de titane et l'emploi d'un programme d'impulsion continue (100% d'amplitude, puissance = 250 W) pendant 60 secondes.
  2. En suivant les étapes d'incubation ci-dessus, la mûre et la récolte du fluor marqué DC en utilisant une culture de cellules de tissu racloir, le transfert dans un tube à centrifuger de 50-ml et centrifugerà 500 g pendant 5 min à température ambiante.
  3. Pour laver les particules de restes et les cellules mortes, sans toucher aux cellules récoltées à adhérer sur la poly-L-lysine plats. Pour se préparer à cette étape, manteau boîtes de Pétri avec du poly-L-lysine (1 mg ml -1) à 37 ° C pendant 1 heure, puis laver la non liée poly-L-lysine avec du PBS.
  4. Incuber les cellules récoltées ci-dessus sur les plaques de poly-L-lysine dans un milieu sans sérum et permettre aux cellules d'adhérer (1 heure à 37 ° C, 5% CO 2).
  5. Laver le support de jeter cellules non adhérentes, les particules restantes et les cellules mortes et laver trois fois avec pré-chauffé (37 ° C) PBS.
  6. Récolte des cellules adhérentes par un traitement la trypsine-EDTA (0,25% de trypsine-EDTA, 3 minutes d'incubation à 37 ° C).
  7. Suite à une autre étape de centrifugation de lavage, remettre en suspension la quantité requise de cellules dendritiques matures dans le sérum sans PBS stérile.
  8. Pour déterminer si les cellules ont été étiquetée correctement, il est recommandé de vérifier la physicochemiques caractéristiques des cellules par cytométrie en flux (FACS). La dispersion latérale (SSC) devrait révéler une granularité accrue dans ces cellules, comme décrit précédemment 11. Il convient également de garder à l'esprit que les fibroblastes pourraient contaminer les cultures DC et pourrait également prendre les 19 particules F en parallèle. Par conséquent, la pureté DC doit être évaluée (en mesurant le pourcentage de CD11b + CD11c + en utilisant des cellules FACS) avant application in vivo.

3. Application in vivo de 19 F-étiquetés cellules dendritiques

  1. Administrer à courant continu (10 juin-10 juillet) dans un volume de 50 à 100 pl intracutanée dans les pattes arrière d'une souris C57BL / 6 par le positionnement de la souris dans un support et soigneusement insertion d'une aiguille 26 G ½ dans les couches supérieures de la peau avant l'application (utilisation des seringues à tuberculine 0,5 ml avec aiguilles attachées en permanence pour minimiser le volume mort). Afin d'assurer uned'application n intracutanée appropriée, il est important que la partie de l'aiguille insérée être partiellement visible sous la peau. Si l'aiguille n'est pas plus visible, l'aiguille a été insérée trop profondément dans les couches de la peau. Pour l'individu non averti, l'application intradermique pourrait être réalisée sous anesthésie.
  2. L'image des membres par le fluor vivo (19 F) / proton (1 H) IRM (voir la section suivante) 21 h suivant l'injection.

4. In Vivo 19 F / 1 H imagerie par résonance magnétique

Les instructions détaillées pour configurer les scans IRM se référer à un scanner Bruker MR en utilisant le logiciel de contrôle Paravison (version 5.1). Dénominations faisant référence à des fournisseurs fonctions spécifiques et des articles ont été mis en évidence en italique. Pour les scanners IRM autres de ces étapes peut être ajustée selon les directives du fabricant.

  1. Prévoir un accès dédié à unpetit animal MR scanner. Pour une qualité d'image suffisante, un système avec une intensité de champ magnétique de 9,4 Tesla ou plus et sur ​​mesure bobines de radiofréquence (par exemple 1 H / 19 F à double bobine RF accordable volume, de 35 mm de diamètre intérieur, 50 mm de longueur; rapide Biomed, Würzburg, Allemagne) sont recommandés.
  2. Avant d'IRM, de préparer la mise en place de l'IRM pour l'anesthésie et la surveillance physiologique. Assurez-vous que le masque respiratoire de l'animal lit / support est relié au système de l'isoflurane et que la sonde de température et le pad respiration sont connectés à un système de surveillance à distance des animaux (par exemple, modèle 1025, SA Instruments Inc, New York, USA). Ce dernier sert à surveiller les paramètres vitaux de l'animal tels que la température du corps et la respiration.
  3. Anesthésier les souris par narcose par inhalation en utilisant une chambre de souris reliée à un système d'isoflurane. Régler le débit d'air et O 2 à 0,2 L min -1 et 0,1 L -1 min, respectivementet 3% d'isoflurane (ajusté d'un vaporisateur) pendant environ 2 minutes jusqu'à ce que le niveau requis est atteint d'anesthésie (pas de pincement de l'orteil réponse suivante). Débits optimaux peuvent varier selon la configuration utilisée. Soyez conscient que des débits élevés pourraient conduire à une déshydratation. Une surveillance attentive des conditions des animaux est nécessaire en tout temps comme mentionné ci-dessus.
  4. Positionnez la souris à plat ventre sur le lit de la souris / titulaire du petit animal MR scanner (figure 1).
  5. Tout en maintenant le débit d'air constant et O 2, ajuster le vaporisateur isoflurane à 0,8 à 1,5% jusqu'à une respiration optimale est atteinte. Une fréquence respiratoire de 50 à 70 respirations par minute est recommandée.
  6. Maintenir la température du corps à 36-37 ° C pendant l'expérience en utilisant de l'eau chaude (ou de l'air chaud alternativement) système de circulation.
  7. Gardez les yeux humides de la souris avec pommade ophtalmique lubrifiante stérile pendant la mesure.
  8. Après avoir obtenu l'animalsur le support de formation d'image et les connexions au système de surveillance, déplacer le support vers le centre de la 1 H / F bobine RF 19 (qui est positionné au niveau de l'isocentre de l'aimant du scanner animal).
  9. Régler la position de la souris telle que le genou se trouve dans l'isocentre de l'aimant, soit avec une méthode automatisée (par exemple en utilisant un laser de positionnement combiné à un support entraîné par un moteur animale) ou manuellement par le calcul de la distance de la porte doit être déplacée dans l'aimant d'atteindre l'isocentre.
  10. Pour confirmer le positionnement correct de l'animal dans le scanner, puis la planification de la géométrie coupe d'image (taille-dire, la position et la rotation dans l'espace), acquérir des images éclaireur dans trois orientations standard (axiale, coronale, sagittale) en utilisant image à résolution rapide et peu Modes d'acquisition (par exemple TriPilot protocole, qui utilise une séquence d'impulsions flash).
  11. Accorder la bobine RF à la fréquence de résonance 1 H (par exemple. 400,1 MHz pour 9,4 T) et à la fréquence de résonance F 19 (par exemple 376,3 MHz pour 9,4 T) et correspondent à l'impédance caractéristique de la bobine de 50 ohms à l'aide du moniteur d'accord du scanner animale MR. Réglage et mise en correspondance est nécessaire pour atteindre les conditions optimales pour la transmission et la réception du signal.
  12. Effectuez les réglages nécessaires automatiques du système, y compris le calage d'affiner l'homogénéité du champ magnétique (par exemple ADJ_SHIM), des ajustements de fréquence pour régler le système RF à la fréquence Lamor de la souris (par exemple ADJ_SF) et le gain de référence pour ajuster l'amplitude RF ( par exemple ADJ_REFG). Tous ces paramètres sont importants pour que les champs statiques et variables magnétisme (B 0, B 1) dans la région d'intérêt le plus homogène possible.
  13. Acquérir un deuxième ensemble d'images scouts (voir plus haut) le long des trois axes orthogonaux, après avoir ajusté le champ de vision (FOV) de telle sorte que les deux membres inférieurs are visible de bassin à pied (L xlx H = 50x25x25 mm). Ces images servent à planifier les orientations des scans 3D finale F 1 H / 19.
  14. Mettre en place un protocole TurboRARE 3D pour 1 H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, facteur RARE = 16 (. Env 60 min de balayage). Ajustez FOV avec l'aide des images de repérage, lancer le scan (feux de circulation).
  15. Charger une impulsion unique FID-séquence avec un TR d'au moins 1.000 ms. Ouvrez balayage Modifier et mettre le noyau à 19 F. Utilisez les réglages de gain manuel en désactivant le gain automatique de la référence à la méthode d'édition de la boîte à outils.
  16. Démarrage de la mesure sans enregistrer les données à afficher un signal MR en temps réel en utilisant le SGP (aller configuration). Si le signal 19 F spectrale dans la fenêtre d'acquisition est trop bas, ajouter d'autres moyennes dans la méthode d'édition et / ou de moduler l'atténuateur d'impulsion (TX0 ou le curseur SP0) jusqu'à ce qu'un signal est clairement visible. Ajuster la fréquence de base de manière à centrer le pic spectral F 19 à 0 Hz dans la fenêtre d'acquisition. Appliquer fréquence de base et d'arrêt de presse. Notez que l'isoflurane utilisé comme anesthésique peut générer un signal de fond. À 9,4 Tesla IRM du déplacement chimique entre les 19 F contenant des particules et de l'isoflurane est d'environ 1800 Hz. Assurez-vous que la bande passante d'excitation est inférieure à 3600 Hz pour éviter l'excitation du isoflurane ensemble avec les 19 cellules F-étiquetés ou des particules. La fréquence de base doit être correctement réglée sur le signal généré par les 19 cellules F-étiquetés. Une autre méthode d'anesthésie pourrait être utilisé comme l'expérimentateur lui semble.
  17. Clone (copie) le protocole TurboRARE 3D à partir de l'analyse précédente 1 H. Allez dans Edition Méthode et désélectionnez le gain automatique de la référence (ci-dessus). Set 19 noyau de F Edition Scan. Changer la matrice de 128x64x64et l'. RARES facteur d'au moins 40 (jusqu'à 64) Pour une msec TR / TE 1000/6 et 64 moyennes, le temps de cycle est d'environ 70 min. Réglez le gain du récepteur à 101 (boîte à outils) et lancer la numérisation sans autres ajustements à l'aide GOP (aller pipeline).
  18. Lorsque les analyses sont terminées rentrer le porte-souris de l'IRM. Débranchez la souris soigneusement de son support. Si la souris ne soit pas sacrifiée pour l'analyse ex vivo (par exemple, l'histologie ou la spectroscopie, voir ci-dessous) directement après les mesures IRM, suivre de près jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré de l'anesthésie. Régulation de la température du corps est touchée par l'anesthésie, donc pendant le processus de récupération, placez la souris dans une cage séparée qui est placé sur une chaude température régulée pad. Une fois que la souris a complètement récupéré de l'anesthésie, il retourne dans sa cage et tenue à la salle des animaux.
  19. Pour superposer les 19 images F à 1 H des images, utilisez le menu Affichage option sur le même logiciel (Paravison). La fonction de sous-couche peut être trouvé sous corrélation. Enregistrer la sous-couche, de charger la nouvelle image et sélectionnez la couche 19 F en définissant une nouvelle couleur dans la table de consultation. Faire la distinction entre les 19 scans H F et 1, modifier le seuil de la couleur choisie (coupé Look Up Table) de sorte que le signal 19 F aura la couleur choisie et le fond 1 image H restera en niveaux de gris. D'autres programmes de post-traitement (par exemple ImageJ) sont disponibles pour créer les 1 H / 19 F superpositions d'image.
  20. Si une quantification in vivo du signal 19 F nécessaire, suivre un protocole simple quantitative comme décrit précédemment 15,16. En bref, la quantification peut être fait en plaçant un tube de référence avec une concentration connue de PFCE-émulsion dans le champ de vision à côté de la souris. Après l'acquisition de l'image MR, quantifier les intensités des 19 signaux en utilisant F région d'intérêt (ROI) d'analyse et de comparer à la courbe d'étalonnage en vitro comme le montre la figure 2.

5. Des ganglions lymphatiques de la spectroscopie par résonance magnétique (SRM)

  1. Après avoir sacrifié la souris, retirez le ganglion lymphatique poplité et le placer dans un petit tube de 5 mm RMN et ajouter 100 ul de 2% de PFA.
  2. Installer une bobine 19 F spectroscopie (par exemple une bobine toroïdale) qui présente une ouverture d'au moins 5 mm pour maintenir le tube RMN contenant le ganglion lymphatique.
  3. Placer le tube de RMN à l'intérieur de la bobine et déplacer la bobine dans l'isocentre de l'aimant.
  4. Accorder la bobine RF à la fréquence de résonance F 19 (par exemple 376,3 MHz pour 9,4 T) et correspondent à l'impédance caractéristique de la bobine de 50 ohms à l'aide du moniteur d'accord du scanner animale MR. Réglage et mise en correspondance est nécessaire pour atteindre les conditions optimales pour la transmission et le signalréception.
  5. Régler tous les paramètres de calage à l'intérieur de la boîte à outils Calage à 0 et appuyez sur appliquer. Habituellement, il n'est pas nécessaire d'appliquer des méthodes de calage puisque le volume de l'échantillon est relativement faible. Si un nombre suffisant de signaux 19 F est disponible, méthodes automatisées peuvent être appliquées pour la fréquence du système de calage, et le gain du récepteur comme décrit ci-dessus.
  6. Charger une impulsion unique avec une séquence FID TR d'au moins 1.000 ms. Ouvrez Modifier Scan et mettre le noyau à 19 F. Utilisez les réglages de gain manuel en désactivant le gain automatique de la référence à la méthode d'édition de la boîte à outils. Définissez le nombre de moyennes à 1.
  7. Démarrer la séquence en utilisant le SGP. Si le signal 19 F spectrale dans la fenêtre d'acquisition est trop bas, ajouter d'autres moyennes dans la méthode d'édition et / ou de moduler l'atténuateur d'impulsion (TX0 ou le curseur SP0) jusqu'à ce qu'un signal soit clairement visible. Réglez la fréquence de base de sorte que la spé 19 Fctral pic est au centre de la fenêtre d'acquisition à 0 Hz et s'applique fréquence de base. Ajuster à nouveau l'atténuateur d'impulsions afin de maximiser le signal, pour atteindre 90 ° d'excitation. Lorsque le signal est à l'arrêt presse maximale.
  8. Définissez les moyennes dans la méthode Editer entre 64 et 256 (ou plus si nécessaire, en fonction du signal) et lancer l'acquisition à l'aide du GOP. Le signal détecté est corrélé de façon linéaire avec le nombre de moyennes. Lors de la quantification garder à l'esprit que le signal détecté doit être normalisé à une moyenne. En outre, un étalon de concentration connue ou une courbe d'étalonnage est nécessaire de calculer le nombre de cellules de la normalisation du signal F 19 (figure 2).
  9. Une fois l'analyse terminée, retirez l'échantillon, placer l'échantillon suivant et passez à l'étape 5.3.

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Representative Results

Dix-huit à vingt et un heures suivant l'application intradermique, 19 F-étiquetés cellules dendritiques (DC) migrent dans le ganglion lymphatique poplité drainant. Le mouvement des DC via les canaux lymphatiques dans le ganglion drainant politeal peut être apprécié par superposition des images 1 H anatomiques avec les 19 images DC F (figure 2A). Nous avons déjà fait état ​​de la migration de ces cellules in vivo, ainsi que l'impact de la 19 F-taille des particules sur DC immunobiologie, dont 11 l'efficacité d'absorption. Afin de quantifier l'ampleur de la migration continue vers les ganglions lymphatiques, nous extrayons les ganglions lymphatiques drainant et effectuer 19 F MRS (figure 2B). Lorsque l'on compare le signal F 19 obtenue à partir de chaque nœud lymphatique avec le signal 19 F obtenue à partir de différents nombres de DC étiquetés avec les particules mêmes PFCE (courbe d'étalonnage, figure 2C), nous pouvons en déduirele nombre de F-19 marquée DC qui atteignent le ganglion lymphatique de drainage. Dans l'expérience représentant figures 2A et 2B, on peut déduire que 3,6 x 10 5 antigène chargé CC atteint le ganglion lymphatique droit alors que 7,5 x 10 4 DC qui n'ont pas été chargées avec l'antigène atteint le ganglion lymphatique droit.

Figure 1
Figure 1. Position de la souris sur le support de la souris de l'appareil d'IRM du petit animal.

Figure 2
Figure 2. Quantification du 19 migration DC F marqué in vivo en utilisant 19 F MRS. (A) DC ont été marquées avec 1 mM de 560 nm PFCE particl es, chargé avec (à droite) ou sans (à gauche) et l'antigène administré par voie intradermique à des membres postérieurs. Ovalbumine de poulet entier (OVA) a été utilisé comme antigène; OVA a été incubée avec le DC en collaboration avec les 19 particules F. Les cellules dendritiques sont présentés comme 19 signal F MR (rouge), alors que les ganglions lymphatiques et les canaux lymphatiques sont présentés dans le 1 H anatomique image par résonance magnétique (niveaux de gris). Les images ont été acquises avec une cage à oiseaux 19 F / 1 H du volume à double résonateur accordable. (B) Les ganglions lymphatiques de la souris montré en A ont été extraites et placées dans un tube RMN. Le signal 19 F a été mesurée par 19 F MRS (voir texte du Protocole) et l'amplitude a été calculé en effectuant une transformation de Fourier rapide (FFT) de la précession libre acquis (FID). (C) Sur une période de 24 heures, différente quantités de DC ont été marqués de 1 560 mm particules PFCE et 19 nm signal F a été mesurée par MRS F 19 comme dans B.ef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.

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Discussion

Cette méthode d'employer 19 F / 1 H IRM pour suivre le mouvement de DC dans le ganglion lymphatique donne l'occasion d'étudier les schémas de migration des cellules immunitaires in vivo. Les cellules dendritiques sont d'excellents exemples de la migration rapide des cellules immunitaires qui sont capables de manœuvrer à travers des structures tridimensionnelles sans bien adhérentes à des substrats spécifiques 17. Bien que la faible résolution spatiale (échelle du micron) de la technique décrite n'est pas comparable avec la haute résolution (plage nm) qui peut être réalisé avec la microscopie multiphotonique, avec cette technique, il est encore possible d'étudier la nature de la migration cellulaire in vivo et plus une plus longue période de temps. En outre, la microscopie a une profondeur de pénétration limitée et un champ de vision limité, ce qui en fait actuellement inadapté pour les zones d'imagerie grandes au sein d'un organisme vivant.

En raison de la non-invasivité de la technique, il est possible de suivre l'évoluMONITOR la ​​migration des cellules immunitaires pendant plusieurs jours sans pour autant sacrifier la souris après enquête. Un autre avantage de cette technique est la possibilité de superposer les 19 images F qui capturent les cellules qui migrent avec les analyses anatomiques H 1, ce qui permet une localisation précise des cellules dans l'organisme vivant. Cette technique nous permettra d'étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents DC migration. Contrairement typique dans des essais in vitro de migration, cette méthode permet l'étude de la migration des cellules dans un environnement physiologique 3D.

L'application potentielle de 19 F en MRS et l'IRM sont depuis longtemps reconnus 7,18. Le ratio élevé gyromagnétique, super essorage et abondance isotopique naturelle fait 19 F un candidat idéal pour l'IRM 7. En outre, la similitude entre 19 F et 1 H (en ce qui concerne leurs propriétés RMN) est une condition préalable à une superposition significative entre til anatomique IRM 1H avec les 19 F IRM de cellules marquées. En effet, un avantage de 1 H / 19 F IRM par rapport aux autres noyaux 1 H / X IRM est que le résonateur RF même peut être utilisé à la fois pour 19 F et 1 H noyaux. Dans la plupart des applications utilisées pour 19 F / 1 H IRM, un volume de résonateur est utilisé qui peut être réglé à la fois 19 F et 1 H En raison de la quasi identique B 1 de champ pour les deux canaux, un transfert de paramètres d'alimentation de la chaîne H 1 (qui est plus facile à mesurer) sur le canal 19 F est donc possible.

Un facteur important à prendre en considération lors de l'étiquetage des cellules avec des particules de toute taille (de l'ultra-petites et grandes des micro-particules) est le potentiel de la manipulation biologique et la toxicité. Nous avons récemment montré qu'en augmentant la taille des particules de marquage, nous pourrions promouvoir l'état de maturation des DC 11. Une possibleexplication de notre conclusion est la prépondérance des particules supérieures à 500 nm à prendre par phagocytose plutôt que endocytose 19; le mécanisme d'absorption ancien définir la nature du DC. Autres caractéristiques physiques (par exemple, la forme des particules et de la topologie de surface) pourrait aussi altérer la fonction biologique des cellules marquées et doivent également être soigneusement examinée 20. Pour toute configuration donnée expérimentale qui exige que l'étiquetage de DC avec des particules, il est donc fortement recommandé que les tests classiques de biologie cellulaire sont effectuées en parallèle à l'expérience visant à déterminer / exclure toute influence des particules sur les propriétés biologiques de ces cellules. Plusieurs dosages peuvent être effectués, selon l'étude expérimentale en question. Pour exclure une influence sur la maturation des DC, des mesures de marqueur de surface cellulaire (par exemple, CD80, CD86) expression par FACS est recommandé. Pour exclure une influence sur l'absorption de l'antigène et sa présentation, expertise phagocytoseriences et T expériences d'amorçage cellulaires, respectivement, sont recommandés. Dans le cas des expériences de migration, l'expression de la chimiokine (CC) des récepteurs (comme CCR7) et dans des essais in vitro de migration sont recommandés.

Même si 19 F / 1 H IRM est très prometteur pour l'étude de la migration cellulaire particulier à des fins cliniques, il existe actuellement un certain nombre de limitations. Il s'agit notamment de: (i) une résolution spatiale qui empêche la visualisation directe des cellules individuelles, (ii) l'insuffisance de sensibilité 19 F (limite de détection de plusieurs 10 5 cellules au sein d'un retour sur investissement), (iii) l'augmentation des durées de scan à la suite d'augmentation en moyenne pour compenser pour la limitation précédente, (iv) un nombre limité de résonateurs RF 19 F sur le marché et (v) de signal indésirable possible F fond 19 par d'autres éléments contenant du fluor tels que isofluorane et le polytétrafluoroéthylène (PTFE) à l'intérieur des composants matériels (MRp.ex. des condensateurs et câbles de liaison).

En dehors des facteurs tels que l'intensité du champ magnétique et les forces de gradient, un déterminant principal qui détermine le niveau de résolution spatiale est la sensibilité de la fréquence radio (RF) résonateur utilisé 21. Résolution IRM est étroitement lié au rapport signal-sur-bruit (SNR) 21 et sur ​​la réduction de taille de voxel pour amplifier la résolution spatiale, une perte de SNR est à prévoir. Une façon d'augmenter la résolution spatiale sans compromettre la sensibilité du signal consiste à employer des bobines à refroidissement cryogénique qui stimulent SNR en réduisant le bruit thermique 22. Avec l'aide d'une bobine de 1H tête qui utilise un système cryogénique, nous avons pu récemment visualiser infiltrats cellulaires dans le encéphalomyélite auto-immune expérimentale après avoir utilisé un avion dans la résolution de (35x35) 2 23 um. L'application de cette technologie cryogénique refroidi à 19 F / 1 H IRM serait une opoccasion d 'surmonter certaines des limites IRM associées à la détection du signal cellulaire et la résolution.

Un enjeu important pour suivre in vivo des cellules par IRM est la quantification de ces cellules dans un emplacement particulier dans un organisme vivant. Pour cela, il est possible d'effectuer 19 F MRS (voir 5.1 à 5.9). En utilisant les courbes d'étalonnage qui sont obtenus à partir de mesures MRS 19 F de différents nombres de 19 DC F-étiqueté, il est possible de déduire le nombre de cellules qui atteignent le ganglion lymphatique. Les 19 mesures F MRS des ganglions lymphatiques peut être comparée à la courbe 19 F MRS étalonnage CC. De plus, en comparant les données MRS à partir de courbes d'étalonnage de cellules DC les avec la PFCE pur, on peut en déduire qu'il est possible de détecter environ 10 13 19 F tours par cellule après marquage. Selon les principes de MR, la limite de détection inférieure est 10 18 tours par voxel 24. Ainsi, nous pouvons supposer que nous sommes en mesure de détecter un nombre minimum de 10 5 DC par voxel en utilisant une IRM 9,4 T.

En résumé, le protocole que nous décrivons ici est bénéfique pour des investigations in vivo qui étudient la migration cellulaire au cours des processus physiopathologiques. Le caractère non invasif de la technique permet des études longitudinales, sans la nécessité de sacrifier un grand nombre d'animaux, la possibilité de superposer des images à partir de 19 F les cellules marquées sur les images anatomiques H 1 favorise suivi optimal et hautement sélectif des cellules qui migrent et 19 F MRS fournit la possibilité d'évaluer le nombre de cellules spécifiques de localisation de zones anatomiques in vivo.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft à SW (DFG WA 2804) et une bourse universitaire pour SW à partir du Centre de recherche expérimentale et clinique, une coopération du Centre Max Delbrück de médecine moléculaire et de la faculté de médecine Charité à Berlin. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et d'analyse, la décision de publier ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions M. Robert Westphal pour le support technique lors de son stage dans notre laboratoire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice Charles River, Berlin
RPMI Gibco 21875-091
FBS Superior Biochrom AG S 0615
HEPES Gibco-Invitrogen 15630-056
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine Gibco 25030-024
Dulbecco's PBS Sigma Aldrich D8662
PFA Santa Cruz sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur 391-1996
Pluronic F-68 Sigma Aldrich P5556
Petri dishes (35 x 10 mm) VWR, Germany 391-1996
27 ½ G syringes VWR, Germany 612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh) VWR, Germany 734-0004
NMR tubes VWR, Germany 634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools FST
CO2 incubator Binder
Small animal MR system Bruker Biospin 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil Rapid Biomed, Würzburg, Germany 35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil in-house tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025 SA Instruments Inc., New York, USA

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References

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Biologie Moléculaire Numéro 73 immunologie biologie cellulaire physiologie l'anatomie génie biomédical de l'hématologie la résonance magnétique nucléaire RMN Fluor les cellules dendritiques les migrations les ganglions lymphatiques l'imagerie par résonance magnétique IRM la spectroscopie par résonance magnétique MRS la spectroscopie l'imagerie le suivi des cellules des techniques cliniques
La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l'imagerie par résonance 19F / 1H magnétique
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Waiczies, H., Guenther, M.,More

Waiczies, H., Guenther, M., Skodowski, J., Lepore, S., Pohlmann, A., Niendorf, T., Waiczies, S. Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (73), e50251, doi:10.3791/50251 (2013).

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