Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van Published: March 20, 2013 doi: 10.3791/50251

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Helmar Waiczies^1,2, Martin Guenther^1,2, Julia Skodowski^1,2, Stefano Lepore^1,2, Andreas Pohlmann², Thoralf Niendorf^1,2, Sonia Waiczies^1,2

¹Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, ²Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Het volgen van cellen met behulp van MRI heeft opgedaan opmerkelijke aandacht in de afgelopen jaren. Dit protocol beschrijft de etikettering van dendritische cellen met fluor (

Abstract

Voortdurende aanpassing aan nieuwe niet-invasieve beeldvormende modaliteiten zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) zijn sterk verbeterd ons vermogen om fysiologische of pathologische processen te bestuderen in levende organismen. MRI blijkt ook een waardevol hulpmiddel voor het vastleggen van getransplanteerde cellen in vivo. Aanvankelijke cel labeling strategieën voor MRI gemaakt van contrastmiddelen die de MR relaxatietijden beïnvloeden (T1, T2, T2 *) en leiden tot een verhoging (T1) of uitputting (T2 *) van het signaal wanneer gelabelde cellen aanwezig zijn. T2 * enhancement middelen zoals ultrakleine ijzeroxide agenten (USPIO) zijn gebruikt om cel migratie en sommige zijn ook door de FDA goedgekeurd voor klinische toepassing te bestuderen. Een nadeel van T2 * middelen is het moeilijk om het signaal uitsterven door de gemerkte cellen van andere artefacten zoals bloedstolsels, micro bloedingen of luchtbellen onderscheiden. In dit artikel beschrijven we een nieuwe techniek voor het bijhouden van cellen in vivo datis gebaseerd op labelen van de cellen met fluor ^(19F)-rijke deeltjes. Deze deeltjes worden bereid door emulgeren perfluor (PFC)-verbindingen en vervolgens gebruikt om het etiket cellen, die vervolgens kunnen worden afgebeeld door ^19F MRI. Belangrijke voordelen van PFK voor cell tracking in vivo omvatten (i) de afwezigheid van koolstof-gebonden ^19F in vivo, die vervolgens geeft achtergrond-vrije beelden en celbereik selectivityand (ii) de mogelijkheid het celsignaal kwantificeren door ^19F MR spectroscopie .

Introduction

Het volgen van cellen in vivo is een cruciaal aspect in verschillende gebieden van de medische biologie. Hiervoor invasieve beeldvormingstechnieken die selectief kunnen localiseren cellen over een periode zeer waardevol. Voorafgaand aan de ontwikkeling van drie-dimensionale magnetische resonantie beeldvorming (MRI), werd het volgen van immune celmigratie beperkt tot microscopische analyses of tissue biopsies. Cell tracking met behulp van MRI heeft opgedaan enorme aandacht in de afgelopen jaren, niet alleen voor immunologen bestuderen immuuncel gedrag in vivo, maar ook voor klinische en onderzoekers stamcellen. Tijdens het midden van de jaren '90, de eerste studies over ijzeroxide nanodeeltjes ¹ gestart met een cascade van ontwikkelingen voor het bijhouden van cellen met MRI. Ijzeroxide deeltjes verkorten van de MR relaxatietijd (T2 *) van de gelabelde cellen en dus veroorzaken signaal uitputting in MR beelden. Ijzeroxide deeltjes zijn gebruikt om label macrofagen ^2, oligodendrocyte progenitors ³ en vele andere celtypen. Sommige van deze deeltjes zijn ook klinisch goedgekeurd door de FDA voor de etikettering cellulaire vaccins bij melanoompatiënten ^4. Aangezien in vivo of ex vivo labeling van cellen met ijzeroxide deeltjes gebaseerd op een verkorting van de T2 *-signaal en het laatste kan ook worden veroorzaakt door in vivo gevoeligheid verband T2 * effecten zoals micro bloedingen ijzeraanslag of luchtbellen, is het misschien moeilijk zijn om gelabelde cellen te identificeren in vivo uit andere achtergrond T2 *-signaal uitsterven ^5.

In dit artikel beschrijven we een techniek voor het volgen van dendritische cellen (DC) in vivo door het gebruik ¹⁹ F / ^1H magnetische resonantie imaging (MRI). Deze cel tracking-technologie werd pas in 2005 ^6, enkele jaren na de eerste erkende aanvragen voor ¹⁹ F in MRI was gemeld ^7. Een belangrijke advantage van ¹⁹ F over ijzeroxide deeltjes cel etikettering de lage biologische optreden van ¹⁹ F in weefsel, dit maakt het mogelijk om cellen zeer selectief bijhouden met vrijwel achtergrond-beelden. Voorts is het mogelijk de ^19F MR signaal overlappen van de getransplanteerde cellen met gelabelde anatomische beelden verkregen uit conventionele 1H MRI. ^19F / ¹ H MRI derhalve aanzienlijk belang voor studies die celmigratie in vivo. Cellen bestudeerd met deze methode zijn gelabeld met ¹⁹ F-rijke deeltjes. Synthetisch afgeleide perfluorkoolstoffen (PFC's) die voornamelijk uit koolstof-en fluoratomen worden gebruikt om de deeltjes te bereiden. Deze verbindingen zijn oplosbaar in water en moeten vóór geëmulgeerd de toepassing in vitro of in vivo. De gebruikelijke omvang van de PFC deeltjes die in dienst waren van andere groepen voor in vivo ¹⁹ F-MRI-tracking experimentenvarieert tussen 100 nm en 245 nm ^6,8-10. We hebben echter aangetoond dat de efficiëntie van labeling dendritische cellen met perfluor-15-kroon-5-ether (PFCE) deeltjes met toenemende deeltjesgrootte (> 560 nm). ¹¹

Protocol

Alle dierlijke procedures moeten door de lokale institutionele dierenwelzijn commissie voorafgaand aan de uitvoering worden goedgekeurd. Tijdens de MR metingen een adequaat niveau van anesthesie en fysiologische monitoring (lichaamstemperatuur, ademhalingsfrequentie) zijn onmisbare vereisten.

1. Generatie Mouse Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen

1. Extract beenmergcellen van C57BL / 6 muizen zoals eerder beschreven ^12. Dit protocol dateert van 1992 ¹³ en werd oorspronkelijk beschreven door de groep van Ralph M. Steinman (1943-2011), ontdekker van de dendritische cel ^14.
2. In het kort, extraheren scheenbeen en kuitbeen snel na offeren muizen. Werken onder de laminaire stroming kap (om microbiële contaminatie te voorkomen), spoelt het beenmerg in een kleine petrischaal met wasmedium (5% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1% HEPES in RPMI) ^12.
3. Breng de celsuspensie door middel van een cel strainer (100 um maaswijdte, nylon) in een steriele 50 ml centrifugebuis om bot en overgebleven weefsel te verwijderen. Na verschillende wassen stappen en een lysisstap ^12, tel de levensvatbare cellen met behulp trypanblauw en een hemocytometer.
4. Resuspendeer beenmergcellen in een concentratie van 400.000 cellen ^ml-1 in kweekmedium (RPMI gesupplementeerd met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, 1% HEPES en 1% L-glutamine) met 75 ng ^ml-1 van de muis granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (MGM-CSF) verkregen uit supernatanten van 293FT HEK cellen getransfecteerd met een plasmide muis GMCSF. Breng 10 ml van de celsuspensie (4 x 10 ⁶ cellen) in petrischalen (100 mm x 20 mm) en geïncubeerd in een _CO2 incubator (37 ° C, 5% _CO2). Op dag 3, aanvullen oude medium met 10 ml vers medium (het houden van eind concentratie van mgm-CSF bij 75 ng ml ^-1). Op dag 6, verwijder 10 ml oude medium en aan te vullenmet 10 ml vers medium (MGM-CSF eindconcentratie = 75 ng ml ^-1). Op dag 8, verwijder 10 ml oude medium en aan te vullen met 10 ml vers medium (MGM-CSF eindconcentratie = 150 ng ml ^-1).
5. Op dag 10, rijpen de gedifferentieerde DC met 1 ug ml ^-1 lipopolysaccharide (LPS) voor 24 uur.

2. Labeling van dendritische cellen met ¹⁹ F-rijke deeltjes

1. Tijdens de 24 uur rijping stap (1.5), het etiket van de DC met 1 mM fluor-rijke perfluoro-15-kroon-5-ether (PFCE) deeltjes (500-560 nm) ook voor 24 uur. Bereid grote fluor-gelabelde deeltjes door emulgeren PFCE in Pluronic F-68 (totaal volume 2,5 ml) met behulp van een mobiele verstoren titanium sonotrode en met gebruikmaking van een doorlopende impulsprogramma (amplitude 100%, vermogen = 250 W) gedurende 60 sec.
2. Gezien het bovenstaande incubatiestappen, oogsten de volwassen en fluor-gelabeld DC met een weefselkweek celschraper, overdracht in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeerbij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Te wassen overgebleven deeltjes en dode cellen, laat geoogste cellen te hechten aan poly-L-lysine gerechten. Ter voorbereiding van deze stap, laag petrischalen met poly-L-lysine (1 mg ^ml-1) bij 37 ° C gedurende 1 uur, daarna wassen van de gebonden poly-L-lysine met PBS.
4. Incubeer hierboven geoogste cellen op de poly-L-lysine beklede platen in serum-vrij medium en laat cellen hechten (1 uur bij 37 ° C, 5% _CO2).
5. Afwassen de middellange tot niet-hechtende cellen, overgebleven deeltjes en dode cellen weg te gooien en drie keer wassen met voorverwarmde (37 ° C) PBS.
6. Harvest hechtende cellen door trypsine-EDTA-behandeling (0,25% trypsine-EDTA, 3 min incubatie bij 37 ° C).
7. Na een wasbeurt centrifugefase resuspendeer de benodigde hoeveelheid rijpe DC in serum-vrij steriel PBS.
8. Om te bepalen of de cellen met succes zijn bestempeld, is het raadzaam om de physicoche controlerenmical eigenschappen van de cellen met behulp van stromingscytometrie (FACS). De zijwaartse verstrooiing (SSC) moet meer granularity openbaren deze cellen, zoals eerder beschreven ^11. Het moet ook in gedachten worden gehouden dat fibroblasten kunnen besmetten de DC culturen en kon ook het nemen van de ¹⁹ F deeltjes parallel. Daarom moet de DC zuiverheid wordt bepaald (door meting van het percentage van CD11c ⁺ CD11 b ⁺ cellen met FACS) voor in vivo toepassing.

3. In vivo toepassing van ^{19F-gelabelde} dendritische cellen

1. Dien DC ⁽¹⁰ juni-10 juli) in een volume van 50-100 pi intracutaan in de achterste ledematen van een C57BL / 6 muis door het plaatsen van de muis in een houder en zorgvuldig plaatsen van een 26 ½ G naald in de bovenste lagen van de huid vóór toepassing (gebruik 0,5 ml tuberculine spuiten met permanent-ingeschreven naalden om dode volume te minimaliseren). Om een ​​te garanderenn passende intracutane applicatie, is het belangrijk dat het ingevoegde gedeelte van de naald gedeeltelijk zichtbaar onder de huid. Als de naald is niet meer zichtbaar, is de naald al te diep ingebracht in de huidlagen. Voor het ongetrainde persoon, kan de intracutane aanvraag worden uitgevoerd onder narcose.
2. Afbeelding van de ledematen door in vivo fluor ⁽¹⁹ F) / proton ^(1H) MRI (zie volgende paragraaf) 21 uur na de injectie.

4. In Vivo ¹⁹ F / ¹ H Magnetic Resonance Imaging

De gedetailleerde instructies voor het instellen van de MRI-scans hebben betrekking op een Bruker MR-scanner met behulp van de besturingssoftware Paravison (versie 5.1). Benamingen die verwijzen naar specifieke vendor functies en items zijn gemarkeerd cursief. Voor andere MR-scanners deze stappen eventueel moeten worden aangepast volgens de richtlijnen van de fabrikant.

1. Schik de toegang tot een specialeklein dier MR-scanner. Voor een adequate beeldkwaliteit, een systeem met een magnetische veldsterkte van 9,4 Tesla of meer en op maat radiofrequentie spoelen (bv. ¹ H / ¹⁹ F dual-afstembare volume RF-spoel, 35 mm binnendiameter, 50 mm lengte; Rapid Biomed, Würzburg, Duitsland) worden aanbevolen.
2. Voorafgaand aan MRI, bereiden de setup van de MRI-scanner voor anesthesie en fysiologische monitoring. Zorg ervoor dat de ademhaling masker van het dier bed / houder is aangesloten op de isofluraan systeem en dat de temperatuursensor en de ademhaling pad zijn aangesloten op een remote monitoring-systeem van dieren (bijv. Model 1025, SA Instruments Inc, New York, USA). Deze laatste dient om vitale parameters van het dier zoals lichaamstemperatuur en ademhaling controleren.
3. Verdoven muizen door inhalatie narcose met een muis kamer aangesloten op een isofluraan systeem. Stel het debiet van lucht-en O ₂ bij 0,2 L min ^-1 en 0,1 L min ^-1, respectievelijken 3% isofluraan (aangepast van een verdamper) gedurende ongeveer 2 minuten totdat het vereiste niveau van de anesthesie is bereikt (geen reactie volgt teen knijpen). Optimale debieten kunnen variëren afhankelijk van de configuratie wordt gebruikt. Wees ervan bewust dat een groot debiet zou kunnen leiden tot uitdroging. Een zorgvuldige controle van de voorwaarden van de dieren is te allen tijde vereist zoals hierboven vermeld.
4. Plaats de muis gevoelig op de muis bed / houder van het kleine dier MR scanner (figuur 1).
5. Terwijl het debiet voor de lucht-en O ₂ constant, passen de isofluraan vaporizer tot 0,8-1,5% tot een optimale ademhaling wordt bereikt. Een ademfrequentie van 50-70 ademhalingen per minuut is aanbevolen.
6. Houd de lichaamstemperatuur bij 36-37 ° C gedurende het experiment door het gebruik van een warm water (of als alternatief warme lucht) circulatiesysteem.
7. Houd de ogen van de muis vochtig met steriele oog smerende zalf tijdens de meting.
8. Na het veiligstellen van het dierhet grafisch houder en de verbindingen met het controlesysteem, verplaats de houder naar het midden van de ¹ H / F ¹⁹ RF spoel (dat is gepositioneerd aan het isocentrum van het dier magneet scanner).
9. De positie van de muis, zodat de knie zich in het isocentrum van de magneet, of met een geautomatiseerde methode (bijv. met een positionering laser in combinatie met een motor aangedreven dier houder) of door handmatig berekenen van de afstand worden verplaatst de houder moet in de magneet te bereiken de isocentrum.
10. Voor bevestiging van de juiste positionering van het dier in de scanner en later de planning van het beeld slice geometrie (dwz grootte, positie en rotatie in de ruimte), verwerven scout afbeeldingen in drie standaard oriëntaties (axiaal, coronaal, sagittaal) image snelle en lage resolutie met behulp van acquisitie methoden (bv. TriPilot protocol, dat een FLASH pulssequentie gebruikt).
11. Stem de RF-spoel om de ^1H resonantie frequentie (bv.. 400,1 MHz voor 9,4 T) en de ^19F resonantiefrequentie (bijv. 376.3 MHz voor 9,4 T) en overeenkomen met de karakteristieke impedantie van de spoel 50 Ohm met de tuning beeldscherm van het dier MR scanner. Tuning en matching is noodzakelijk om de optimale condities voor transmissie en ontvangst bereiken.
12. Voer de nodige automatische systeem instellingen inclusief shimming te fine-tunen van de homogeniteit van het magnetisch veld (bijv. ADJ_SHIM), systeem frequentie aanpassingen aan de RF afstemmen op de Lamor frequentie van de muis (bv. ADJ_SF) en verwijzing krijgen naar de RF amplitude (passen bv ADJ_REFG). Al deze instellingen zijn belangrijk voor de statische en variabele magnetische velden (B _{0, 1} B) maken in het gebied van belang zo homogeen mogelijk.
13. Verwerven van een tweede reeks verkenningsbeelden (zoals hierboven) langs de drie orthogonale richtingen, na het gezichtsveld (FOV) zodat beide onderste ledematen ar hebben aangepaste zichtbaar van het bekken naar voet (LxBxH = 50X25X25 mm). Deze beelden dienen om de oriëntaties van de uiteindelijke 3D ^1/19 H F scans te plannen.
14. Het opzetten van een TurboRARE 3D protocol voor ^1H-scan: TR / TE = 1500/53 msec, FOV = 50X25X25 mm, Matrix = 400x200x200, ZELDZAME Factor = 16 (. Scantijd ca. 60 min). Pas FOV met de hulp van de scout beelden, start de scan (stoplicht).
15. Laad een enkele puls FID-sequentie met een TR van minstens 1.000 msec. Open bewerken scannen en stel kern naar ¹⁹ F. Gebruik handmatige versterkingsinstellingen door de selectie van de automatische verwijzing winst in de Edit Methode van de Toolbox.
16. Start meting zonder het registreren van gegevens om een MR-signaal in real-time weergeven met behulp van SAP (ga setup). Als de ¹⁹ F spectrale signaal binnen het venster overname te laag is, voeg meer gemiddelden in Edit Method en / of die de puls verzwakker (TX0 of SP0 schuifregelaar) tot een signaal duidelijk zichtbaar. Bepaalt de basisfrequentie om midden de ¹⁹ F spectrale piek bij 0 Hz in het venster overname. Breng fundamentele frequentie en druk op Stop. Merk op dat de isofluraan gebruikt als verdoving een achtergrond signaal kan genereren. Bij 9,4 Tesla MRI de chemische verschuiving tussen de ^{19F-bevattende} deeltjes en isofluraan is ongeveer 1800 Hz. Zorg ervoor dat de excitatie bandbreedte is kleiner dan 3600 Hz om spannende de isofluraan samen voorkomen met de ¹⁹ F-gelabelde cellen of deeltjes. De basisfrequentie moet correct zijn ingesteld op het signaal gegenereerd door de ¹⁹ F-gelabelde cellen. Als alternatief zou een andere werkwijze anaesthesie worden gebruikt als de experimentator goeddunken.
17. Clone (duplicaat) de TurboRARE 3D-protocol van de vorige ^1H scan. Ga naar methode en schakel de automatische referentie-gain (zoals hierboven) bewerken. Set ¹⁹ F kern van Bewerken Scan. Verander de matrix 128x64x64en RARE-Factor ten minste 40 (tot 64). Voor een TR / TE 1000/6 msec en 64 gemiddelden, de scan duurt ongeveer 70 minuten. Stel de ontvanger winst tot 101 (gereedschapskist) en start de scan zonder verdere aanpassingen aan met GOP (ga pipeline).
18. Wanneer de scans klaar zijn trekken met de muis houder van de MR-scanner. Ontkoppel de muis voorzichtig uit de houder. Als de muis niet wordt opgeofferd voor ex vivo analyse (bijv. histologie of spectroscopie, zie hieronder) direct na de MR metingen, nauwlettend volgen totdat deze volledig is hersteld van anesthesie. Lichaamstemperatuur regeling wordt beïnvloed door de narcose, zodat tijdens het herstelproces, zet de muis in een aparte kooi die wordt geplaatst op een warme temperatuur-gereguleerde pad. Zodra de muis volledig is hersteld van anesthesie, dit terug in de kooi en het dier kamer.
19. Om de ¹⁹ F afbeeldingen om ^1H beelden overlappen, gebruikt u de menu Beeld option op dezelfde software (Paravison). De Onderstroom functie is te vinden onder correleren. Sla de onderlaag, laadt de nieuwe afbeelding en markeer de ¹⁹ F-laag door het definiëren van een nieuwe kleur uit de Look Up Table. Om onderscheid te maken tussen de ¹⁹ F en ¹ H scans, veranderen de drempel voor de gekozen kleur (cut Look Up Table), zodanig dat het ¹⁹ signaal F de de achtergrond H afbeelding ¹ gekozen kleur en zullen hebben in grijstinten blijven. Andere post-processing programma's (bijvoorbeeld ImageJ) zijn beschikbaar om de ¹ H / ¹⁹ F beeldoverlays creëren.
20. Dient een in vivo kwantificatie van de ¹⁹ F-signaal nodig zijn, volgen een eenvoudige kwantitatieve protocol zoals eerder beschreven ^15,16. In het kort, kan kwantificering worden uitgevoerd door een referentiebuis met een bekende concentratie van PFCE-emulsie binnen het ZV naast de muis. Na het verwerven van de MR-beelden, quantify de intensiteiten van de signalen met behulp van ^19F-gebied van belang (ROI) analyse en vergelijken met de in vitro kalibratiekromme figuur 2.

5. Lymfkliertest Magnetische Resonantie Spectroscopie (MRS)

1. Na het opofferen van de muis, verwijder de knieholte lymfeklier en doe dit in een kleine 5 mm NMR-buis en voeg 100 ul van 2% PFA.
2. Installeer een ¹⁹ F spectroscopie spoel (bijv. een ringkern spoel) die een opening van ten minste 5 mm voor het houden van de NMR-buis met de lymfeklieren heeft.
3. Plaats de NMR-buis in de spoel en zet de spoel in de isocentrum van de magneet.
4. Stem de RF spoel de ^19F resonantiefrequentie (bijv. 376.3 MHz voor 9,4 T) en overeenkomen met de karakteristieke impedantie van de spoel 50 Ohm met de tuning beeldscherm van het dier MR scanner. Tuning en matching is noodzakelijk om de optimale condities voor transmissie en signaal bereikenontvangst.
5. Zet alle shim parameters binnen de shimming Toolbox op 0 en drukt toepassing. Meestal is het niet nodig vulplaten methoden van toepassing, aangezien het volume van het monster is relatief klein. Als een voldoende ¹⁹ signaal F is, kan geautomatiseerde werkwijzen worden toegepast vulplaten, netfrequentie en ontvangerversterking zoals hierboven beschreven.
6. Laad een enkele puls FID sequentie met een TR van minstens 1.000 msec. Open Scan Bewerken en stel de kern tot ¹⁹ F. Gebruik handmatige versterkingsinstellingen door de selectie van de automatische verwijzing winst in de Edit Methode van de Toolbox. Stel het aantal gemiddelden naar 1.
7. Start de reeks met behulp van SAP. Als de ¹⁹ F spectrale signaal binnen het venster overname te laag is, voeg meer gemiddelden in Edit Method en / of die de puls verzwakker (TX0 of SP0 schuif) totdat een signaal is duidelijk zichtbaar. Bepaalt de basisfrequentie, zodat de ¹⁹ F spectral piek is in het midden van het venster overname bij 0 Hz en toepassen basisfrequentie. Pas weer de pols verzwakker om het signaal, tot 90 ° excitatie bereiken maximaliseren. Wanneer het signaal is op maximale druk op Stop.
8. Stel de gemiddelden in de Edit Methode tussen 64 en 256 (of meer indien nodig, afhankelijk van het signaal) en start de acquisitie met behulp van GOP. Het gedetecteerde signaal lineair correleert met het aantal gemiddelden. Tijdens kwantificering in gedachten houden dat het gedetecteerde signaal moet worden genormaliseerd op een gemiddelde. Verder kalibratiestandaard van een bekende concentratie of een ijkkromme moet het aantal cellen van de ¹⁹ genormaliseerde signaal F (figuur 2) te berekenen.
9. Zodra de scan is voltooid, verwijdert u het monster, plaatst u het volgende monster en ga verder met stap 5.3.

Representative Results

Achttien tot eenentwintig uur na intracutane toepassing, ¹⁹ F-gelabelde dendritische cellen (DC) migreren naar de afvoerende knieholte lymfeklier. De beweging van DC via de lymfevaten naar de drainerende lymfeklier politeal duidelijk zal zijn overlappen de ^1H anatomische beelden met ^19F DC beelden (Figuur 2A). We hebben eerder gerapporteerd voor de migratie van deze cellen in vivo, alsook de invloed van ^{19F-deeltjesgrootte} op DC immunobiology, inclusief opname-efficiëntie ^11. Om de mate van DC migratie kwantificeren in de lymfeklieren, extraheren we de drainerende lymfeklieren en uitvoeren ^19F MRS (Figuur 2B). Wanneer we vergelijken met de ^19-signaal F verkregen van elk lymfklier met de ^19-signaal F verkregen uit verschillende aantallen DC gelabeld met dezelfde PFCE partikels (ijklijn, figuur 2C) kunnen we afleidenhet aantal ¹⁹ F-label DC dat de drainerende lymfeklier bereiken. In het representatief experiment is getoond in figuren 2A en 2B, kunnen we afleiden dat 3,6 x 10 ⁵ antigen beladen DC bereikt de juiste lymfeknoop terwijl 7,5 x 10 ⁴ DC die niet beladen met antigen tot de juiste lymfeknoop.

Figuur 1. Positie van de muis in de houder van de muis kleine dieren MR scanner.

Figuur 2. Kwantificering van ¹⁹ F-label DC migratie in vivo met ¹⁹ F MRS. (A) DC werden gemerkt met 1 mM 560 nm PFCE particl es, geladen met (rechts) of zonder (links) antigeen en intracutaan toegediend in achterste ledematen. Hele kip ovalbumine (OVA) werd als antigeen werd OVA geïncubeerd met de DC met de ^19F deeltjes. Dendritische cellen worden getoond als ¹⁹ F MR-signaal (rood), terwijl lymfeklieren en lymfevaten worden getoond de ^1H MR afbeelding anatomische (grijstinten) in. Beelden werden verkregen met een ¹⁹ F / ¹ H dual-afstembare volume vogelkooi resonator. (B) Lymfeklieren van de muis getoond in A werden geëxtraheerd en in een NMR-buis. De ^19-signaal F werd gemeten door ¹⁹ F MRS (zie Protocol tekst) en de amplitude werd berekend door het uitvoeren van een snelle Fourier transformatie (FFT) van de verworven vrije inductie verval (FID). (C) Over een periode van 24 uur, anders hoeveelheden DC werden gemerkt met 1 mM 560 nm PFCE deeltjes en ¹⁹ signaal F werd gemeten door ¹⁹ F MRS als in B.ef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussion

Deze methode van toepassing van ¹⁹ F / ¹ H MRI om de beweging van DC te volgen in de lymfeklier geeft de mogelijkheid om de migratiepatronen van immuuncellen in vivo bestudeerd. Dendritische cellen zijn uitstekende voorbeelden van snel migreren immuuncellen die in staat zijn door middel van drie-dimensionale structuren te manoeuvreren zonder goed hechtende specifieke substraten ^17. Hoewel de lage ruimtelijke resolutie (micrometer bereik) van de beschreven techniek is niet vergelijkbaar met de hoge resolutie (nm range) die kan worden bereikt met multifoton microscopie met deze techniek is het mogelijk om de aard van celmigratie in vivo en in studie een langere periode van tijd. Verder microscopie een penetratiediepte en een beperkt gezichtsveld beperkt, waardoor het nog ongeschikt voor beeldvorming grote gebieden binnen een levend organisme.

Door de noninvasiveness van de techniek is het mogelijk maanitor de migratie van immuuncellen voor meerdere dagen zonder dat de muis na onderzoek. Een ander voordeel van de techniek is de mogelijkheid om de ^19F beelden die de migrerende cellen met anatomische ^1H scans vangen, waardoor een nauwkeurige lokalisatie van de cellen in het levende organisme bedekken. Deze techniek zal ons toelaten om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen DC migratie te bestuderen. Unlike typische in vitro migratie assays, deze methode kan de studie van celmigratie in een fysiologische 3D omgeving.

De potentiële toepassing van ¹⁹ F in MRS en MRI hebben lang erkend ^7,18. De hoge gyromagnetische ratio, hoge spin en natuurlijke abundantie maakt ¹⁹ F een ideale kandidaat voor MRI ^7. Bovendien is de overeenkomst tussen ^19F en ^1H (met betrekking tot hun eigenschappen NMR) is een voorwaarde voor een zinvolle overlay tussen thij anatomische 1H MRI met de ¹⁹ F MRI van gelabelde cellen. Inderdaad een voordeel van ^1/19 H F MRI meer andere ¹ H / X kernen MRI is dat dezelfde RF-resonator kan worden gebruikt voor zowel ^19F en ^1H-kernen. In de meeste toepassingen gebruikt ¹⁹ F / ¹ H MRI, een volume resonator wordt gebruikt die kan worden afgesteld om zowel ^19F en ¹ H. Door de bijna identieke B ₁ gebied voor beide kanalen, een overdracht van energie-instellingen van het ^1H kanaal (die eenvoudiger te meten) de ^19F kanaal is dus mogelijk.

Een belangrijke factor te worden beschouwd bij het labelen van cellen met deeltjes van elke omvang (van ultra-kleine tot grote micro-deeltjes) is het potentieel van de biologische manipulatie en toxiciteit. We hebben onlangs aangetoond dat door de omvang van de etikettering deeltjes, kunnen we de maturatiestatus van DC ¹¹ bevorderen. Een mogelijkeverklaring voor onze bevindingen is het overwicht van deeltjes groter dan 500 nm te worden opgenomen door fagocytose plaats endocytosis ^19, het eerste opnamemechanisme waarbij de aard DC. Andere fysische eigenschappen (bijv. deeltjesvorm en oppervlaktetopologie) ook de biologische functie van de gelabelde cellen veranderen en moeten zorgvuldig worden overwogen ^20. Voor een bepaalde experimentele opstelling die vereist kenmerken van DC met deeltjes is het dus sterk aanbevolen dat typisch celbiologie assays worden parallel aan het experiment om te bepalen / sluiten invloed van de deeltjes op de biologische eigenschappen van deze cellen. Verschillende testen kunnen worden uitgevoerd, afhankelijk van het experimentele onderzoek betrokken. Om een invloed op DC maturatie sluiten, wordt metingen van celoppervlak marker (bijv. CD80, CD86) expressie door FACS aanbevolen. Om een ​​invloed op de opname en presentatie antigeen, fagocytose expertise sluiteniments en T-cel priming experimenten, respectievelijk worden aanbevolen. Bij migratie experimenten, de expressie van chemokine (CC) receptoren (zoals CCR7) en in vitro migratie assays worden aanbevolen.

Hoewel ¹⁹ F / ¹ H MRI houdt belofte voor het bestuderen van cel migratie met name voor klinische doeleinden, zijn er momenteel een aantal beperkingen. Deze omvatten (i) een ruimtelijke resolutie die zich verzet tegen directe visualisatie van afzonderlijke cellen, (ii) voldoende ^19F gevoeligheid (detectielimiet van verscheidene 10 ⁵ cellen in een ROI), (iii) verhoogde scan lengtes als gevolg van toegenomen gemiddelde te compenseren de vorige beperking (iv) een beperkt aantal ¹⁹ F RF resonatoren brengen en (v) eventuele ongewenste achtergrond ¹⁹ signaal F van andere fluor-bevattende elementen zoals isofluorane en polytetrafluorethyleen (PTFE) in MR hardwarecomponenten (bijv. condensatoren en aansluitkabels).

Naast factoren zoals magnetische veldsterkte en gradiënten, een belangrijke determinant dat het niveau van ruimtelijke resolutie bepaalt de gevoeligheid van de radio frequentie (RF) gebruikte resonator ^21. MRI resolutie is nauw verwant aan de signaal-ruisverhouding (SNR) ²¹ en bij het ​​verminderen voxelgrootte te amplificeren ruimtelijke resolutie, een verlies in SNR te verwachten. Een manier om ruimtelijke resolutie te verhogen, zonder afbreuk te doen aan het signaal gevoeligheid voor cryogeen-gekoelde spoelen die SNR te verhogen door het verminderen van thermische ruis ²² in dienst. Met behulp van een 1H hoofd spoel die een cryogeen systeem gebruikt, kunnen we onlangs visualiseren cellulaire infiltraten in de experimentele autoimmune encefalomyelitis na het gebruik van een in het vlak resolutie (35x35) ^{2 23} urn. De toepassing van deze cryogeen gekoelde technologie ¹⁹ F / ¹ H MRI zou op zijnportunity om een ​​aantal van de MRI beperkingen in verband met mobiele signaal detectie en oplossing te overwinnen.

Een belangrijk punt in vivo volgen van cellen door MRI is de kwantificering van deze cellen in een bepaalde locatie in een levend organisme. Hiervoor is het mogelijk om ¹⁹ F MRS (zie 5,1-5,9) uit te voeren. Door gebruik kalibratiekrommen die worden verkregen uit ¹⁹ F MRS metingen van verschillende aantallen ^{19F-gelabelde} DC, is het mogelijk om het aantal cellen bereiken de lymfeknoop afleiden. De ^19F MRS metingen van de lymfeklieren te vergelijken met de ^19F MRS DC kalibratiecurve. Bovendien, door het vergelijken van de gegevens van de MRS DC cel kalibratiecurves de zuivere PFCE, kunnen we afleiden dat het mogelijk is om ongeveer 10 ^{13 19} F rotaties per cel detecteren na labeling. Volgens MR principes, de laagste detectielimiet is 10 ¹⁸ spins per voxel ²⁴. Zo kunnen we aannemen dat we in staat zijn om een minimum aantal van 10 ⁵ DC per voxel met behulp van een 9,4 T MRI te detecteren.

Samengevat, het protocol dat hier beschreven is nuttig voor in vivo onderzoeken bestuderen celmigratie tijdens pathofysiologische processen. De noninvasiveness van de techniek laat longitudinale studies zonder de noodzaak van offeren grote aantallen dieren de mogelijkheid om ^19F beelden overlappen van de gelabelde cellen op ^1H anatomische beelden bevordert optimaal en zeer selectief volgen van de migrerende cellen, en ^19F MRS voorziet een mogelijkheid om het aantal cellen te lokaliseren op specifieke anatomische gebieden in vivo te schatten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
L-glutamine	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
Petri dishes (35 x 10 mm)	VWR, Germany	391-1996
27 ½ G syringes	VWR, Germany	612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh)	VWR, Germany	734-0004
NMR tubes	VWR, Germany	634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools	FST
CO2 incubator	Binder
Small animal MR system	Bruker Biospin		9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil	Rapid Biomed, Würzburg, Germany		35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil	in-house		tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system	Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025	SA Instruments Inc., New York, USA