Summary
Verfolgung von Zellen mittels MRT hat bemerkenswerte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung von dendritischen Zellen mit Fluor (
Abstract
Kontinuierliche Fortschritte in der nicht-invasiven bildgebenden Verfahren wie Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) haben stark unsere Fähigkeit, physiologische oder pathologische Prozesse in lebenden Organismen zu studieren verbessert. MRT erweist sich auch ein wertvolles Werkzeug für die Erfassung transplantierten Zellen in vivo sein. Initial Zellmarkierung Strategien für MRI gemacht Verwendung von Kontrastmitteln, die die MR-Relaxationszeiten beeinflussen (T1, T2, T2 *) und führen zu einer Erhöhung (T1) bzw. Abreicherung (T2 *) des Signals in dem markierten Zellen vorhanden sind. T2 * Verstärkungswirkstoffe wie ultrakleine Eisenoxid Agenten (USPIO) wurden eingesetzt, um die Zellwanderung und einige haben auch von der FDA für die klinische Anwendung zugelassen zu studieren. Ein Nachteil von T2 * Mittel ist die Schwierigkeit, das Signal Löschung durch den markierten Zellen von anderen Artefakten wie Blutgerinnsel, Mikro Blutungen oder Luftblasen erzeugt unterscheiden. In diesem Artikel beschreiben wir eine aufstrebende Technik für die Tracking-Zellen in vivo, dasswird zur Kennzeichnung der Zellen mit Fluor (19 F)-reiche Partikel. Diese Partikel werden durch Emulgieren Perfluorcarbon (PFC)-Verbindungen und dann auf Label-Zellen, die anschließend durch 19 F MRI abgebildet werden können, erstellt. Wichtige Vorteile von PFC für Handy-Tracking in vivo include (i) das Fehlen von Kohlenstoff-gebundenen F 19 in vivo, die dann liefert Hintergrund-Bilder und komplette Zelle selectivityand (ii) die Möglichkeit, die Zelle, das durch 19 F MR-Spektroskopie quantifiziert .
Introduction
Das Tracking von Zellen in vivo ist ein entscheidender Aspekt in mehreren Bereichen der Biomedizin. Hierzu sind invasive bildgebende Verfahren, die selektiv lokalisiert Zellen über einen längeren Zeitraum kann extrem wertvoll. Vor der Entwicklung von dreidimensionalen Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), wurde die Verfolgung der Immun-Zellmigration mikroskopische Analysen oder Gewebeproben beschränkt. Handy-Tracking mit Hilfe von MRI hat immense Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, nicht nur für das Studium Immunologen Immunzellen Verhalten in vivo, sondern auch für die klinische und die Stammzell-Forscher. Während Mitte der 90er Jahre, Nanopartikel die ersten Studien auf Eisenoxid 1 initiiert eine Kaskade von Entwicklungen für die Verfolgung von Zellen mit MRT. Eisenoxid-Partikel verkürzen die MR-Relaxationszeit (T2 *) der markierten Zellen und damit Signal Erschöpfung in MR-Bildern. Eisenoxidteilchen zur Markierung Makrophagen 2, Oligodendrozyten p eingesetztrogenitors 3 und viele andere Zelltypen. Einige dieser Partikel wurden ebenfalls klinisch von der FDA für die Kennzeichnung zelluläre Impfstoffe in Melanom-Patienten 4 genehmigt. Da in vivo oder ex vivo-Markierung von Zellen mit Eisenoxidteilchen stützt sich auf eine Verkürzung der T2 *-Signal, wobei letzteres auch etwa durch in vivo gebracht Anfälligkeit Zusammenhang T2 * Effekte wie Mikro Blutungen Eisenlagerstätten oder Luftblasen es könnte schwierig sein, markierten Zellen in vivo zu identifizieren aus anderen Hintergrund T2 *-Signal Aussterben 5.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Technik für die Verfolgung von dendritischen Zellen (DC) in vivo durch den Einsatz von 19 F / 1 H Magnetresonanz-Tomographie (MRT). Diese Zelle Tracking-Technologie wurde erst im Jahr 2005 eingeführt, 6, mehrere Jahre nach der ersten erkannte Anwendungen für 19 F in MRI worden war 7 gemeldet. Ein wichtiger ADVAntage von 19 F auf Eisenoxidpartikels Zellmarkierung ist die geringe biologische Auftreten von 19 F in Gewebe, das macht es möglich, Zellen sehr selektiv zu verfolgen im Grunde mit Hintergrund-Bilder. Weiterhin ist es möglich, die 19 F MR-Signal von den transplantierten markierten Zellen überlagern mit anatomischen Bilder von herkömmlichen 1H MRI erhalten. 19 F / 1 H MRI ist daher wesentlich, die für Studien, Zellmigration in vivo. Zellen, die mit dieser Methode untersucht werden mit 19 F-reiche Partikel bezeichnet. Synthetisch abgeleitet perfluorierte Kohlenwasserstoffe (FKW), die hauptsächlich aus Kohlenstoff und Fluor-Atome werden häufig verwendet, um die Teilchen herzustellen. Diese Verbindungen sind nicht wasserlöslich und müssen vor der Applikation in vitro oder in vivo emulgiert werden. Die übliche Größe der Teilchen, die PFC von anderen Gruppen wurden für Arbeitnehmer in vivo 19 F-MRT Tracking Experimenteim Bereich zwischen 100 nm und 245 nm 6,8-10. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Effizienz bei der Markierung von dendritischen Zellen mit Perfluor-15-Krone-5-Ether (PFCE) Teilchen mit zunehmender Teilchengröße (> 560 nm). 11
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Protocol
Alle tierischen Verfahren müssen von der lokalen institutionellen Tierschutz Ausschuss vor der Ausführung genehmigt werden. Während der MR-Messungen ein angemessenes Niveau der Anästhesie und physiologischen Überwachung (Körpertemperatur, Atemfrequenz) sind unabdingbare Voraussetzungen.
1. Erzeugung von Maus-Knochenmark-abgeleiteten dendritischen Zellen
- Auszug Knochenmarkzellen aus C57BL / 6 Mäusen wie zuvor 12 beschrieben. Dieses Protokoll stammt bis 1992 13 und wurde ursprünglich von der Gruppe von Ralph M. Steinman (1943-2011), der Entdecker der dendritischen Zelle 14 beschrieben.
- Kurz gesagt, extrahieren Schien-und Wadenbein bald nach opfern Mäusen. Arbeiten unter dem Laminarströmungshaube (eine Verkeimung zu verhindern), spülen Sie das Knochenmark in einer kleinen Petrischale mit wash Medium (5% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% HEPES in RPMI) 12.
- Übertragen Sie die Zellsuspension durch eine Zelle strainer (100 um Maschenweite, Nylon) in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, um Knochen und übrig gebliebene Gewebe zu entfernen. Nach mehreren Waschschritten und einer Lyse Schritt 12 zählen die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einer Zählkammer.
- Resuspendieren Knochenmarkszellen in einer Konzentration von 400.000 Zellen ml -1 in Kulturmedium (RPMI mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin 1% HEPES und 1% L-Glutamin), enthaltend 75 ng ml -1 des Maus Granulozyten Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (MGM-CSF) aus Überständen von 293FT HEK-Zellen mit einer Maus GMCSF transfiziert erhalten. Übertragen 10 ml Zellsuspension (4 x 10 6 Zellen) in Petrischalen (100 mm x 20 mm) und Inkubation in einem CO 2-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Am Tag 3 aufzufüllen alte Medium mit 10 ml frischem Medium (Ende halten Konzentration mGM-CSF bei 75 ng ml -1). Am Tag 6, entfernen 10 ml altes Medium und fülltmit 10 ml frischem Medium (MGM-CSF Endkonzentration = 75 ng ml -1). Am Tag 8, entfernen 10 ml altes Medium und füllt mit 10 ml frischem Medium (MGM-CSF Endkonzentration = 150 ng ml -1).
- Am Tag 10, reifen die differenzierte DC mit 1 ug ml -1 Lipopolysaccharid (LPS) für 24 Stunden.
2. Markierung von dendritischen Zellen mit 19 F-reiche Partikel
- Während der 24 Stunden Reifung Schritt (1.5), die DC-Label mit 1 mM fluorreichen Perfluor-15-Krone-5-Ether (PFCE) Teilchen (500-560 nm) auch für 24 Stunden. Bereiten großen Fluor-markierten Partikel durch Emulgieren PFCE in Pluronic F-68 (Gesamtvolumen 2,5 ml) unter Verwendung eines Zell-störenden Titansonotrode und unter Verwendung eines kontinuierlichen Puls-Programm (100% Amplitude, Leistung = 250 W) 60 s lang.
- Nach den oben Inkubationsschritte Ernte der reifen und Fluor-markierten DC mit einem Gewebekulturzelllinien Schaber, Überführung in einen 50-ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugebei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur gerührt.
- Um abwaschen alle übrig gebliebenen Partikel und abgestorbene Zellen, lassen geernteten Zellen auf Poly-L-Lysin-Gerichte zu halten. Um diesen Schritt vorzubereiten, Mantel Petrischalen mit Poly-L-Lysin (1 mg ml -1) bei 37 ° C für 1 Stunde, danach abwaschen des ungebundenen Poly-L-Lysin mit PBS.
- Inkubieren über geernteten Zellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten Platten in serumfreiem Medium und lassen sich an Zellen (1 h bei 37 ° C, 5% CO 2).
- Waschen Sie die mittel-bis nicht-haftenden Zellen verbleibenden Partikel und abgestorbene Zellen zu verwerfen und dreimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS.
- Ernte adhärenten Zellen durch Trypsin-EDTA-Behandlung (0,25% Trypsin-EDTA, 3 min Inkubation bei 37 ° C).
- Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt waschen, suspendieren die erforderliche Menge an reifen DC in serumfreiem sterile PBS.
- Um festzustellen, ob die Zellen wurden erfolgreich markiert, ist es empfehlenswert, die physicoche überprüfenmische Eigenschaften der Zellen mittels Durchflusszytometrie (FACS). Die seitliche Streulicht (SSC) sollte eine erhöhte Granularität in diesen Zellen zu offenbaren, wie zuvor 11 beschrieben. Es sollte auch bedacht werden, dass Fibroblasten könnte die DC Kulturen verunreinigen und könnte auch nehmen die 19 F-Teilchen in parallel. Deshalb ist die DC Reinheit zu beurteilen (durch Messung der Anteil der CD11c + CD11b + Zellen mit FACS) vor in vivo-Anwendung werden.
3. In vivo-Anwendung von 19 F-markierten dendritischen Zellen
- Verwalten DC (6. Oktober - 7. Oktober) in einem Volumen von 50 - 100 ul intrakutan in die Hinterbeine einer C57BL / 6 Maus durch Positionieren der Maus in einem Halter und sorgfältig Einsetzen einer Nadel 26 G ½ in die oberen Schichten der Haut vor der Anwendung (Verwendung 0,5 ml Tuberkulin Spritzen mit fest angeschlossene Nadeln Totvolumen zu minimieren). Um eine zu gewährleistenn entsprechenden intrakutan Anwendung ist es wichtig, dass der eingeführte Teil der Nadel teilweise sichtbar unter der Haut. Wenn die Nadel ist nicht mehr sichtbar, hat die Nadel eingeführt worden zu tief in die Hautschichten. Für das ungeübte einzelnen könnte die intrakutanen Anwendung unter Narkose durchgeführt werden.
- Bild in den Extremitäten in vivo Fluor (19 F) / Proton (1 H) MRI (siehe nächster Abschnitt) 21 h nach der Injektion.
4. In Vivo 19 F / 1 H Magnetic Resonance Imaging
Die detaillierte Anleitung für die Einrichtung der MR-Scans beziehen sich auf einen Bruker MR-Scanner mit der Steuerungs-Software Paravison (Version 5.1). Bezeichnungen, Hersteller-spezifische Funktionen und Optionen sind kursiv hervorgehoben. Für andere MR-Scannern können diese Schritte müssen nach der Hersteller-Richtlinien angepasst werden.
- Vereinbaren Sie Zugang zu einem dediziertenKleintier-MR-Scanner. Für eine ausreichende Bildqualität, ein System mit einer Magnetfeldstärke von 9,4 Tesla oder mehr und maßgeschneiderte Hochfrequenzspulen (z. B. 1 H / 19 F Dual-Band abstimmbaren HF-Spule, 35 mm Innendurchmesser, 50 mm Länge, schnelle Biomed, Würzburg, Deutschland) werden empfohlen.
- Vor MRI, bereiten Sie das Setup des MRI-Scanners für Anästhesie und physiologischen Überwachung. Stellen Sie sicher, dass die Atemmaske des Tieres Bett / Halter an der Isofluran-System angeschlossen ist und dass der Temperaturfühler und die Atmung Pad zu einem entfernten Tier-Monitoring-System (z. B. Modell 1025, SA Instruments Inc., New York, USA) verbunden. Letztere dient dazu, das Tier Vitalparameter wie Körpertemperatur und Atmung zu überwachen.
- Anesthetize Mäuse durch Inhalation Narkose mit einer Maus Kammer, die mit einem Isofluran-System. Stellen Sie den Durchfluss für Luft-und O 2 bei 0,2 L min -1 und 0,1 L min -1 bzw.und 3% Isofluran (bereinigt von einem Verdampfer) für ca. 2 min, bis das erforderliche Niveau der Narkose erreicht ist (keine Antwort folgende toe Prise). Optimale Flussraten je nach Setup verwendet wird. Seien Sie sich bewusst, dass hohe Strömungsgeschwindigkeiten kann zu Austrocknung führen. Eine sorgfältige Überwachung der Tiere "Bedingungen ist jederzeit erforderlich, wie oben erwähnt.
- Positionieren Sie den Mauszeiger auf die Maus anfällig Bett / Inhaber der Kleintier MR Scanner (Abbildung 1).
- Während man den Durchfluss für Luft-und O 2 konstant, passen Sie die Isofluran Verdampfer auf 0,8-1,5%, bis eine optimale Atmung erreicht ist. Eine Atemfrequenz von 50 - 70 Atemzüge pro min empfohlen.
- Halten Sie die Körpertemperatur auf 36-37 ° C während des Experiments durch die Verwendung eines warmen Wasser (oder alternativ Warmluft) Kreislauf-System.
- Halten Sie die Augen der Maus feucht mit sterilem Auge Schmier Salbe während der Messung.
- Nach dem Befestigen des Tieresauf dem Imaging-Halter und die Anbindung an das Monitoring-System, bewegen Sie den Halter in der Mitte des 1 H / 19 F HF-Spule (das ist im Isozentrum des Tieres Scanner Magneten positioniert).
- Die Position der Maus, so dass das Knie in das Isozentrum des Magneten liegt, entweder mit einem automatisierten Verfahren (zB unter Verwendung eines Lasers mit einer Positionierung motorbetriebenen Tierhalter kombiniert) oder durch manuelle Berechnung des Abstandes der Halter bewegt werden muss in den Magneten zu erreichen Isozentrums.
- Zur Bestätigung der korrekten Positionierung des Tieres in den Scanner und die spätere Planung des Bildscheibe Geometrie (dh Größe, Position und Rotation im Raum), erwerben scout Bilder in drei Standard-Orientierungen (axial, koronal, sagittal) mit schnellen und Bild mit niedriger Auflösung Erwerb Methoden (zB TriPilot Protokoll, das einen FLASH-Pulssequenz verwendet).
- Stimmen Sie die HF-Spule auf die 1 H-Resonanzfrequenz (zB. 400,1 MHz für 9,4 T) und dem 19 F Resonanzfrequenz (zB 376,3 MHz für 9,4 T) und passen Sie die Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning-Monitor des Tieres MR-Scanner. Tuning und Matching ist notwendig, um die optimalen Bedingungen für die Übertragung und Empfang zu erzielen.
- Führen Sie die erforderlichen Einstellungen, einschließlich automatisches System Shim zur Feinabstimmung der Homogenität des Magnetfeldes (zB ADJ_SHIM), Netzfrequenz Anpassungen an die RF der Larmorfrequenz der Maus (zB ADJ_SF) und Referenz-Verstärkung einzustellen, um die HF-Amplitude einstellen ( zB ADJ_REFG). Alle diese Einstellungen sind wichtig, um die statischen und variablen magnetischen Feldern (B 0, B 1) in der Region von Interesse machen so homogen wie möglich.
- Erwerben Sie einen zweiten Satz von scout Bilder (wie oben) entlang der drei orthogonalen Orientierungen, nach dem Einstellen das Sichtfeld (FOV), so dass beide unteren Gliedmaßen are sichtbar von Becken bis Fuß (LxBxH = 50x25x25 mm). Diese Bilder dienen dazu, die Orientierungen der endgültige 3D 1 H / 19 F-Scans planen.
- Richten Sie eine TurboRARE 3D Protokoll für 1 H-Scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, RARE Factor = 16 (. Zykluszeit ca. 60 min). Stellen FOV mit Hilfe der scout Bilder, starten Sie den Scan (Ampel).
- Einlegen eines einzelnen Impulses FID-Sequenz mit TR von mindestens 1000 msec. Öffnen Sie Bearbeiten Scan und stellen Kern bis 19 F. Verwenden Sie die manuelle Gain-Einstellungen, indem Sie das automatische Bezugsverstärkung im Edit-Methode der Toolbox.
- Messung starten ohne Aufzeichnung von Daten, um eine MR-Signal in Echtzeit mit APS (go Setup) anzuzeigen. Wenn die 19 F spektrale Signal innerhalb der Akquisition Fenster ist zu niedrig, fügen Sie mehr Durchschnitte Methode bearbeiten und / oder modulieren die Pulsabschwächers (TX0 oder SP0 Schieberegler), bis eine signal ist deutlich sichtbar. Stellen Sie die Grundfrequenz, um Mitte des 19. F spektralen Peak bei 0 Hz in den Erwerb Fenster. Bewerben Grundfrequenz und drücken Sie STOP. Beachten Sie, dass die Isofluran als Anästhesie kann einen Hintergrund zu erzeugen. 9.4 Tesla MRI die chemische Verschiebung zwischen den 19 F-enthaltenden Teilchen und Isofluran etwa 1.800 Hz liegt. Stellen Sie sicher, dass die Anregung Bandbreite kleiner als 3.600 Hz ist die spannende Isofluran zusammen mit den 19 F-markierten Zellen oder Partikel zu vermeiden. Die Grundfrequenz ist richtig auf dem Signal von der 19 F-markierten Zellen erzeugt eingestellt werden. Alternativ könnte eine andere Methode der Anästhesie verwendet, wie der Experimentator sieht fit werden.
- Clone (Duplizieren) die TurboRARE 3D-Protokoll aus dem vorherigen 1 H-Scan. Zur Methode und deaktivieren Sie die automatische Referenz Verstärkung (wie oben) bearbeiten. Set 19 F Kern von Scan bearbeiten. Ändern Sie die Matrix 128x64x64und der RARE-Faktor auf mindestens 40 (bis zu 64). Für einen TR / TE 1000/6 ms und 64 beträgt, ist die Scan-Zeit ca. 70 min. Stellen Sie den Empfänger Gewinn auf 101 (Toolbox) und starten Sie den Scan ohne weitere Anpassungen mit GOP (go-Pipeline).
- Wenn die Scans fertig sind einfahren Maus Halter aus dem MR-Scanner. Trennen Sie die Maus vorsichtig aus der Halterung. Wenn die Maus nicht für ex vivo-Analyse (zB Histologie oder Spektroskopie, siehe unten) geopfert direkt nach der MR-Messungen, genau beobachten, bis sie vollständig aus der Narkose erholt hat. Regulierung der Körpertemperatur durch die Narkose beeinflusst wird, so bei der Wiederherstellung, legen Sie die Maus in einem separaten Käfig, an einem warmen Temperatur-geregelte Pad platziert wird. Sobald die Maus vollständig aus der Narkose erholt, sie wieder in ihre Haltekäfig und dem Tier Raum.
- Um die 19 Bilder F 1 H Bilder überlagern, verwenden Sie das Menü Ansicht option auf der gleichen Software (Paravison). Die Unterlage Funktion kann unter Korrelation gefunden werden. Speichern Sie die Unterlage, laden Sie das neue Bild und markieren Sie die 19 F-Schicht durch die Definition eine neue Farbe aus der Nachschlagetabelle. Um zwischen den 19 F-und 1 H-Scans diskriminieren, ändern Sie den Schwellenwert für die gewählte Farbe (geschnitten Nachschlagetabelle), so dass die 19 F-Signal wird die gewählte Farbe und den Hintergrund 1 H Bild haben wird in Graustufen bleiben. Andere Nachbearbeitung Programme (zB ImageJ) stehen zur Verfügung, um die 1 H / 19 F Bild-Overlays erstellen.
- Sollte ein in vivo Quantifizierung der 19 F-Signal notwendig sein, folgen eine einfache quantitative Protokoll wie zuvor beschrieben 15,16. Kurz gesagt, kann die Quantifizierung, indem ein Verweis Rohr mit einer bekannten Konzentration von PFCE-Emulsion innerhalb des FOV neben der Maus durchgeführt werden. Nach dem Erwerb der MR-Bilder, QuanTIFY der Intensitäten der Signale unter Verwendung von 19 F-Region of Interest (ROI)-Analyse und zu vergleichen, um die in vitro Eichkurve wie in Fig. 2 gezeigt.
5. Lymphknoten Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS)
- Nach Einbußen bei der Maus, entfernen Sie die Popliteallymphknoten und in einem kleinen 5 mm NMR-Röhrchen und 100 ul von 2% PFA.
- Installieren eines 19 F-Spektroskopie Spule (zB eine Ringspule), die eine Öffnung von mindestens 5 mm zur Aufnahme der NMR-Röhrchen mit den Lymphknoten ist.
- Legen Sie das NMR-Röhrchen im Inneren der Spule und bewegen Sie die Spule in die Isozentrums des Magneten.
- Stimmen Sie die HF-Spule auf die 19 F Resonanzfrequenz (zB 376,3 MHz für 9,4 T) und passen Sie die Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning-Monitor des Tieres MR-Scanner. Tuning und Matching ist notwendig, um die optimalen Bedingungen für die Übertragung und Signalverarbeitung erreichenEmpfang.
- Stellen Sie alle Parameter innerhalb der Shim Unterlegmaß Toolbox auf 0 und drücken anzuwenden. Normalerweise ist es nicht erforderlich, Trimm-Verfahren anzuwenden, da das Volumen der Probe ist relativ klein. Wenn eine ausreichende 19 F-Signal verfügbar ist, können automatisierte Verfahren zur Shim, Netzfrequenz und Empfänger Gewinn wie oben beschrieben angewendet werden.
- Einlegen eines einzelnen Impulses FID-Sequenz mit TR von mindestens 1000 msec. Öffnen Sie bearbeiten Scan und stellen Sie den Kern auf 19 F. Verwenden Sie die manuelle Gain-Einstellungen, indem Sie das automatische Bezugsverstärkung im Edit-Methode der Toolbox. Stellen Sie die Anzahl der Mittelwerte zu 1.
- Starten Sie die Sequenz mit APS. Wenn die 19 F spektrale Signal innerhalb der Akquisition Fenster ist zu niedrig, fügen Sie mehr Durchschnitte Methode bearbeiten und / oder modulieren die Pulsabschwächers (TX0 oder SP0 Schieberegler), bis ein Signal ist deutlich sichtbar. Stellen Sie die Grundfrequenz, so dass die 19 F speMittelamerika Peak in der Mitte des Erfassungsfensters bei 0 Hz und gelten Grundfrequenz. Stellen Sie die Pulsabschwächers erneut, um das Signal, bis 90 ° Anregung erreichen zu maximieren. Wenn das Signal mit maximaler Presse Stop ist.
- Stellen Sie die Durchschnittswerte im Edit-Methode zwischen 64 und 256 (oder mehr, falls erforderlich, je nach Signal) und starten Sie die Übernahme mit GOP. Das erfasste Signal korreliert linear mit der Anzahl der Mittelwerte. Während Quantifizierung im Hinterkopf behalten, dass das erfasste Signal an einem durchschnittlichen normalisiert werden muss. Darüber hinaus ist ein Kalibriernormal einer bekannten Konzentration oder eine Eichkurve notwendig, die Anzahl von Zellen aus dem normierten Signal F 19 (2) zu berechnen.
- Sobald der Scan abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe, legen Sie die nächste Probe und fahren Sie mit Schritt 5.3.
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Representative Results
Achtzehn bis 21 Stunden nach Anwendung intrakutanen, 19 F-markierten dendritischen Zellen (DC) in die Drainage Popliteallymphknoten migrieren. Die Bewegung der DC über die Lymphbahnen in die Drainage politeal Lymphknoten können durch Überlagerung der 1 H anatomische Bilder mit den 19 F DC Bilder (2A) geschätzt. Wir haben bereits über die Migration dieser Zellen in vivo, sowie die Auswirkungen der 19 F-Partikelgröße auf DC Immunbiologie, einschließlich Aufnahmeeffizienz 11 gemeldet. Um das Ausmaß der DC Migration in die Lymphknoten zu quantifizieren, werden wir den Lymphknoten und führen 19 F MRS (2B). Wenn wir vergleichen die 19 F-Signal von jedem Lymphknoten mit dem 19 F-Signal aus einer unterschiedlichen Anzahl von DC mit den gleichen PFCE Teilchen (Eichkurve, 2C) können wir ableiten, beschriftet erhaltenendie Zahl der 19 F-markierten DC, die Lymphknoten zu erreichen. In der repräsentativen Experiment in den 2A und 2B gezeigt ist, kann man folgern, dass 3,6 x 10 5 Antigen-beladenen DC das Recht Lymphknoten erreicht wird, während 7,5 x 10 4 DC, die nicht mit Antigen beladen wurden erreicht die rechte Lymphknoten.
Abbildung 1. Position der Maus an der Maus Inhaber der Kleintier-MR-Scanner.
Abbildung 2. Quantifizierung von 19 F-markierten DC Migration in vivo mittels 19 F MRS. (A) DC wurden mit 1 mM 560 nm PFCE particl beschriftet es, mit (rechts) oder ohne (links) Antigen beladen und intrakutan in Hinterbein verabreicht. Ganze Hähnchen Ovalbumin (OVA) wurde als Antigen verwendet wird; OVA wurde mit dem DC zusammen mit den 19 F Teilchen inkubiert. Dendritische Zellen sind als 19 F MR-Signal (rot) dargestellt, während Lymphknoten und Lymphbahnen in den 1 H-anatomischen MR-Bild (Graustufen) werden angezeigt. Die Bilder wurden mit einer 19 F / 1 H Dual-abstimmbaren Volumen Käfigresonator erworben. (B) Lymphknoten von Mäusen in A wurden extrahiert und in einem NMR-Röhrchen gezeigt. Die 19 F-Signal wurde durch 19 F MRS (siehe Text Protocol) und die Amplitude wurde durch Ausführen einer schnellen Fourier-Transformation (FFT) des erworbenen Free Induction Decay (FID) berechnet gemessen. (C) über einen Zeitraum von 24 Stunden, verschiedene Mengen von DC wurden mit 1 mM 560 nm PFCE Partikel markiert und 19 F-Signal wurde durch 19 F MRS als in B. gemessenef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Methode der Verwendung von 19 F / 1 H MRI, um die Bewegung von DC in den Lymphknoten folgen die Möglichkeit gibt, die Wanderungsbewegungen von Immunzellen in vivo zu untersuchen. Dendritische Zellen sind hervorragende Beispiele für die Migration schnell Immunzellen, die in der Lage, durch dreidimensionale Strukturen dicht ohne Einhaltung spezifische Substrate 17 zu manövrieren sind. Obwohl die geringe räumliche Auflösung (um-Bereich) der beschriebenen Technik ist nicht vergleichbar mit der hohen Auflösung (nm), die mit Mehrphotonenmikroskopie erreicht werden kann, mit dieser Technik ist es immer noch möglich, die Natur der Zellwanderung in vivo und über studieren einen längeren Zeitraum. Darüber hinaus hat die Mikroskopie eine begrenzte Eindringtiefe und ein eingeschränktes Sichtfeld, so dass es derzeit nicht für große Flächen Bildgebung innerhalb eines lebenden Organismus.
Aufgrund der Invasivität des Verfahrens ist es möglich, monitor die Migration von Immunzellen für mehrere Tage, ohne dabei die Maus nach der Untersuchung. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, die 19 F-Bildern, die die Migration von Zellen mit anatomischen 1 H-Scans zu erfassen, wodurch eine genaue Lokalisierung der Zellen innerhalb des lebenden Organismus zu überlagern. Diese Technik ermöglicht es uns, molekulare Mechanismen DC Migration zu studieren. Im Gegensatz zu typischen in vitro Zellmigrationsassays Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Zellwanderung in einer physiologischen 3D-Umgebung.
Die mögliche Anwendung von 19 F in MRS und MRT sind seit langem erkannt 7,18. Die hohe gyromagnetischen-Verhältnis, hohe Spin und natürliche Isotopenhäufigkeit macht 19 F ein idealer Kandidat für MR-Bildgebung 7. Darüber hinaus ist die Ähnlichkeit zwischen 19 F und 1 H (in Bezug auf ihre Eigenschaften NMR) eine Voraussetzung für eine sinnvolle Überlagerung zwischen ter anatomische 1H MRT mit den 19 F MRT der markierten Zellen. In der Tat besteht ein Vorteil der 1 H / 19 F MRI gegenüber anderen 1 H / X-Kerne MRI ist, dass die gleiche HF-Resonator sowohl für 19 F und 1 H-Kerne verwendet werden. In den meisten Anwendungen für 19 F / 1 H MRI, ein Volumen Resonator verwendet wird verwendet werden, die sowohl 19 F und 1 H. abgestimmt werden Aufgrund der nahezu identischen B 1-Feldes für beide Kanäle, eine Übertragung von Energie-Einstellungen aus dem 1 H-Kanal (das ist leichter zu messen) an die 19 F-Kanal ist somit möglich.
Ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen, wenn die Markierung von Zellen mit Partikeln jeder Größe (von extrem kleinen und großen Mikro-Partikeln) ist das Potential der biologischen Manipulation und Toxizität. Wir haben kürzlich gezeigt, dass durch die Erhöhung der Größe der Beschriftung Teilchen, könnten wir die Reifung Status der DC 11 zu fördern. Eine möglicheErklärung für unsere Erkenntnis ist das Übergewicht für Partikel, die größer als 500 nm bis durch Phagozytose aufgenommen werden anstatt Endozytose 19; der ehemalige Aufnahme Mechanismus definiert die Art der DC. Andere physikalische Eigenschaften (zB Partikelform und Oberflächentopologie) könnte auch verändern die biologische Funktion der markierten Zellen und sollte auch sorgfältig geprüft werden 20. Für jede gegebene Versuchsanordnung, die Kennzeichnung von DC mit Teilchen erfordert, ist es daher empfehlenswert, dass typische Zellbiologie Assays parallel zu dem Versuch zu bestimmen / schließt eine Beeinflussung der Teilchen über die biologischen Eigenschaften dieser Zellen durchgeführt. Mehrere Assays durchgeführt werden, abhängig von der experimentellen Untersuchung in Frage. Um einen Einfluss auf DC Reifung auszuschließen, wird Messungen der Zelloberfläche Marker (zB CD80, CD86) Expression durch FACS empfohlen. Um einen Einfluss auf die Antigen-Aufnahme und Präsentation, Phagozytose exper ausschließeniments und T-Zell-Priming Experimente bzw. empfohlen. Im Fall von Migration Experimenten wurde die Expression von Chemokin (CC)-Rezeptoren (wie CCR7) und in vitro Zellmigrationsassays empfohlen.
Obwohl 19 F / 1 H MRI hält Versprechen zur Untersuchung von Zell Migration insbesondere für klinische Zwecke, gibt es derzeit eine Reihe von Einschränkungen. Dazu gehören (i) eine räumliche Auflösung, die direkte Visualisierung der einzelnen Zellen ausschließt, (ii) 19 F unzureichende Sensitivität (Nachweisgrenze von einigen 10 5 Zellen innerhalb einer ROI), (iii) erhöhte Scan-Dauer als Folge der erhöhten Mitteln zu kompensieren für die bisherige Beschränkung, (iv) eine begrenzte Anzahl von 19 F RF Resonatoren auf dem Markt und (v) mögliche unerwünschte Hintergrund 19 F-Signal von anderen fluorhaltigen Elemente wie Isofluran und Polytetrafluorethylen (PTFE) im MR Hardwarekomponenten (zB Kondensatoren und Verbindungskabel).
Abgesehen von Faktoren wie Magnetfeldstärke und Gradientenstärken ist ein entscheidender Faktor, der den Grad der räumlichen Auflösung bestimmt, die Empfindlichkeit des Hochfrequenz-(HF)-Resonator 21 verwendet. MRI Auflösung ist eng mit dem Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) 21 verbunden und nach Verringerung Voxel zu räumliche Auflösung zu verstärken, ist ein Verlust in SNR zu erwarten. Ein Weg, um räumliche Auflösung ohne Kompromisse Signal Empfindlichkeit zu erhöhen, ist kryogenisch gekühlten Spulen, SNR, indem thermische Rauschen 22 steigern beschäftigen. Mit Hilfe eines 1H Kopf Spule, einer kryogenen System nutzt, konnten wir vor kurzem visualisieren Zellinfiltrate in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis nach der Verwendung in ein Flugzeug Auflösung (35x35) um 2 23. Die Anwendung dieser kryogenisch gekühlte Technologie für 19 F / 1 H MRI wäre eine op seinGelegenheit zu überwinden einige der MRI Einschränkungen Zelle Signalerfassung und Auflösung verbunden.
Ein wichtiger Punkt bei in vivo Verfolgung von Zellen durch MRI ist die Quantifizierung dieser Zellen in einem bestimmten Ort innerhalb eines lebenden Organismus. Für diese ist es möglich, 19 F MRS (siehe 5.1-5.9) durchzuführen. Durch den Einsatz von Eichkurven, die aus 19 F MRS Messungen unterschiedlicher Zahlen von 19 F-markierten DC erhalten werden, ist es möglich, die Anzahl der Zellen Erreichen der Lymphknoten abzuleiten. Die 19 F MRS Messungen der Lymphknoten können auf die 19 F MRS DC Eichkurve verglichen werden. Ferner kann durch den Vergleich der Daten aus den MRS DC Zelle Eichkurven mit dem reinen PFCE können wir schließen, dass es möglich ist, ungefähr 10 13 19 F Spins pro Zelle nach der Markierung zu detektieren. Laut MR Prinzipien, ist die niedrigste Nachweisgrenze 10 18 Spins pro Voxel 24. So können wir davon ausgehen, dass wir in der Lage, eine Mindestanzahl von 10 5 DC pro Voxel mit einem 9,4 T MRT erkennen sind.
Zusammenfassend ist das Protokoll, das wir beschreiben hier vorteilhaft für in vivo Untersuchungen studiert Zellwanderung während pathophysiologischen Prozessen. Die Invasivität der Technik ermöglicht Longitudinalstudien ohne dass dabei eine große Anzahl von Tieren, die Fähigkeit, 19 F Bildern aus den markierten Zellen auf 1 H anatomische Bilder überlagern fördert optimal und hoch selektive Verfolgung der Migration von Zellen, und 19 F MRS bietet eine Möglichkeit, die Anzahl der Zellen lokalisiert bestimmten anatomischen Bereichen in vivo zu schätzen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft zu SW (DFG WA 2804) und ein Stipendium der Universität zu SW vom Experimental and Clinical Research Center, eine Kooperation des Max-Delbrück-finanzierte Centrum für Molekulare Medizin und Medizinische Fakultät Charité in Berlin. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Erstellung des Manuskripts. Wir danken Herrn Robert Westphal für technischen Support während seines Praktikums in unserem Labor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA | ||
References
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