Summary
MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명 (
Abstract
이러한 자기 공명 영상 (MRI)와 같은 비 침습적 영상 기법의 지속적인 발전은 크게 살아있는 유기체의 생리 학적 또는 병리학 적 과정을 연구하는 능력을 개선했습니다. MRI는 생체 내 이식 된 세포를 캡처를위한 유용한 도구로 증명된다. MR 휴식 시간에 영향을 미치는 조영제 MRI 만들어 사용 초기 셀 라벨 전략 (T1, T2, T2 *)와 라벨 세포가 존재하는 신호의 향상 (T1) 또는 고갈 (T2 *)로 이어집니다. T2와 같은 초소형 산화철 에이전트 (USPIO) 등 * 개선 에이전트는 세포 이동 및 일부도 임상 적 적용을위한 FDA에 의해 승인 된 공부를하기 위해 고용되었다. T2 * 에이전트의 단점은 혈전, 마이크로 출혈이나 기포와 같은 다른 아티팩트의 표시 세포에 의해 생성 된 신호 멸종을 구별하는 어려움이있다. 이 문서에서는, 우리는 생체 내 추적 세포에 대한 새로운 기술을 설명하는불소 (19 F) 부유 입자와 세포를 라벨링을 기반으로합니다. 이러한 입자는 퍼 플루오르 카본 (PFC) 화합물을 유화하고 이후 MRI 19 F로 군데 할 수있는 레이블 세포를 사용하여 준비가되어 있습니다. 생체 포함 (I) 후 19 F MR 분광법에 의해 세포 신호를 정량화하는 배경이없는 이미지와 완전한 세포 selectivityand (II)의 가능성을 산출 생체 내 탄소 결합 19 F,의 부재에서 세포 추적을위한 PFCs의 중요한 장점 .
Introduction
생체 내에서 세포의 추적 생물 의약의 여러 분야에서 중요한 측면이다. 이 경우, 선택적으로 일정 기간 동안 세포를 지역화 할 수 있습니다 비침 투 이미징 기술은 매우 가치가있다. 세 가지 차원 자기 공명 영상 (MRI)의 개발에 앞서, 면역 세포 이동의 추적 현미경 분석 또는 조직 생검에 국한되었다. MRI의 도움으로 세포 추적은 생체 내에서 면역 세포의 행동을 연구 면역을 위해뿐만 아니라, 지난 몇 년 동안 엄청난 주목을 받았다뿐만 아니라, 임상 및 줄기 세포 연구자있다. 90 년대 중반 동안, 산화철의 첫 번째 연구는 1 MRI로 추적 셀 개발의 폭포를 시작 나노 입자. 산화철 입자는 레이블 세포의 MR 휴식 시간 (T2 *) 단축함으로써 MR 영상에서 신호 고갈의 원인이됩니다. 산화철 입자는 라벨 식세포 2, 희소 돌기 아교 세포 P로 사용되어왔다rogenitors 3 그리고 많은 다른 세포 유형. 이들 입자 중 일부는 임상 흑색 종 환자 4 세포 백신을 라벨에 대한 FDA에 의해 승인되었습니다. 생체 또는 철 산화물 입자와 세포의 생체 라벨링 때문에 T2 * 신호의 단축에 의존하고 후자는 같은 마이크로 출혈, 철의 예금이나 기포 등의 생체 감수성 관련 T2 * 효과에 의해 초래 될 수있다 그것은 다른 배경에서 생체 내에서 T2 * 신호 멸종 5 레이블 셀을 식별하기 어려울 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 19 F / 1 H 자기 공명 영상 (MRI)을 이용하여 생체 내에서 수지상 세포 (DC)를 추적하는 방법을 설명합니다. 이 세포 추적 기술은 MRI의 19 F에 대한 최초의 인식 응용 프로그램은 7보고했다 몇 년 후 2005 년 6에 도입되었다. 하나의 중요한 ADVA산화철 입자 셀 라벨에 19 F의 ntage는 조직의 19 F의 낮은 생물 발생이다, 이것은 기본적으로 배경이없는 이미지를 매우 선택적으로 세포를 추적 할 수 있습니다. 또한, 기존의 상반기 MRI에서 얻은 해부 영상과 이식 표시된 세포에서 19 F MR 신호를 중첩 할 수 있습니다. 19 F / 1 H MRI 따라서 생체 내에서 세포의 이동을 조사 연구에 상당히 관련이 있습니다. 이 방법으로 공부 세포는 19 F 풍부한 입자로 표시되어 있습니다. 주로 탄소와 불소 원자 구성된 합성 파생 된 과불 화탄소 (PFCs의)는 일반적으로 입자를 제조하는 데 사용됩니다. 이 화합물은 물에 불용성이며, 관내 또는 생체 내 응용 프로그램에 앞서 유화해야합니다. F-MRI 추적 실험은 생체 내 19에 대해 다른 그룹에 의해 고용 된 PFC 입자의 일반적인 크기100 nm의 245 nm의 6,8-10 사이의 범위. 우리는 그러나 표시 한 증가 입자 크기 (> 560 nm의)와 퍼플 루오-15-크라운 - 5 - 에테르 (PFCE) 입자의 증가와 수지상 세포를 라벨에 효율 11.
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Protocol
모든 동물의 절차를 수행하기 전에 지역 기관 동물 복지위원회의 승인을 받아야한다. MR 측정시 마취 및 생리 학적 모니터링의 적절한 수준 (체온, 호흡 속도) 필수 요구 사항입니다.
1. 마우스 골수 유래 수지상 세포의 생성
- C57BL에서 골수 세포를 추출 / 6 마우스는 이전 12 설명했다.이 프로토콜은 다시 1992 13 날짜 원래 랄프 M. Steinman (1,943에서 2,011 사이), 수지상 세포 (14)의 발견의 그룹에 의해 설명되었다.
- 간단히, 쥐를 희생 직후 경골과 비골의 압축을 풉니 다. 층류 후드 (미생물 오염을 방지하기 위해)에서 작동, 세척 매체 (5 % FBS, RPMI 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % HEPES) 12와 작은 페트리 접시에 골수를 플러시.
- 셀 스트라 통해 세포 현탁액을 전송iner (100 μm의 메쉬 크기, 나일론) 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뼈와 남은 조직을 제거하기 위해합니다. 몇 가지 세척 단계와 용해 단계 12 이후 판 블루와 혈구를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
- 40 세포의 농도 문화 매체 ML -1을 Resuspend 골수 세포 (RPMI 10 % FBS와 보충, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % HEPES, 1 % L-글루타민) 마우스 과립구의 75 NG ML -1을 포함 플라스미드 마우스 GMCSF 형질 전환 293FT HEK 세포의 상층 액에서 얻은 대 식세포 콜로니 자극 인자 (MGM-CSF). 배양 접시에 세포 현탁액 10 ㎖ (4 × 10 6 세포) (100mm X 20mm)를 전송하고 (37 ° C, 5 % CO 2) CO 2 배양기에서 배양한다. 3 일에 10 ML 신선한 매체 (75 NG ML -1 MGM-CSF의 최종 농도를 유지)와 오래된 매체를 보충. 하루에 6, 오래된 매체의 10 ML을 제거하고 보충10 ML 신선한 배지로 (MGM-CSF 최종 농도 = 75 NG ML -1). 8 일에 오래 된 매체의 10 ML을 제거하고 10 ML 신선한 매체 (MGM-CSF 최종 농도 = 150 NG ML -1)로 보충.
- 하루 10, 24 시간 동안 1 μg ML -1 리포 다당류 (LPS)로 차별화 된 DC 성숙.
2. 19 F 풍부한 입자와 수지상 세포의 레이블
- 24 시간 성숙 단계 (1.5), 라벨 DC시에 1 mM의 불소가 풍부한 퍼플 루오-15-크라운 - 5 - 에테르 (PFCE)는 24 시간 동안 입자 (500-560 nm의). 세포 방해 티타늄 sonotrode를 사용하여 60 초 동안 연속 펄스 프로그램 (진폭 100 %, 전력 = 250 W)를 고용 (총 부피 2.5 ml)에 플루로 닉 F-68에 PFCE을 유화로 큰 불소라는 입자를 준비합니다.
- 상기 배양 단계에 따라 50 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 조직 배양 세포 스크레이퍼, 전송을 사용하여 성숙하고 불소 표시 DC 수확500 실온에서 5 분 × g.
- 남은 입자와 죽은 세포를 씻어, 폴리-L-라이신 요리를 준수 수확 세포를 둡니다. 이 단계를 준비하려면 1 시간 37 ° C에서 폴리-L-라이신 (1 MG ML -1)로 코팅 페트리 접시는 이후 PBS와 언 바운드 폴리-L-라이신을 씻어.
- 혈청이없는 배지에서 폴리-L-라이신 - 코팅 접시에 수확 세포보다 배양하고 (37에서 1 시간 ° C, 5 % CO 2) 세포가 부착 할 수 있습니다.
- 비 부착 세포, 나머지 입자와 죽은 세포를 버리고로 3 회 세척 매체를 씻어 사전 예열 (37 ° C) PBS.
- 트립신-EDTA 처리 (0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 37 ° C에서 3 분 배양)하여 수확 자기편 세포를.
- 다른 세척 원심 분리 단계에 따라 혈청이없는 멸균 PBS에서 성숙 DC의 필요한 금액을 resuspend을.
- 세포가 성공적으로 표시되었는지 여부를 확인하려면, 그것은 physicoche을 확인하는 것이 좋습니다유동 세포 계측법 (FACS)를 사용하여 세포의 화학적 인 특성. 이전 11 설명 된대로 옆으로 분산 (SSC)는,이 세포에서 증가 단위를 공개해야한다. 그것은 또한 섬유 아세포는 DC 문화를 오염 할 수 있으며 병렬 19 F 입자를 취할 수있는 염두에 보관해야합니다. 따라서 DC의 순도는 생체 내 응용 프로그램에서 이전에 (FACS를 사용하여 CD11c + CD11b + 세포의 비율을 측정하여) 평가되어야한다.
3. 19 F-라벨 수지상 세포의 생체 내 응용 프로그램
- 홀더에 마우스를 배치하여 intracutaneously C57BL / 6 마우스의 뒷다리에 100 μL를 조심스럽게 피부의 상위 계층에 26 ½ G 바늘을 삽입 - 50의 볼륨 - DC를 (10 7 10 6) 관리 이전 응용 프로그램 (영구적으로 부착 된 바늘을 사용 0.5 ML의 투베르쿨린 주사기를 죽은 양을 최소화하기 위해). 을 보장하기 위해N 적절한 피내 응용 프로그램, 그것은 바늘의 삽입 된 부분은 피부 아래에 부분적으로 표시하는 것이 중요합니다. 바늘이 더 이상 표시되지 않는 경우, 바늘은 피부 층에 너무 깊이 삽입되었습니다. 훈련받지 않은 개인에 대한, 피내 응용 프로그램은 마취하에 수행 할 수 있습니다.
- 생체 불소에 의한 이미지 사지 (19 F) / 양성자 (1 H) MRI (다음 섹션 참조) 21 시간 뒤에 주입.
4. VIVO에서 19 F / 1 H 자기 공명 영상
MR 스캔 설정을위한 자세한 설명은 제어 소프트웨어 Paravison (버전 5.1)를 사용하여 브루 커 MR 스캐너를 참조하십시오. 공급 업체 특정 기능과 항목을 참조 이름은 이탤릭체로 강조되었다. 다른 MR 스캐너에 대해 이러한 단계는 제조업체의 지침에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
- 전용 액세스를 정렬작은 동물 MR 스캐너. 빠른 바이오 메드, 뷔르츠부르크,, 적절한 화질, 9.4 테슬라 이상과 맞춤형 고주파 코일 (예를 들어 1 시간 / 19 F 이중 조정 볼륨 RF 코일, 35mm 내경 50 mm 길이의 자기장 강도 시스템에 대한 독일) 권장됩니다.
- MRI 이전에, 마취 및 생리적 모니터링을위한 MRI 스캐너의 설정을 준비합니다. 동물 침대 / 홀더의 호흡 마스크가 isoflurane을 시스템에 연결하고 온도 프로브와 호흡 패드 원격 동물 모니터링 시스템 (eg 모델 1025, SA 인스트루먼츠, 뉴욕, USA)에 연결되어 있는지 확인합니다. 후자는 체온과 호흡과 같은 동물의 중요한 매개 변수를 모니터링하는 역할을한다.
- isoflurane을 시스템에 연결된 마우스 챔버를 사용하여 흡입 마취로 마우스를 마취. 0.2 L 분 -1 0.1 L 분 -1, 각각에 공기와 O 2의 유량을 조정및 마취의 필요한 수준까지 약 2 분 isoflurane을 3 %는 (기화기에서 조정) (응답이 다음 발가락 핀치)에 도달. 최적의 유량은 사용중인 설정에 따라 다를 수 있습니다. 높은 유량 탈수로 이어질 수도 있다는 점에 유의해야합니다. 위에서 언급 한 동물의 상태를주의 깊게 모니터링은 항상 필요합니다.
- 작은 동물 MR 스캐너 (그림 1)의 마우스 침대 / 홀더 경향 마우스를 놓습니다.
- 공기와 O 2 일정에 대한 유량을 유지하면서, 0.8 isoflurane을 기화기 조정 - 1.5 %를 최적의 호흡 패턴에 도달 할 때까지. 50 호흡 - 분당 70 심호흡을 권장합니다.
- 따뜻한 물 (또는 양자 택일로 따뜻한 공기) 순환 시스템을 채택하여 실험 기간 동안 36-37 ° C에서 체온을 유지합니다.
- 측정하는 동안 멸균 눈 바르는 연고와 마우스 수분의 눈을 유지합니다.
- 동물을 확보 한 후영상 홀더 및 모니터링 시스템에 대한 연결에, 1 H / 19 F RF 코일 (동물 스캐너 자석의 등각에 위치하는)의 중심에 홀더를 이동합니다.
- 자동화 된 방법 (예 : 모터 구동 동물 홀더와 결합 위치 레이저를 사용하여)으로 또는 수동으로 홀더를 이동해야하는 거리를 계산하여도, 무릎 자석의 등각 내에 자리 잡고있는 등 마우스의 위치를 설정 자석에 등각에 도달.
- 스캐너의 동물의 정확한 위치를 확인하고 나중에 이미지 슬라이스 구조 (공간 즉 크기, 위치 및 회전)의 계획에 대해 신속하고 낮은 해상도의 이미지를 사용하여 세 가지 표준 방향 (시상, 관상, 축)의 이미지를 정찰 획득 취득 방법 (FLASH 펄스 시퀀스를 사용 예 TriPilot 프로토콜).
- 1 H 공진 주파수에 RF 코일을 조정 (예를 들어,. 400.1 9.4 T에 대한 MHz 이상)와 19 F 공진 주파수 (예 : 9.4 T를위한 376.3 MHz 이상)과 동물 MR 스캐너의 튜닝 모니터를 사용하는 50 옴 코일의 특성 임피던스를 일치합니다. 튜닝 및 매칭 전송 및 신호 수신을위한 최적의 조건을 달성하기 위해 필요합니다.
- RF 진폭 (조정하려면 마우스 라 모어 주파수 (예를 들어, ADJ_SF) 및 참조 이득 RF를 조정 미세 조정에 자기장 (예 : ADJ_SHIM) 시스템 주파수 조정의 동질성을 shimming 등 필요한 자동 시스템 설정을 수행 예를 들어 ADJ_REFG). 이러한 모든 설정은 가능한 한 균질로 관심의 영역에서 정적 변수 마그네틱 필드 (B 0, B 1)을 확인하는 것이 중요합니다.
- 시야 (FOV) 등이 낮은 사지를 모두 AR을 조정 한 후, 세 개의 직교 방향에 따라 정찰 이미지의 두 번째 (위)를 취득골반에서 도보 (LXWXH = 50x25x25 mm)로 표시 마. 이러한 이미지는 최종 3 차원 1 H / 19 F 스캔의 방향을 계획하는 역할을한다.
- TR / TE = 1500 / 53 밀리, FOV = 50x25x25 mm, 행렬 = 400x200x200, RARE 요인 = 16 (. 스캔 시간 약 60 분) : 1 H-스캔 TurboRARE 3D 프로토콜을 설정합니다. 스카우트 이미지의 도움으로 FOV를 조정 (신호등) 스캔을 시작합니다.
- 적어도 1,000 밀리의 TR로 단일 펄스 FID 시퀀스를 넣습니다. 편집 스캔을 열고 19 F.를 핵으로 설정 도구 상자의 편집 방법에서 자동으로 참조 게인을 취소하여 수동 게인 설정을 사용합니다.
- GSP를 (설치 이동)을 사용하여 실시간으로 MR 신호를 표시하는 데이터를 기록하지 않고 측정을 시작합니다. 수집 창 내에서 19 F 스펙트럼 신호가 너무 낮 으면, 편집 방법 및 / 더 평균을 추가하거나시까지 펄스 감쇠기 (TX0 또는 SP0 슬라이더)를 조절gnal 명확하게 볼 수 있습니다. 인수 창에서 0 Hz에서 19 F 스펙트럼 피크 중간에 순서대로 기본 주파수를 조정합니다. 기본 주파수 및 보도 중지를 적용합니다. 마취로 사용 isoflurane을가 배경 신호를 생성 할 수 있습니다. 9.4 테슬라 MRI에서 19 F-함유 입자와 isoflurane을 사이에 화학적 변화는 1,800 Hz의 정도입니다. 여기 대역폭이 19 F-라벨 세포 나 입자 흥미로운 isoflurane을 함께를 피하기 위해 3,600 Hz보다 작은 지 확인합니다. 기본 주파수는 19 F-라벨 세포에 의해 생성 된 신호에서 올바르게 설정해야합니다. 실험이 적합하다고으로 또는 마취의 다른 방법을 사용할 수 있습니다.
- 복제 (중복) 이전 1 H 스캔 TurboRARE 3D 프로토콜입니다. 방법 및 선택 해제 자동 참조 이득 (위)을 편집 이동합니다. 편집 스캔에서 19 F 핵을 설정합니다. 128x64x64 행렬을 변경그리고 적어도 40 (최대 64)까지 RARE-팩터. TR / TE 1000 / 6 밀리와 64 평균의 경우, 검사 시간은 약 70 분입니다. 101 (도구 상자)에 수신기 이득을 설정하고 GOP를 (파이프 라인을 이동)를 사용하여 더 이상 조정하지 않고 스캔을 시작합니다.
- 스캔이 완료되면 MR 스캐너에서 마우스 홀더를 철회. 주의 홀더에서 마우스를 분리합니다. 마우스 생체 분석 (예 : 조직학 또는 분광 아래 참조) 희생하지 않을 경우 완전히 마취에서 회복 될 때까지 직접 MR 측정 한 후, 밀접하게 모니터링 할 수 있습니다. 체온 조절이 마취에 의해 영향 때문에 복구 프로세스 동안 따뜻한 온도 조절 패드에 배치되는 별도의 새장에 마우스를 넣습니다. 마우스가 완전히 마취에서 회복되면, 그 보유 케이지와 동물 방에 그것을 반환합니다.
- 19 F 이미지 1 H 이미지에 오버레이하려면보기 메뉴 O를 사용하여동일한 소프트웨어 (Paravison)에 ption를. 언더 기능은 상관 관계에서 찾을 수 있습니다. , 언더을 저장할 새 이미지를로드하고 표까지 봐에서 새 색상을 정의하여 19 F 계층을 강조 표시합니다. 19 F, 1 H 검사를 구별하기 위해, 19 F 신호가 선택한 색상과 배경 1 H 이미지를 가질 것이라고 같은 그레이 스케일로 유지됩니다 (잘라 테이블을보십시오) 선택한 색상에 대한 임계 값을 변경합니다. 다른 후 처리 프로그램 (예를 들어 ImageJ에) 1 H / 19 F 이미지 오버레이를 만들 수 있습니다.
- 19 F 신호의 생체 정량화가 필요하다면, 이전에 15,16을 설명한대로 간단한 양적 프로토콜을 따르십시오. 간단히, 정량화가 마우스 옆에 FOV 내에서 PFCE - 에멀젼의 알려진 농도 기준 관을 배치하여 수행 할 수 있습니다. MR 이미지, 콴을 획득 한 후관심 영역 (ROI) 분석을 사용하여 19 F 신호의 강도를 tify 그림 2와 같이 체외 보정 곡선을 비교합니다.
5. 림프절 자기 공명 분광법 (MRS)
- 마우스를 희생 한 후, 작은 5 개 mm NMR 튜브에 오금 림프절과 장소를 제거하고 2 % PFA 100 μl를 추가합니다.
- 림프절을 포함하는 NMR 튜브를 들고 최소 5 ㎜의 구멍을 가진 19 F 분광 코일 (토 로이드 코일 등) 설치합니다.
- 코일 내부의 NMR 튜브를 놓고 자석의 등각에 코일을 이동합니다.
- 19 F 공진 주파수 (예를 들어, 9.4 T를위한 376.3 MHz 이상)에 RF 코일을 조정하고 동물 MR 스캐너의 튜닝 모니터를 사용하는 50 옴 코일의 특성 임피던스를 일치합니다. 튜닝 및 매칭 전송 및 신호를위한 최적의 조건을 달성 할 필요가있다수신.
- 0 Shimming 도구 상자 내의 모든 심 매개 변수를 설정하고 Apply (적용)를 누릅니다. 보통은 샘플의 양이 상대적으로 작기 때문에 shimming 방법을 적용 할 필요가 없습니다. 충분한 19 F 신호를 사용할 수있는 경우 자동 방법은 shimming 시스템 주파수 및 상기 한 바와 같이 수신기의 이익을 위해 적용 할 수있다.
- 적어도 1,000 밀리의 TR로 단일 펄스 FID 순서를로드합니다. 스캔을 편집하고 19 F.에 핵을 설정 열기 도구 상자의 편집 방법에서 자동으로 참조 게인을 취소하여 수동 게인 설정을 사용합니다. 1로 평균의 수를 설정합니다.
- GSP를 사용하여 시퀀스를 시작합니다. 수집 창 내에서 19 F 스펙트럼 신호가 너무 낮 으면, 편집 방법 및 / 더 평균을 추가하거나 신호까지 펄스 감쇠기 (TX0 또는 SP0 슬라이더)가 명확하게 볼 수 조절. 기본 주파수를 조정하므로 19 F의 SPEctral 최대 0 Hz에서 수집 창의 중앙에 있고 기본 주파수를 적용합니다. 90 ° 여기에 도달하는 신호를 최대화하기 위해 다시 펄스 감쇠기를 조정합니다. 신호가 최대 눌러 정지에있을 때.
- 64 256 사이의 편집 방법 (또는 그 이상 필요한 경우, 신호에 따라)의 평균을 설정하고 GOP를 사용하여 인수를 시작합니다. 감지 된 신호는 평균의 수에 비례 상관 관계. 정량화하는 동안 감지 된 신호가 하나의 평균으로 정규화해야한다는 점에 유의하십시오. 또한, 알려진 농도 또는 교정 곡선의 보정 표준은 표준화 된 19 F 신호 (그림 2) 세포의 수를 계산하는 것이 필요하다.
- 검사가 완료되면, 샘플을 제거 다음 샘플을 배치 단계 5.3를 진행합니다.
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Representative Results
피내 응용 프로그램에 다음과 같은 여덟에 이십일시간는 19 F-라벨 돌기 세포 (DC)의 배수 오금 림프절로 마이그레이션 할 수 있습니다. 배수 politeal 림프절로 림프 덕트를 통해 DC의 움직임은 19 F DC의 이미지 (그림 2A)와 1 H 해부 영상을 중첩에 의해 평가 될 수있다. 우리는 이전에 생체 내에서 이러한 세포의 이동뿐만 아니라, 흡수 효율 11 등 DC immunobiology에 19 F-입자 크기의 영향에보고했다. 림프절에 DC 마이그레이션의 범위를 정량화하기 위해, 우리는 림프절을 추출하고 19 F MRS (그림 2B) 수행합니다. 우리는 우리가 추론 할 수있는 동일한 PFCE 입자 (교정 곡선 그림 2C)으로 표시 DC의 서로 다른 숫자에서 얻은 19 F 신호와 각 림프절에서 얻은 19 F 신호를 비교할 때배수 림프절에 도달 19 F-라벨 DC의 번호입니다. 그림의 2A 및 2B에 표시되는 대표적인 실험에서, 우리는 항원에로드되지 않은 7.5 × 10 4 DC가 오른쪽 림프절에 도달하면서 3.6 × 10 5 항원이 장착 된 DC는 오른쪽 림프절에 도달하는 추론 할 수 있습니다.
그림 1. 작은 동물 MR 스캐너의 마우스 홀더에 마우스의 위치입니다.
그림 2. 19 F MRS를 사용하여 생체 내에서 19 F-라벨 DC 마이그레이션의 정량. (A) DC는 1 ㎜ 560 nm의 PFCE particl으로 표시 하였다 ES와 (오른쪽) 또는 (왼쪽) 항원이없는로드 뒷다리에 intracutaneously 관리. 전체 닭 알부민은 (OVA) 항원으로 사용 하였다, OVA가 19 F 입자와 함께 DC와 함께 배양 하였다. 림프절 및 림프 덕트는 1 H 해부 MR 이미지 (그레이 스케일)에 표시됩니다 반면, 수지상 세포, 19 F MR 신호 (적색)로 표시됩니다. 이미지는 공진기 19 F / 1 H 이중 조정 볼륨 새장에 인수되었다. (B) 마우스에서 림프절이 추출 NMR 튜브에 배치 된에 표시. 19 F 신호는 19 F MRS (프로토콜 텍스트 참조) 진폭 획득 자유 유도 감쇄 (FID)의 고속 푸리에 변환 (FFT)을 수행하여 계산에 의해 측정 하였다. (C) 24 시간의 기간 동안, 서로 다른 DC의 양이 1 ㎜ 560 nm의 PFCE 입자로 표시 하였다 19 F 신호는 B.에서와 같이 19 F의 MRS로 측정되었다EF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg"대상 = "_blank"> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
19 F / 1 H MRI는 림프 노드에 DC의 움직임에 따라 고용이 방법은 생체 내에서 면역 세포의 이동 패턴을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 수지상 세포는 빠르게 단단히 특정 기판에 17 준수하지 않고 입체 구조를 통해 기동 할 수있는 면역 세포를 마이그레이션 훌륭한 예입니다. 기술 기술의 낮은 공간 해상도 (μm의 범위)이 기술로, 다중 광자 현미경으로 얻을 수있는 높은 해상도 (nm의 범위)와 비교할 수 없습니다 비록 생체에 이상 세포 이동의 특성을 연구하기 위해 여전히 가능합니다 시간의 긴 기간. 또한, 현미경은 살아있는 유기체 내에서 이미지 큰 지역은 현재 적합하고, 제한된 깊이 침투보기의 제한된 필드가 있습니다.
기술의 noninvasiveness 때문에, 그것은 몬 가능합니다조사 후에 마우스를 희생하지 않고 하세 몇 일 동안 면역 세포의 이동을. 기술의 또 다른 장점은 해부학 1 H 검사로 마이그레이션 세포를 캡처 19 F 이미지, 따라서 살아있는 유기체 내의 세포의 정확한 현지화를 허용 오버레이 할 수있는 가능성이다. 이 기술은 우리가 DC 마이그레이션을 기본 분자 메커니즘을 연구 할 수있게됩니다. 체외 마이그레이션 분석의 전형적인 달리,이 메소드는 생리적 3D 환경에서 세포 이동의 연구를 할 수 있습니다.
MRS와 MRI의 19 F의 잠재적 인 응용 프로그램은 긴 7,18을 인정 받고있다. 높은 회전 자기 비율, 높은 스핀과 자연 동위 원소 풍부 19 F MR 영상 7을위한 이상적인 후보합니다. 또한, 19 F, 1 H (자신의 NMR 속성에 관한) 사이의 유사성은 t 사이에 의미있는 오버레이의 전제 조건그는 라벨 세포의 MRI 19 F와 해부학 상반기 MRI. 실제로 다른 1 H / X 핵 자기 공명 영상을 통해 MRI 1 H / 19 F의 장점 중 하나는 공진기 같은 RF가 19 F, 1 H 핵에 모두 사용할 수 있다는 것입니다. 19 F / 1 H MRI, 볼륨 공진기에 사용되는 대부분의 어플리케이션에서 19 F, 1 H. 모두 조정 할 수있는 고용 두 채널에 대한 거의 동일한 B 1 필드, 19 F 채널에 1 H 채널 (즉, 측정하기가 쉽습니다)의 전원 설정의 전송으로 인해 그러므로이 가능합니다.
모든 크기의 입자 (초소형에서 대형 마이크로 크기의 입자)와 세포를 라벨링 할 때 고려해야 할 하나의 중요한 요인은 생물학적 조작과 독성의 가능성이 있습니다. 우리는 최근 레이블 입자의 크기를 증가함으로써, 우리는 DC 11의 성숙 상태를 촉진 할 수있는 것으로 나타났습니다. 가능우리의 연구 결과에 대한 설명은 오히려 endocytosis를 19보다 식균 작용에 의해 촬영되는 500 nm의보다 큰 입자 우세이며, 전 섭취 메커니즘은 DC의 본질을 정의. 다른 물리적 특성 (예를 들어 입자 형상 및 표면 토폴로지)는 레이블 세포의 생물학적 기능을 변경할 수 있으며, 또한주의 20 고려되어야한다. 입자 DC의 라벨이 필요 주어진 실험 장치를 위해, 그것은 따라서 매우 일반적인 세포 생물학의 분석은 이러한 세포의 생물학적 특성에 대한 입자의 영향을 결정 / 제외하는 실험을 병렬로 수행하는 것이 좋습니다. 여러 분석은 문제의 실험 연구에 따라 수행 할 수 있습니다. DC의 성숙에 영향을 제외하려면 세포 표면 마커 (예를 들어, CD80, CD86) FACS에 의한 표현의 측정이 권장됩니다. 항원의 이해와 표현, 식균 작용 exper에는에 영향을 제외하려면iments 각각 T 세포 프라이밍 실험이 권장됩니다. 이전 실험의 경우, 케모카인의 발현 (CC)가 수용체 (예 : CCR7)와 체외 마이그레이션 분석에 권장됩니다.
19 F / 1 H MRI, 특히 임상 목적으로 세포의 이동을 연구 약속을 보유하고 있지만, 한계의 숫자가 현재 있습니다. 이들은 (i) 각각의 세포의 직접적인 시각화를 배제 공간 해상도 (II) 부족 19 F 감도 (한 ROI 내에서 여러 개의 10 5 세포의 검출 한계), (ⅲ)이 결과로 스캔 지속 시간을 증가 보상하기 위해 평균 증가를 포함 시장에서 19 F RF 공진기와 같은 isofluorane 및 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 내 MR 하드웨어 구성 요소 (다른 불소 함유 성분에 의해 (V) 가능 원하지 않는 배경 19 F 신호의 이전 제한에 대한, (IV) 제한된 범위예를 들어, 커패시터 및 연결 케이블).
따로 같은 자기장 강도 및 그라데이션 강도 등의 요인에서, 공간 해상도의 수준을 지시 한 주요 결정 공진기가 21를 사용하여 무선 주파수의 감도 (RF)입니다. MRI 해상도는 밀접 신호 대 잡음비 (SNR) 21에 관련된 공간적 해상도를 증폭하는 복셀 크기를 줄이는에, SNR의 손실이 예상 할 수있다.입니다 신호 감도를 손상시키지 않고 공간 해상도를 증가하는 방법 중 하나는 열 잡음 22을 줄임으로써 SNR을 향상 저온 냉각 코일을 채용하는 것입니다. 극저온 시스템을 사용 상반기 헤드 코일의 도움으로, 우리는 최근의 평면 해상도 (35x35) μm의 2 23을 사용한 후 실험자가 면역 뇌척수염의 세포 침투를 시각화 할 수 있습니다. 19 F / 1이 극저온 냉각 기술의 응용 프로그램이 H MRI는 이익이 될 것이다PR하는 세포 신호 감지 및 해결과 관련된 MRI의 몇 가지 한계를 극복하기 위해.
MRI에 의한 세포의 생체 내 추적에 대한 하나의 중요한 문제는 살아있는 유기체 내의 특정 위치에서 이러한 세포의 정량화이다. 이를 위해 19 F MRS를 (5.1-5.9 참조)을 수행 할 수 있습니다. 19 F-라벨 DC의 서로 다른 숫자의 19 F MRS 측정에서 얻은 검량선을 채용함으로써, 림프절에 도달 세포의 수를 추론 할 수 있습니다. 림프절의 19 F MRS 측정은 19 F MRS DC 보정 곡선을 비교할 수 있습니다. 또한, 순수 PFCE와 DC 셀 보정 곡선에서 MRS 데이터를 비교하여, 우리는 라벨에 따라 세포 당 약 10 13 19 F 회전을 감지하는 것이 가능하다는 것을 추론 할 수있다. MR의 원칙에 따라, 낮은 검출 한계는 복셀 당 24 10 18 스핀합니다. 따라서, 우리는 우리가 9.4 T MRI를 사용하여 복셀 당 10 10 DC의 최소 수를 감지 할 수 있다고 가정 할 수 있습니다.
요약하면, 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 병태 생리 학적 과정에서 세포의 이동을 연구 생체 내 연구에 대한 유용합니다. 1 H 해부 영상에 표시된 세포에서 19 F 이미지를 오버레이하는 기능은 마이그레이션 세포의 최적의 매우 선택적 추적을 촉진; 기술의 noninvasiveness 동물의 큰 숫자를 희생 필요없이 종단 연구를 가능하게하고 19 F MRS을 제공 생체 내에서 특정 해부학 적 영역에 지역화 세포의 수를 추정 할 수있는 기회.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 베를린에서 분자 의학 및 샤리 테 (Charite) 의료 교수진 센터 Delbrück 실험 및 임상 연구 센터, 최대의 협력에서 SW에 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG WA 2804)와 SW를 대학에 교부금에 의해 투자되었다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시하는 결정 또는 원고의 준비에있는 아무 역할도 없었다. 우리는 우리의 실험실에서 인턴 기간 동안 기술 지원 로버트 Westphal 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA | ||
References
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