Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции Published: March 20, 2013 doi: 10.3791/50251
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2, 1,2, 1,2
1Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Отслеживание ячеек с помощью МРТ получила замечательное внимание в последние годы. Этот протокол описывает маркировки дендритных клеток с фтором (

Abstract

Непрерывного усовершенствования своей неинвазивный методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ) значительно улучшили наши способности к обучению физиологических или патологических процессов в живых организмах. МРТ также оказывается, ценный инструмент для захвата трансплантированных клеток в живом организме. Начальное мечения клеток стратегии МРТ использовали контрастные агенты, которые влияют на релаксацию MR раз (T1, T2, T2 *) и приводят к повышению (T1) или истощение (Т2 *) сигнала, где меченые клетки присутствуют. Т2 * усиление агентов, таких как сверхмалых оксид железа вещества (USPIO) были использованы для изучения миграции клеток и некоторые из них также был одобрен FDA для клинического применения. Недостатком Т2 * агентов является трудность отличить сигнал исчезновения созданный меченых клеток из других артефактов, таких как образование тромбов, микро кровотечений или пузырьков воздуха. В этой статье мы опишем для разработки новой технологии для отслеживания клеток в живом, чтооснована на маркировке клеток с фтором (19 F) частиц, богатых. Эти частицы получают путем эмульгирования перфторуглеродов (ПФУ) соединения и затем используются для обозначения клеток, которые впоследствии могут быть отображены на 19 F-ЯМР. Важным преимуществом ПФУ для мобильного отслеживания в естественных условиях включают в себя (я) отсутствие углерод-связанный 19 F в живом организме, который затем выдает фон изображения без провели полный анализ selectivityand (II) возможность количественной оценки сигнала сотового на 19 F МР-спектроскопии .

Introduction

Отслеживание клеток в живом является ключевым аспектом в нескольких областях биомедицины. Для этого неинвазивных методов визуализации, которые могут выборочно локализации клеток в течение периода времени, являются чрезвычайно ценными. До разработки трехмерной магнитно-резонансная томография (МРТ), отслеживание иммунной миграции клеток было ограничено микроскопического анализа или биопсии ткани. Сотовые отслеживания с помощью МРТ приобрел огромное внимание в последние несколько лет, не только для изучения иммунной иммунологов поведение клетки в живом организме, но и для клинических и стволовые клетки исследователи. В середине 90-х годов, первые исследования наночастиц оксида железа 1 инициировали каскад событий для отслеживания клетки с помощью МРТ. Частицы оксида железа сократить время MR релаксации (T2 *) из меченых клеток и тем самым вызвать сигнал истощения в МРТ. Частицы оксида железа были использованы для обозначения макрофагов 2, р олигодендроцитовrogenitors 3 и многие другие типы клеток. Некоторые из этих частиц, также были клинически утвержденный FDA для маркировки сотовой вакцин у пациентов с меланомой 4. Поскольку в естественных условиях или бывших маркировки естественных клеток с частицами оксида железа полагается на укорочение T2 сигнал * а последняя может быть также вызвано в естественных условиях восприимчивость связанных T2 * эффекты, такие как микро кровоточит, железорудных месторождений или пузырьков воздуха, это может быть трудно определить меченых клеток в естественных условиях от других фоне T2 * вымирания сигнала 5.

В этой статье мы описываем технику для отслеживания дендритные клетки (ДК) в естественных условиях с использованием 19 F / H 1 магнитно-резонансной томографии (МРТ). Эта технология отслеживания клетка была введена только в 2005 году 6, через несколько лет после первых известных приложений для 19 F в МРТ было зарегистрировано 7. Одним из важных ADVAntage из 19 F над оксидом железа маркировки ячейки частица низкой биологической возникновения 19 F в ткани, что делает возможным отслеживание клетки очень выборочно в основном с фоном изображения без. Кроме того, можно наложить 19 F МР сигнал от трансплантированных меченых клеток с анатомическими изображениями, полученными от обычных 1H ЯМР. 19 F / 1 H ЯМР поэтому значительно значение для исследований по изучению миграции клеток в живом организме. Клетки изучали с помощью этого метода помечены 19 F-богатых частиц. Синтетически полученные из перфторуглеродов (ПФУ), состоящие в основном из углерода и атомы фтора, обычно используемые для получения частиц. Эти соединения являются нерастворимыми в воде и должны быть эмульгировали до применения в пробирке или в естественных условиях. Обычный размер частиц ПФУ, которые были использованы другими группами в естественных условиях 19 F-ЯМР экспериментов отслеживаниядиапазонах от 100 нм до 245 нм 6,8-10. Мы, однако, показали, что эффективность в маркировке дендритных клеток с перфтор-15-краун-5-эфиром (PFCE) частиц возрастает с увеличением размера частиц (> 560 нм) 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные процедуры должны быть одобрены местными Институциональный комитет защиты животных перед выполнением. В процессе измерений MR адекватный уровень анестезии и мониторинга физиологических (температура тела, частота дыхания) являются необходимыми требованиями.

1. Генерация костного мозга мышей дендритные клетки

  1. Извлечение клетки костного мозга от мышей C57BL / 6, как описано выше 12. Этот протокол восходит к 1992 13 и первоначально был описан группой Ральф М. Штейнман (1943-2011), первооткрыватель дендритных клеток 14.
  2. Короче говоря, извлечь большеберцовой и малоберцовой костей вскоре после жертвуя мышей. Работая под ламинарный шкаф (для предотвращения микробного загрязнения), промойте костного мозга в небольшую чашку Петри с Воша (5% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% HEPES в RPMI) 12.
  3. Передача клеточной суспензии через ячейку страинерциальной (100 мкм размер ячеек, нейлон) в стерильные 50-мл центрифужные пробирки, чтобы удалить кости и остатки ткани. После нескольких этапов стирки и 12 лизис шаг, считают жизнеспособных клеток с трипановым синим и гемоцитометра.
  4. Ресуспендируют клеток костного мозга при концентрации 400000 клеток мл-1 в культуральной среды (RPMI с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% HEPES и 1% L-глутамина), содержащей 75 нг мл-1 у мышей гранулоцитов макрофагальный колониестимулирующий фактор (MGM-CSF), полученные из супернатантов 293FT клетках НЕК трансфицированных мышь GM-CSF плазмиды. Передача 10 мл клеточной суспензии (4 х 10 6 клеток) в чашках Петри (100 мм х 20 мм) и инкубировать в СО 2-инкубаторе (37 ° C, 5% СО 2). На 3 день пополнения старой среды в 10 мл свежей среды (содержание конечной концентрации MGM-CSF при 75 нг мл-1). На 6 день удаления 10 мл старой среды и наполняйте10 мл свежей среды (MGM-CSF конечная концентрация = 75 нг мл-1). На 8 день, удалите 10 мл старой среды и пополнять с 10 мл свежей среды (MGM-CSF = конечной концентрации 150 нг мл -1).
  5. На 10 день, зрелые дифференцированные постоянного тока с 1 мкг мл-1 липополисахаридом (ЛПС) в течение 24 часов.

2. Маркировка дендритных клеток с 19 F-частиц, богатых

  1. В шаге 24 созревание час (1.5), этикетка постоянного тока с помощью 1 мМ богатых фтором перфтор-15-краун-5-эфиром (PFCE) частиц (500-560 нм) и в течение 24 часов. Подготовьте большой фтор-меченых частиц путем эмульгировани PFCE в Pluronic F-68 (общий объем 2,5 мл) с использованием клеточного нарушения титана сонотрода и использования программы непрерывного импульса (амплитуда 100%, мощность = 250 Вт) в течение 60 сек.
  2. После выше шаги инкубации собирают зрелыми и фтора меченных постоянного тока с помощью мобильного культуре ткани скребок, передача в 50-мл центрифужную пробирку и центрифугировалипри 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Смыть все оставшиеся частицы и мертвые клетки, оставьте собранных клеток придерживаться на поли-L-лизин блюд. Для подготовки к этому шагу, пальто чашки Петри с поли-L-лизин (1 мг мл-1) при 37 ° С в течение 1 ч, затем смыть несвязанного поли-L-лизина с PBS.
  4. Инкубируют выше собранных клеток на поли-L-лизин-планшеты, покрытые в бессывороточной среде и позволяют клеткам прилипать (1 час при 37 ° C, 5% CO 2).
  5. Смыть среды, чтобы отменить неприкрепленных клеток, оставшихся частиц и мертвых клеток и мыть три раза подогретого (37 ° С) PBS.
  6. Урожай прилипшие клетки трипсином-EDTA лечения (0,25% трипсин-ЭДТА, 3 мин инкубации при 37 ° С).
  7. После еще одной стадии центрифугирования стирки, ресуспендируют необходимое количество зрелых ДК в бессывороточной стерильного PBS.
  8. Для определения того, клетки были помечены успешно, рекомендуется проверить physicocheмические характеристики клеток с использованием проточной цитометрии (FACS). Разброс бокового (SSC) должно выявить более высокий уровень детализации в этих клетках, как описано выше 11. Следует также иметь в виду, что фибробласты могут загрязнять DC культур, а также может занять до 19 частиц F параллельно. Таким образом, чистота постоянного тока должны быть оценены (путем измерения процента CD11c + CD11b + клеток с использованием FACS) до в естественных условиях применения.

3. In Vivo Применение 19 F-меченных дендритных клеток

  1. Администрирование постоянного тока (10 6 - 10 7) в объеме 50 - 100 мкл внутрикожно в задних конечностей мыши C57BL / 6, поместив мышь в держатель и осторожно вставки 26 ½ G иглы в верхние слои кожи перед применением (использованием 0,5 мл шприцы с туберкулином постоянно подключенных игл для минимизации мертвого объема). Для обеспечениян соответствующее приложение внутрикожный, важно, что вставленный часть иглы быть частично видны под кожей. Если игла больше не видна, игла была вставлена ​​слишком глубоко в слои кожи. Для неподготовленного человека, внутрикожных приложение может быть выполнена под наркозом.
  2. Изображение на конечностях в естественных фтора (F 19) / протон (H 1) МРТ (см. следующий раздел) 21 часа после инъекции.

4. In Vivo 19 F / 1Н магнитно-резонансная томография

Подробные инструкции по настройке проводить МРТ относятся к сканеру Bruker MR использованием управляющего программного обеспечения Paravison (версия 5.1). Имена ссылкой на конкретного производителя функции и пункты были выделены курсивом. Для других сканеров MR эти шаги могут, должны быть скорректированы в соответствии с указаниями производителя.

  1. Организовать доступ к выделеннойМаленькое животное МР-томографа. Для надлежащего качества изображения, система с напряженностью магнитного поля 9,4 Тл или более и с учетом радиочастотную катушку (например, 1 H / 19 F двойного перестраиваемый объем радиочастотную катушку, 35 мм внутренний диаметр, длина 50 мм; Быстрое Biomed, Вюрцбурга Германия) рекомендуются.
  2. До МРТ, подготовить установку томографа для анестезии и мониторинга физиологических. Убедитесь, что дыхательную маску из животных кровать / держатель соединен с изофлуран системы, и что датчик температуры и дыхание площадки соединены с удаленной системой мониторинга животного (например, модель 1025, SA Instruments, New York, USA). Последний служит для контроля жизненно важных параметров животных, таких как температура тела и дыхания.
  3. Обезболить мышей путем ингаляционного наркоза с помощью мыши камеру, соединенную с изофлуран системы. Отрегулируйте расход воздуха и O 2 на 0,2 л мин -1 и 0,1 л · мин -1 соответственнои 3% изофлуран (в диапазоне от испарителя) в течение приблизительно 2 мин до требуемого уровня анестезии достигается (нет ответа следующие пинч палец). Оптимальные скорости потока может изменяться в зависимости от настройки используются. Знайте, что высокие скорости потока может привести к обезвоживанию. Тщательный контроль за условиями животных требуется во все времена, как упоминалось выше.
  4. Поместите мышь ничком на кровать мышь / обойма маленького животного МР-томографа (рис. 1).
  5. Сохраняя скорость потока для воздуха и O 2 постоянных, отрегулируйте изофлурана испарителе до 0,8 - 1,5% до оптимальной структуру дыхания не будет достигнута. Частота дыхания 50 - 70 вдохов в мин рекомендуется.
  6. Хранить при температуре тела 36-37 ° С в течение эксперимента с использованием теплой воде (или в качестве альтернативы теплого воздуха) системы циркуляции.
  7. Хранить глазах мышь влажной стерильной мази смазочных глаза во время измерения.
  8. Заполучив животныхна держателе изображений и соединения с системой мониторинга, перемещать держатель к центру 1 H / 19 F радиочастотную катушку (которая расположена на изоцентром магнита сканер животное).
  9. Установите положение мыши так, что колено лежит в пределах изоцентром магнит, либо с автоматизированным способом (например, с использованием лазерного позиционирования в сочетании с моторным приводом животного держателя), либо вручную вычисления расстояния держатель должен быть перемещен в магнит, чтобы достичь изоцентром.
  10. Для подтверждения правильного положения животного в сканер, а затем планирование геометрия изображения ломтик (т.е. размер, положение и поворот в пространстве), приобретать разведать изображения в трех стандартных ориентаций (осевые, корональной, сагиттальной) с помощью быстрой и низкое разрешение изображения приобретение методами (например TriPilot протокол, который использует последовательность импульсов FLASH).
  11. Настройтесь РФ катушки к частоте 1 H резонанса (например,. 400,1 МГц при 9,4 Т) и 19 F резонансной частоты (например, 376,3 МГц при 9,4 Т) и соответствует характеристическому импедансу обмотки 50 Ом помощью настройки монитора сканер животных MR. Настройки и согласования необходимы для достижения оптимальных условий для передачи и приема сигнала.
  12. Выполнить необходимые автоматические настройки системы, включая прокладок для тонкой настройки однородности магнитного поля (например, ADJ_SHIM), корректировки системы частоты настроиться РФ в Lamor Частота мыши (например ADJ_SF) и ссылки для регулировки усиления амплитуды ВЧ ( например ADJ_REFG). Все эти параметры важны, чтобы сделать статические и переменные магнитные поля (B 0, B 1) в области, представляющей интерес как можно более однородными.
  13. Приобрести второй набор разведчика изображения (см. выше) вдоль трех ортогональных ориентаций, после регулировки поля зрения (FOV) такой, что обеих нижних конечностей ARэлектронной видна из таза до ног (ДхШхВ = 50x25x25 мм). Эти изображения служат для планирования ориентаций окончательное 3D 1 H / F 19 сканирований.
  14. Настройка протокола TurboRARE 3D для 1 H-сканирование: TR / TE = 1500/53 мс, угол обзора = 50x25x25 мм, Matrix = 400x200x200, редкие Фактор = 16 (. Время сканирования около 60 мин). Отрегулируйте угол обзора с помощью разведчика изображения, запускать сканирование (светофор).
  15. Загрузка одного импульса FID-последовательность с TR не менее 1000 мс. В параметре Сканирование и установить ядро до 19 F. Используйте ручной настройки усиления, сняв автоматическая регулировка усиления ссылки в метод Редактировать на панели инструментов.
  16. Начало измерений без записи данных для отображения сигнала MR в режиме реального времени с помощью GSP (перейти настройке). Если 19 F спектрального сигнала в пределах окна регистрации является слишком низкой, добавить больше средние Редактировать Метод и / или модулировать импульса аттенюатор (TX0 или SP0 ползунок), пока сигнал четко виден. Отрегулируйте базовую частоту для того, чтобы центр 19 F спектральный пик на частоте 0 Гц в приобретении окна. Применение основных частот и нажмите Стоп. Следует отметить, что изофлуран использовать в качестве анестезии может генерировать фоновый сигнал. При 9,4 Тесла МРТ химического сдвига между 19 F частиц, содержащих и изофлуран примерно 1800 Гц. Убедитесь, что возбуждение пропускная способность меньше, чем 3600 Гц, чтобы избежать возбуждения изофлурана вместе с 19 F-меченых клеток или частиц. Основная частота должна быть правильно установлена ​​на сигнал, генерируемый 19 F-меченых клеток. Кроме того, другой способ анестезии можно использовать в качестве экспериментатора усмотрению.
  17. Клон (дубликат) протокол TurboRARE 3D от предыдущего 1Н сканирования. Перейдите в режим Метод и снимите автоматическая регулировка усиления ссылку (как выше). Установить 19 F от ядра Редактировать Scan. Изменение матрицы 128x64x64и редкие-фактор не менее 40 (до 64). Для TR / TE 1000/6 мс и 64 средних, время сканирования составляет приблизительно 70 мин. Установить коэффициент усиления приемника до 101 (Toolbox) и начать сканирование без поправок, использование GOP (перейти трубопровод).
  18. Когда сканирование закончено убрать мышь держатель из МР-томографа. Отсоедините мышь тщательно из держателя. Если мышь не приносится в жертву для бывших естественных условиях анализа (например, гистологии или спектроскопии, см. ниже) непосредственно после измерений MR, внимательно следить, пока он не полностью оправилась от наркоза. Регулирование температуры тела зависит от анестезии, так что во время процесса восстановления, положить мышь в отдельной клетке, который помещен на теплую температуру регулируемой площадке. Как только мышь полностью оправилась от наркоза, вернуть его в клетку и холдинга к животному комнате.
  19. Чтобы наложить 19 F изображений 1 H изображений, используйте меню Option на то же программное обеспечение (Paravison). Подложка функции можно найти в разделе корреляцию. Сохранить подложки, загрузить новый образ и подчеркнуть 19 F слоя, определив новый цвет из справочной таблицы. Чтобы провести различие между 19 F и H 1 сканирования, изменять порог для выбранного цвета (нарезать Look Up Table) такой, что 19 F сигнал будет иметь выбранный цвет фона и 1 H изображение останется в оттенках серого. Другие постобработки программы (например ImageJ) можно использовать для создания 1 H / 19 F накладками изображения.
  20. Если в естественных условиях количественного определения 19 F сигнала необходимо выполнить простую количественную протокола, как описано выше 15,16. Вкратце, количественное может быть сделано путем размещения опорного трубки с известной концентрацией PFCE-эмульсии в поле зрения рядом с мышью. После приобретения МРТ, Quanтифы интенсивностей 19 F сигналов с использованием области интересов (ROI) анализа и сравнения с калибровочной кривой в пробирке, как показано на рисунке 2.

5. Лимфатических узлов магнитно-резонансной спектроскопии (MRS)

  1. После жертвуя мыши необходимо снять подколенных лимфатических узлах и место в небольшой трубки 5 мм ЯМР и добавить 100 мкл 2% PFA.
  2. Установка 19 F-спектроскопии катушки (например тороидальной катушки), который имеет отверстие, по меньшей мере, 5 мм для удерживания трубки ЯМР содержащий лимфатических узлов.
  3. Поместите ЯМР трубки внутри катушки и перемещения катушки в изоцентром магнита.
  4. Настройтесь РФ катушки к 19 F резонансной частоты (например, 376,3 МГц для 9,4 Т) и соответствуют волновым сопротивлением катушки 50 Ом помощью настройки монитора сканера животных MR. Настройки и согласования необходимы для достижения оптимальных условий для передачи и сигналприема.
  5. Установить все параметры, в рамках прокладки прокладок Toolbox на 0 и нажмите применить. Обычно нет необходимости применять прокладок методов, так как объем образца относительно невелико. При достаточном 19 F сигнал доступен, автоматизированные способы могут быть применены для прокладок, частота системы и усиления приемника, как описано выше.
  6. Загрузка одного импульса FID последовательность с TR не менее 1000 мс. В параметре Сканирование и установить ядро до 19 F. Используйте ручной настройки усиления, сняв автоматическая регулировка усиления ссылки в метод Редактировать на панели инструментов. Установить количество в среднем составляет 1.
  7. Начало последовательности с использованием ВСП. Если 19 F спектрального сигнала в пределах окна регистрации является слишком низкой, добавить больше средние Редактировать Метод и / или модулировать импульса аттенюатор (TX0 или SP0 ползунок), пока сигнал четко виден. Отрегулируйте базовую частоту таким образом, чтобы 19 F SPEctral пик в центре окна регистрации при 0 Гц и применять основные частоты. Регулировка импульса аттенюатор снова максимального сигнала, чтобы достичь 90 ° возбуждения. Когда сигнал при максимальной Stop прессы.
  8. Установите средние Редактировать метод от 64 до 256 (или больше, если необходимо, в зависимости от сигнала) и запустите сканирование с GOP. Обнаруженного сигнала линейно коррелирует с числом средних. Во время количественного иметь в виду, что обнаруженный сигнал должен быть нормированы на одну среднюю. Кроме того, калибровка стандарта известной концентрации или калибровочной кривой необходимо рассчитать количество клеток из нормализованного сигнала 19 F (фиг. 2).
  9. После окончания сканирования, удаления образца поместить следующий образца и перейдите к шагу 5.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Восемнадцати до двадцати одного часа после внутрикожных приложений, 19 F-меченных дендритные клетки (ДК) мигрируют в дренирующих подколенных лимфатических узлов. Движение постоянного тока через лимфатические протоки в сливную politeal лимфатических узлов может быть оценена путем наложения 1Н анатомические изображения с 19 F изображений тока (2А). Ранее мы уже сообщали о миграции этих клеток в живом организме, а также влияние 19 F-размера частиц на DC иммунобиологии, в том числе эффективность поглощения 11. Для того, чтобы количественно определить степень миграции постоянного тока в лимфатические узлы, мы извлекаем лимфоузлов и выполняют 19 F MRS (рис. 2В). Если сравнить 19 сигнал F, полученные из каждого лимфатического узла с 19 F сигнал, полученный из различного числа DC обозначены одинаковыми частицами PFCE (калибровочной кривой, 2С), можно вывестиколичестве 19 F-меченных постоянного тока, которые достигают лимфатических узлов. В репрезентативного эксперимента показаны на рисунках 2A и 2B, мы можем сделать вывод, что 3,6 х 10 5 антиген-загруженных DC достигли правого лимфатического узла в то время как 7,5 х 10 4 DC, которые не были загружены с антигеном достигли правого лимфатического узла.

Рисунок 1
Рисунок 1. Положение мыши на мышь обойма маленького животного сканер MR.

Рисунок 2
Рисунок 2. Количественная оценка 19 F-меченных DC миграции в естественных условиях использования 19 F MRS. (A) DC метили 1 мм 560 нм PFCE particl ES, нагруженные (справа) или без (слева) и антиген вводят внутрикожно в заднюю конечность. Всего куриного овальбумина (OVA) использовали в качестве антигена; OVA инкубировали с DC вместе с частицами 19 F. Дендритные клетки показаны как 19 F МР сигнала (красный), в то время как лимфатические узлы и лимфатические протоки показаны в 1 H анатомического МР изображения (оттенки серого). Изображения были получены с 19 F / H 1 двойного перестраиваемый объем птичьей клетки резонатора. (B) Лимфатические узлы из мышиных показано на извлекали и помещали в пробирку ЯМР. 19 F сигнал измеряли 19 F MRS (см. Протокол Текст) и амплитуда была рассчитана путем выполнения быстрого преобразования Фурье (FFT) приобретенного свободной индукции (FID). (C) В течение 24 ч, различные объемов постоянного метил 1 мМ 560 нм частиц PFCE и 19 F сигнал измеряли 19 MRS F, как и в B.EF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот способ применения F 19/1 H МРТ, чтобы следить за движением постоянного тока в лимфатических узлов дает возможность для изучения миграции иммунных клеток в живом организме. Дендритные клетки являются прекрасными примерами быстро мигрируют иммунные клетки, которые способны маневрировать в трехмерные структуры без плотного придерживаясь специфических субстратов 17. Несмотря на низкое пространственное разрешение (мкм) из описанной методики не сравнима с высоким разрешением (нм), которые могут быть достигнуты при многофотонной микроскопии с помощью этой техники все еще ​​возможно, чтобы исследовать природу миграции клеток в естественных условиях и в течение длительного периода времени. Кроме того, микроскопия имеет ограниченную глубину проникновения и ограниченным полем зрения, что делает его в настоящее время непригодны для визуализации больших площадей в живом организме.

В связи с неинвазивность техники, можно ПНitor миграцию иммунных клеток в течение нескольких дней без ущерба для мыши после расследования. Другим преимуществом способа является возможность накладывать 19 F изображений, которые захватывают мигрирующих клеток с анатомическими 1 сканирований H, тем самым позволяя точной локализации клеток в живом организме. Данная техника позволит нам изучить молекулярные механизмы, лежащие DC миграции. В отличие от обычных анализов в пробирке миграции, этот метод позволяет изучать миграцию клеток в физиологической среде 3D.

Потенциальное применение 19 F в MRS и МРТ уже давно признаны 7,18. Высокая Гиромагнитное отношение, высокоскоростная и природного изотопа составляет 19 F идеальным кандидатом для МРТ 7. Кроме того, сходство между 19 F и H 1 (в отношении их свойств ЯМР) является необходимым условием для полноценного наложения между ТОн анатомические 1H МРТ с 19 F МРТ меченых клеток. Действительно одно преимущество 1 H / 19 F МРТ по сравнению с другими 1Н / X ядер МРТ является то, что тот же ВЧ резонатор может быть использован как для 19 F и 1 Н-ядер. В большинстве приложений, используемых для 19 F / 1 H ЯМР, объемного резонатора используется, который может быть настроен на обоих 19 F и 1 H. В связи с почти идентично B 1 поле для обоих каналов передачи параметров питания от 1 H канал (который легче измерить) до 19 F канал Поэтому возможно.

Одним из важных факторов, которые необходимо учитывать при маркировке клеток с частицами любого размера (от ультра-маленького до большого микро частиц) потенциал биологических манипуляций и токсичности. Недавно мы показали, что при увеличении размера частиц маркировки, можно ускоряют созревание статуса постоянного тока 11. ВозможноОбъяснение наших выводов является то перевес для частиц размером более 500 нм, которые будут рассматриваться в процессе фагоцитоза, а не 19 эндоцитоза, бывший механизм поглощения определяющие характер постоянного тока. Другие физические характеристики (например, форму частиц и топологии поверхности) также может изменить биологическую функцию меченых клеток, а также должны быть тщательно рассмотрены 20. Для любой данной экспериментальной установки, требующей маркировки постоянного тока с частицами, он, таким образом, настоятельно рекомендуется, что типичный анализов клеточной биологии выполняются параллельно эксперимента по определению / исключить влияние частиц на биологические свойства этих клеток. Некоторые анализы могут быть выполнены, в зависимости от экспериментального исследования в вопросе. Чтобы исключить влияние на созревание ДК, измерения маркера клеточной поверхности (например, CD80, CD86) выражение FACS рекомендуется. Чтобы исключить влияние на поглощение и представление антигенов, фагоцитоз экспериментовментов и Т-клеток грунтовки экспериментов, соответственно, рекомендуется. В случае миграции экспериментов, экспрессия хемокина (CC) рецепторов (например, CCR7) и в лабораторных анализах миграции рекомендуется.

Хотя F 19/1 H МРТ перспективен для изучения миграции клеток особенно для клинических целей, в настоящее время есть ряд ограничений. Они включают (I) пространственному разрешению чтобы исключить возможность непосредственной визуализации отдельных клеток, (II) 19 F недостаточной чувствительностью (предел обнаружения нескольких 10 5 клеток в течение одного ROI), (III) увеличилась сканирования длительностью в результате увеличилась усреднения для компенсации за предыдущие ограничения, (IV), в ограниченном диапазоне от 19 F резонаторов РФ на рынке, и (у) возможных нежелательных фона 19 F сигнал другими фторсодержащими элементы, такие как изофлуорана и политетрафторэтилена (ПТФЭ) в компонентах MR аппаратных средств (например, конденсаторов и соединительных кабелей).

Помимо таких факторов, как магнитное поле и градиент силы, один основной определитель, который диктует уровень пространственного разрешения является чувствительность радиочастотного (РЧ) резонатора, используемого +21. MRI разрешение тесно связано с отношением сигнал-шум (SNR) 21 и на сокращение размера воксела для усиления пространственное разрешение, потери в ОСШ и следовало ожидать. Одним из способов увеличения пространственного разрешения без ущерба чувствительность сигнала является использование криогенным охлаждением катушек, которые увеличивают SNR за счет снижения теплового шума 22. С помощью головки 1Н катушку, которая использует криогенные системы, мы могли недавно визуализации клеточных инфильтратов в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит после использования в самолете разрешением (35х35) 2 23 мкм. Применение этого криогенным охлаждением технологии F 19/1 H ЯМР были бы опможность преодолеть некоторые из МРТ ограничения, связанные с с фотоэлементами Система с сигнала и разрешение.

Один важным вопросом для в естественных условиях отслеживания из клеток путем МРВ является квантификация из этих ячеек в той или иной местоположение в пределах живой организм. Для этой оно является возможный чтобы выполнить 19 F MRS (см. 5.1-5.9). Путем использовать калибровочные кривые, которые получаются из 19 F измерениями MRS из различными номерами из 19 F-меченый округ Колумбия, оно можно вывести количество клеток, достижении лимфа узлу. 19 F MRS измерениями из в лимфатические узлы можете быть по сравнению с 19 F MRS кривая калибровка постоянного тока. Кроме того, путем сравнения MRS данные из клетки постоянный ток калибровочные кривые с чистым PFCE, мы можем вывести, что это возможно для обнаружения приблизительно на 10 +13 19 F спинов В на ячейку после маркировки. В соответствии с MR принципы, самые низкие Предел обнаружения составляет 10 18 спинов на воксел +24. Таким образом, мы можем предположить,, что мы находимся способна обнаруживать тенденцию к минимальное количество 10 5 DC на одно воксел использованием +9,4 T MRI.

В резюме, протокол, которую мы описываем здесь является выгодным для в естественных условиях исследований по изучению миграцию клеток во время патофизиологических процессах. Неинвазивность из метод позволяет продольных исследований, без необходимости из жертвуя больших количествах из животных; возможностью наложения 19 F изображений из меченых клеток на 1 H анатомическими изображениями способствует оптимальному и высоко селективным слежение за мигрирующих клетках; и 19 F MRS предоставляет возможность, чтобы оценить число из клетках локализующий, чтобы специфический анатомических областях в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было профинансировано по Deutsche Forschungsgemeinschaft, чтобы SW (DFG WA +2804) и университетом грантом к ЮЗ от Экспериментальная и клиническая Научно-исследовательский центр, сотрудничества со стороны Макса Дельбрюка Центр для Молекулярной Медицины и Charité медицинский факультет в Берлине. Спонсорам не имел никакой роли в дизайн исследования, сбор и анализ данных, решения о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим Г-н Роберт Westphal для техническую поддержку в течение его интернатуру в нашей лаборатории.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice Charles River, Berlin
RPMI Gibco 21875-091
FBS Superior Biochrom AG S 0615
HEPES Gibco-Invitrogen 15630-056
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine Gibco 25030-024
Dulbecco's PBS Sigma Aldrich D8662
PFA Santa Cruz sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur 391-1996
Pluronic F-68 Sigma Aldrich P5556
Petri dishes (35 x 10 mm) VWR, Germany 391-1996
27 ½ G syringes VWR, Germany 612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh) VWR, Germany 734-0004
NMR tubes VWR, Germany 634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools FST
CO2 incubator Binder
Small animal MR system Bruker Biospin 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil Rapid Biomed, Würzburg, Germany 35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil in-house tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025 SA Instruments Inc., New York, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
  2. Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
  3. Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
  4. de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  5. Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
  6. Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
  7. Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
  8. Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
  9. Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
  10. Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
  11. Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
  12. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
  13. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  14. Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
  15. Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
  16. Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
  17. Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  18. Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
  19. Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
  20. Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
  21. Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
  22. Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
  23. Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
  24. Haacke, E. M. Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , John Wiley & Sons. (1999).

Tags

Молекулярной биологии выпуск 73 иммунологии клеточной биологии физиологии анатомии биомедицинской инженерии гематологии ядерный магнитный резонанс ЯМР фтор дендритные клетки миграция лимфатические узлы магнитно-резонансная томография МРТ магнитно-резонансная спектроскопия MRS спектроскопии изображениями сотовые слежения клиническими методами
Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Магнитно-резонансная томография
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waiczies, H., Guenther, M.,… More

Waiczies, H., Guenther, M., Skodowski, J., Lepore, S., Pohlmann, A., Niendorf, T., Waiczies, S. Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (73), e50251, doi:10.3791/50251 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter