Summary
MRI kullanarak hücrelerin Takip geçmiş yıllarda kayda değer bir ilgi kazanmıştır. Bu protokol, flor ile dendritik hücrelerin etiketlenmesi açıklanmaktadır (
Abstract
Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi girişimsel olmayan görüntüleme yöntemleri sürekli gelişmeler büyük ölçüde canlılar fizyolojik veya patolojik süreçler çalışma yeteneğimizi geliştirdik. MR da in vivo olarak nakledilen hücrelerin yakalamak için değerli bir araç olduğunu gösteriyor. MR rahatlama kez etkileyen kontrast maddelerin MRG yapılan kullanımı için ilk hücre etiketleme stratejileri (T1, T2, T2 *) ve etiketli hücreleri mevcut sinyalinin bir donanım (T1) veya tükenmesi (T2 *) yol açar. T2 gibi ultrasmall demir oksit ajanlar (USPIO) olarak * geliştirme ajanlar hücre göçü ve bazıları da klinik uygulama için FDA tarafından onaylanmış çalışma istihdam edilmiştir. T2 * ajanların bir dezavantajı, kan pıhtılaşması, mikro kanamaları veya hava kabarcıkları gibi diğer eserler etiketli hücreler tarafından oluşturulan sinyal yok ayırt etmek zor olmasıdır. Bu yazıda, in vivo izleme hücreler için gelişmekte olan bir teknik tarifflorin (19 F) zengin parçacıkları ile hücrelerin etiketlenmesi dayanmaktadır. Bu parçacıklar perflorokarbon (PFC) bileşikleri emülsifiye edici ve daha sonra daha sonra MR 19 F tarafından görüntülenebilir etiket hücreleri, için kullanılır tarafından hazırlanır. In vivo içerir (i), daha sonra 19 F rezonans spektroskopi ile de hücreye sinyal ölçmek için arka plan görüntüleri içermeyen ve tam hücre selectivityand (ii) olasılığı elde edilir, in vivo olarak bağlı karbon-19 K, yokluğunda hücre izleme için PFC önemli avantajlar .
Introduction
In vivo hücre izleme biyomedikal pek çok alanda çok önemli bir yönüdür. Bunun için, seçici olarak bir süre içinde hücre lokalize edilebilir non-invazif görüntüleme yöntemleri son derece değerlidir. Üç boyutlu manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gelişimine önce, bağışıklık hücre göç izleme mikroskopik analizler veya doku biyopsisi ile sınırlıydı. MR yardımıyla hücre izleme in vivo immün hücre davranışlarını incelemek Bağışıklık için değil sadece, son yıllarda büyük önem kazanmıştır, ama aynı zamanda klinik ve kök hücre araştırmacılar için vardır. 90'lı yılların sırasında, demir oksit ilk çalışmalar 1 MR ile izleme hücreler için gelişmelerin bir çağlayan başlattı nanopartiküller. Demir oksit parçacıkları işaretli hücrelerin MR gevşeme zamanı (T2 *) kısaltmak ve böylece MR görüntülerde sinyal azalması neden olur. Demir oksit parçacıkları etiketi makrofajlar 2, oligodendrosit s istihdam edilmiştirrogenitors 3 ve bir çok diğer hücre türleri. Bu parçacıkların bazıları da klinik olarak melanom hastalarında 4 hücresel aşılar etiketleme için FDA tarafından onaylanmıştır. In vivo veya demir oksit parçacıkları ile hücrelerin ex vivo etiketleme yana T2 * sinyalinin bir kısalma dayanır ve ikincisi de, bu tür mikro kanamaları, demir yatakları veya hava kabarcıkları gibi in vivo duyarlılık ile ilgili T2 * etkileri getirdiği olabilir diğer arka plan in vivo T2 * sinyal yok oluşların 5 etiketli hücreleri tanımlamak için zor olabilir.
Bu yazıda, 19 F / 1 H manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak in vivo dendritik hücreler (DC) izlemek için bir teknik tarif. Bu hücre izleme teknolojisi sadece MR 19 F için ilk tanınan uygulamaları 7. Min olmuştu birkaç yıl sonra 2005 6 yılında tanıtıldı. Önemli bir Advademir oksit parçacık hücre etiketleme üzerinde 19 F ntage dokusunda 19 F düşük biyolojik olay, bu temelde arka plan olmayan görüntüler ile çok seçici hücreleri izlemek için mümkün kılar. Ayrıca, geleneksel 1H MR elde edilen anatomik görüntüleri ile nakledilen etiketlenmiş hücrelerden 19 F MR sinyali kaplamak mümkündür. 19 K / 1 H MR nedenle, in vivo hücre göçü araştıran çalışmaları için oldukça uygundur. Bu yöntem ile çalıştı Hücreler 19 F-zengin parçacıkları ile etiketlenir. Öncelikle karbon ve florin atomu oluşan sentetik olarak türetilmiş perflorokarbonlar (PFC) genellikle parçacıkları hazırlamak için kullanılır. Bu bileşikler, su içinde çözünmez ve in vitro veya in vivo uygulama öncesinde emülsiyondan geçirilmesine gereksinim vardır. F-MR izleme deneylerde in vivo 19 için diğer gruplar tarafından istihdam edilmiştir PFC parçacıkların boyutu normalde100 nm ve 245 nm 6,8-10 arasında değişmektedir. Ancak biz göstermiştir ki, artan parçacık boyutu (> 560 nm) perfloro-15-taç eter-5-(PFCE) partiküllerinin artışları ile dendritik hücrelerin etiketleme verim. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri yürütme önce yerel kurumsal hayvan koruma kurulu tarafından onaylanması gerekir. MR ölçümleri sırasında anestezi ve fizyolojik izleme yeterli düzeyde (vücut ısısı, solunum hızı) vazgeçilmez gereksinimleri vardır.
1. Fare Kemik İliği-elde edilen dendritik hücreler üretimi
- C57BL kemik iliği hücreleri ayıklamak / 6 fareler daha önce 12 tarif. Bu protokol Geri 1992 13 yılına dayanıyor ve aslında Ralph M. Steinman (1.943-2.011), dendritik hücre 14 keşfeden grubu tarafından tanımlanmıştır.
- Kısaca, fare ödün kısa bir süre sonra tibia ve fibula ayıklayın. Laminer akış kaputu (mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için) altında çalışan, yıkama orta (% 5 FBS, RPMI% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 HEPES) 12 ile küçük bir Petri kabı içine kemik iliği yıkayın.
- Bir cep Samandan yoluyla hücre süspansiyonu aktarıniçi özel (100 mikron göz açıklığı, naylon) steril bir 50 ml santrifüj tüpüne kemik ve artık doku kaldırmak için. Birkaç yıkama adımları ve bir parçalama adım 12 sonra, tripan mavi ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak.
- 400.000 hücre konsantrasyonunda ml'lik kültür ortamı içinde yeniden süspanse -1 kemik iliği hücreleri (RPMI,% 10 FBS ile takviye edilmiş,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 Hepes ve% 1 L-glutamin) fare granülosit 75 ng ml-1 ihtiva eden plazmid ile transfekte edilmiş fare GMCSF 293FT HEK hücreleri süpernatanlanndan elde makrofaj-koloni uyarıcı faktör (MGM-CSF). Petri kapları içinde hücre süspansiyonu, 10 ml (4 x 10 6 hücre) (100 mm x 20 mm) aktarın ve (37 ° C,% 5 CO2), bir CO2 inkübatöründe inkübe edin. 3. günde, 10 ml taze orta (75 ng ml -1 MGM-CSF sonu konsantrasyonu tutulması) ile eski orta doldurmak. 6. günde, eski orta 10 ml çıkarın ve doldurmak10 ml taze ortam ile (MGM-CSF son konsantrasyonu = 75 ng ml-1). 8. günde, eski orta 10 ml çıkarın ve 10 ml taze orta (MGM-CSF son konsantrasyonu = 150 ng ml -1) ile doldurmak.
- Gün 10, 24 saat 1 mg ml -1 lipopolisakkarid (LPS) ile farklı DC olgun.
2. 19 F-zengin Parçacıklar ile dendritik hücreler etiketlenmesi
- 24 saat matürasyon adım (1.5), etiket DC boyunca 1 mM fluor zengin perfloro-15-taç eter-5-(PFCE) aynı zamanda 24 saat boyunca parçacıklar (500-560 nm). Bir hücre bozucu titanyum sonotrod ile ve 60 saniye için sürekli bir darbe programı (genlik% 100, güç = 250 W) kullanılarak (toplam hacmi 2.5 mL), Pluronic F-68 ve PFCE bulamaç büyük florin etiketli parçacıkları hazırlayın.
- Yukarıdaki İnkübasyon sonrasında, 50 ml'lik bir santrifüj tüpü ve santrifüj içine bir doku kültürü hücre kazıyıcı, aktarım kullanarak olgun ve flor-etiketli DC hasat500, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca x g.
- Herhangi bir artık parçacıklar ve ölü hücreleri yıkayın için, poli-L-lisin yemekleri uymak hasat hücreleri bırakın. Bu adım için hazırlamak için, 1 saat boyunca 37 ° C 'de poli-L-lisin (1 mg ml-1) ile kaplama Petri kapları daha sonra PBS ile ilişkisiz bir poli-L-lisin yıkayın.
- Serumsuz ortam içinde poli-L-lisin-kaplanmış plakalar üzerinde toplanan hücreler üzerinde inkübe edin ve (1 saat 37 ° C,% 5 CO2) hücreleri uymak için izin verir.
- Yapışmayan hücreler, kalan parçacıklar ve ölü hücreleri atmak ve üç kez yıkamak için orta yıkayınız önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS.
- Tripsin-EDTA ile muamele (% 0.25 tripsin-EDTA, 37 ° C 'de 3 dakika inkübasyon) ile hasat yapışan hücreler.
- Başka bir yıkama santrifüj işleminin ardından, serumsuz steril PBS içinde olgun DC gerekli miktarda süspansiyon haline getirin.
- Hücreler başarılı bir şekilde etiketli olup olmadığını belirlemek için, bu physicoche kontrol etmek için tavsiye edilirakış sitometrisi (FACS) kullanılarak hücrelerin mical karakteristikleri. Daha önce tarif edildiği gibi 11 yana doğru dağılım (SSC), bu hücreler artan bir parçalı yapı ortaya koymalıdır. Ayrıca fibroblast DC kültür kontamine olabilir ve aynı zamanda paralel olarak 19 F parçacıkları kadar sürebilir akılda tutulmalıdır. Bu nedenle DC saflık in vivo uygulama öncesinde (FACS kullanılarak CD11c + CD11b + hücrelerinin yüzdesi ölçülerek) değerlendirilmelidir.
3.. 19 F-etiketli Dendritik hücrelerin in vivo Uygulamada
- Bir tutucu içinde fare konumlandırarak intrakutanöz bir C57BL / 6 fare arka ayakları içine 100 ul ve dikkatli bir şekilde cildin üst katmanlarına bir 26 G iğne yarım ekleme - 50 arasında bir hacmi - DC (10 7 10 6) yönetme Uygulamadan önce (sürekli bağlı iğne ile kullanım 0.5 ml tüberkülin şırınga ölü hacmi en aza indirmek için). Bir sağlamak içinN uygun tırnak içi uygulama, bu iğne takılı kısmı deri altında kısmen görülebilir olması önemlidir. İğne daha fazla görünür değilse, iğnenin deri tabakaları içine çok derin eklenmiştir. Eğitimsiz birey için, intrakutan uygulama anestezi altında olabilir.
- In vivo flor yılında tarafından görüntü bacaklarda (19 F) / proton (1 H) MR (sonraki bölüme bakın) 21 saat aşağıdaki enjeksiyon.
4. In Vivo 19 F / 1 H Manyetik Rezonans Görüntüleme
MR taramaları kurmak için ayrıntılı talimatlar kontrol yazılımı Paravison (sürüm 5.1) kullanarak bir Bruker MR tarayıcı bakın. Satıcıya özgü fonksiyonları ve öğeleri atıfta isimleri italik olarak vurgulanmıştır. Diğer MR tarayıcılar için şu adımları üreticilerin kurallarına göre ayarlanması gerekebilir.
- Özel bir erişim düzenlemekküçük hayvan MR tarayıcı. Hızlı Biomed, Würzburg,; yeterli görüntü kalitesi, 9,4 Tesla veya daha fazla ve özel radyo frekans bobinleri (örneğin 1 H / 19 F çift ayarlanabilir ses RF bobin, 35 mm iç çapı, 50 mm uzunlukta bir manyetik alan şiddeti ile bir sistem için Almanya) tavsiye edilir.
- MRG öncesinde, anestezi ve fizyolojik izleme için MR tarayıcı kurulumu hazırlamak. Hayvan yatak / sahibinin solunum maskesi izofluran sistemine bağlı ve sıcaklık probu ve nefes ped uzak bir hayvan izleme sistemi (örneğin Model 1025, SA Instruments Inc, New York, ABD) bağlı olduğundan emin olun. İkincisi, vücut ısısı ve solunum gibi hayvanın yaşamsal parametreleri izlemek için hizmet vermektedir.
- Bir izofluran sistemine bağlı bir fare odası kullanarak Teneffüs narkoz ile fareler anestezi. 0.2 L dk -1 ve 0,1 L dk -1, sırasıyla hava ve O 2 için akış hızı ayarlayınve anestezi gerekli seviyesine kadar yaklaşık 2 dakika izofluran% 3 (bir buharlaştırıcı arasında ayarlanabilir) (cevap aşağıdaki ayak tutam) ulaşılır. Optimal debilerde kullanılan kurulum bağlı olarak değişebilir. Yüksek akış oranları aşırı su kaybına yol olabileceğini unutmayın. Yukarıda da belirtildiği gibi hayvanların koşulları dikkatli izleme her zaman gereklidir.
- Küçük hayvan MR tarayıcı (Şekil 1) fare yatak / tutucu eğilimli fare yerleştirin.
- Hava ve O 2 Sabit için akış hızı tutarken, 0.8 izofluran buharlaştırıcı ayarlamak -% 1.5 optimal solunum paterni ulaşılana kadar. 50 bir solunum hızı - dakika başına 70 nefes önerilir.
- Sıcak su (ya da alternatif olarak sıcak hava), dolaşım sistemi kullanılarak, deney sırasında 36-37 ° C 'de vücut sıcaklığı tutmak.
- Ölçüm sırasında steril göz yağlama merhemi ile fare nemli gözünde tutun.
- Hayvan güvence sonraGörüntüleme tutucu ve izleme sistemine bağlantıları, 1 H / 19 F RF bobini (hayvan tarayıcı mıknatısın İzomerkez konumlandırılmış olduğu) ortasına sahibinin hareket ettirin.
- Otomatik bir yöntem (örneğin motorlu hayvan sahibi ile birlikte bir konumlandırma lazer kullanarak) veya manuel olarak tutucu hareket gereken mesafe hesaplayarak ya, diz mıknatısın İzomerkez içinde yatıyor böyle fare konumunu ayarlamak cazibe merkezi haline İzomerkez ulaşmak için.
- Tarayıcı hayvanın doğru konumlandırma teyit ve daha sonra görüntü dilim geometrisi (uzayda yani boyutu, konumu ve dönme) planlanması için, hızlı ve düşük çözünürlüklü görüntü kullanılarak üç standart yönelimleri (sagital, koronal, eksenel) görüntüleri keşif elde elde etme yöntemleri (bir FLASH darbe dizisi kullanır örneğin TriPilot protokolü,).
- 1 H rezonans frekansına RF bobini ayarlayın (örneğin. 400.1 9.4 T MHz) ve 19 F rezonans frekansı ile (örneğin, 9.4 T 376.3 MHz) ve hayvan MR tarayıcı arasında ayarlama monitörü kullanarak 50 Ohm bobinin karakteristik empedansı eşleşir. Tuning ve eşleştirme iletim ve sinyal alımı için en uygun koşulları elde etmek için gereklidir.
- RF genlik (ayarlamak için fare Lamor frekansı (örneğin ADJ_SF) ve referans kazanç için RF ayarlamak için ince ayar için manyetik alan (örneğin ADJ_SHIM), sistem frekans ayarlamaları homojenliği layneri dahil olmak üzere gerekli otomatik sistem ayarlarını yapın örneğin ADJ_REFG). Tüm bu ayarlar mümkün olduğu kadar homojen olarak ilgi bölgesinde sabit ve değişken alanları manyetikleri (B 0, B 1) yapmak için önemlidir.
- Görüş alanı (FOV) öyle ki alt ekstremite hem ar ayarlanabilir sonra, üç ortogonal yönelimleri birlikte izci görüntüleri ikinci bir set (yukarıdaki gibi) eldepelvis yürüyerek (UxGxY = 50x25x25 mm) görülebilir e. Bu görüntüler son 3D 1H / 19 F taramalarının yönelimleri planı için hizmet vermektedir.
- TR / TE = 1500/53 msn, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, NADİR Faktörü = 16 (. Tarama süresi yaklaşık 60 dakika): 1 H-tarama için bir TurboRARE 3D protokol ayarlayın. Izci görüntülerin yardımıyla FOV ayarlayın, (trafik ışığı) taramayı başlatın.
- En az 1000 milisaniye bir TR ile bir tek darbe FID-dizisi yükleyin. Düzenleme Tarama açın ve 19 F. çekirdek set Toolbox Düzen Yöntem otomatik referans kazanç seçimini kaldırarak manuel kazanç ayarları kullanın.
- GSP (kurulum gidin) kullanarak gerçek zamanlı olarak bir MR sinyalini görüntülemek için kayıt veri olmadan ölçümü başlatın. Satın alma penceresi içinde 19 F spektral sinyal çok düşükse, Düzen Yöntemi ve / daha ortalamaları eklemek veya si kadar darbe zayıflatıcı (Tx 0 veya SP0 kaydırıcı) modülegnal açıkça görülebilir. Satın alma penceresinde 0 Hz'de 19 F spektral tepe merkezi için temel frekans ayarlayın. Temel frekans ve basın Dur uygulayın. Anestezi olarak kullanılan izofluran bir arka plan sinyal oluşturabilir unutmayın. 9.4 Tesla MR az 19 F-ihtiva eden parçacıklar ve izofluran arasındaki kimyasal kayma 1800 Hz ile ilgilidir. Uyarma bant genişliği 19 F-etiketli hücreleri veya partikülleri ile heyecan verici izofluran birlikte önlemek için 3.600 Hz daha küçük olduğundan emin olun. Temel frekans 19 F-etiketli hücreleri tarafından üretilen sinyal doğru ayarlanmalıdır. Deneyci uygun gördüğü Alternatif olarak, anestezi başka bir yöntem kullanılabilir.
- Clone (yinelenen) bir önceki 1H tarama TurboRARE 3D protokolü. Yöntem ve seçimini kaldırın otomatik referans kazanç (yukarıdaki gibi) Edit. Düzen Tarama 19 F çekirdek ayarlayın. 128x64x64 için değiştirme matrisive en az 40 (64 kadar) için NADİR-Faktör. Bir TR / TE 1000/6 msn ve 64 ortalamaları için, tarama süresi yaklaşık 70 dk. 101 (araç) için alıcı kazanç ayarlayın ve GOP (boru hattı gidin) kullanarak herhangi bir başka ayarlamalar olmadan taramayı başlatın.
- Taramaları bittiğinde MR tarayıcıdan fare tutucu geri çekin. Dikkatle sahibinden fareyi çıkarın. Fareyi ex vivo analizi (örneğin histoloji veya spektroskopisi, aşağıya bakınız) için kurban değilse tamamen anestezi kurtarıldı kadar doğrudan MR ölçümleri sonra, yakından takip. Vücut ısısı düzenleme anestezi etkilenir, bu nedenle kurtarma işlemi sırasında, bir sıcak sıcaklık ayarlı ped yerleştirilen ayrı bir kafes içinde fare koymak. Fareyi tamamen anestezi kurtarıldı sonra, onun tutma kafesine ve hayvan odasına geri.
- 19 F görüntüleri 1H görüntülere kaplamak için, Görünüm Menüsü o kullanınaynı yazılım (Paravison) üzerinde ption. Underlay fonksiyonu Correlate altında bulunabilir. , Altlık yeni resim yüklemek ve tablo, bak yeni bir renk tanımlayarak 19 F katmanı vurgulayın. 19 F ve 1 H taramaları arasında ayrımcılık için, 19 F sinyali seçilen renk ve arka plan 1H görüntü olacak şekilde gri kalır (kesim tablo Look up) seçilen renk için eşik değiştirmek. Başka bir işlem sonrası programları (örneğin ImageJ) 1 H / 19 F görüntü bindirmeleri oluşturmak için kullanılabilir.
- 19 F sinyal in vivo ölçümü bir gerekli olmalı, daha önce 15,16 açıklandığı gibi basit bir nicel protokol izleyin. Kısacası, miktar fare yanındaki FOV içinde PFCE-Emülsiyon, bilinen bir konsantrasyon ile bir referans tüpü yerleştirerek yapılabilir. MR görüntüleri, Quan aldıktan sonrabölge arasında çıkar (ROI) analizi kullanılarak 19 F sinyallerin şiddetleri tify ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, in vitro kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırın.
5. Lenf nodu Manyetik Rezonans Spektroskopisi (MRS)
- Fare kurban ettikten sonra, küçük bir 5 mm NMR tüpü içine popliteal lenf düğümü ve yer çıkarın ve% 2 PFA 100 ul ekleyin.
- Lenf nodu içeren NMR tüpü tutmak için en az 5 mm'lik bir açıklık vardır bir 19 F spektroskopi bobin (bir toroidal bobin gibi) yükleyin.
- Bobin içindeki NMR tüpü yerleştirin ve mıknatısın İzomerkez içine bobin hareket ettirin.
- 19 F rezonans frekansı (örneğin 9.4 T 376,3 MHz) için RF bobin ayarlamak ve hayvan MR tarayıcının ayar monitör kullanarak 50 Ohm için bobin karakteristik empedansı maç. Tuning ve eşleştirme iletim ve sinyal için en iyi koşulları elde etmek için gereklidiralımı.
- 0 Şimleme Araç içindeki tüm dolgu parametrelerini ayarlamak ve uygulamak basın. Genellikle, bu numune hacmi nispeten küçük olduğu için layneri yöntemleri uygulamak için gerekli değildir. Yeterli 19 F sinyali varsa, otomatik yöntemler layneri, sistem frekans ve yukarıda açıklandığı gibi alıcı kazanç için uygulanabilir.
- En az 1000 milisaniye bir TR ile tek bir darbe FID dizisi yükleyin. Tarama Düzenleme ve 19 F. çekirdeğin ayarlamak açın Toolbox Düzen Yöntem otomatik referans kazanç seçimini kaldırarak manuel kazanç ayarları kullanın. 1 ortalama sayısını ayarlayın.
- GSP kullanarak dizisi başlatın. Satın alma penceresi içinde 19 F spektral sinyal çok düşükse, Düzen Yöntemi ve / daha ortalamaları eklemek veya bir sinyal kadar darbe zayıflatıcı (Tx 0 veya SP0 kaydırıcı) açıkça görülebilir modüle. Temel frekans ayarlama, böylece 19 F SPEctral pik 0 Hz elde etme penceresinin merkezinde ve temel frekans geçerlidir. 90 ° uyarma ulaşmak için sinyal, en üst düzeye çıkarmak için tekrar nabız zayıflatıcı ayarlayın. Sinyal maksimum basın Durdur olduğu zaman.
- 64 ve 256 arasında Düzen yöntemi (ya da daha fazla gerekirse, sinyal bağlı olarak) ortalamaları ayarlayın ve GOP kullanarak satın alma başlar. Saptanan sinyal ortalama sayısı ile doğrusal ilişkilidir. Ölçümü sırasında Saptanan sinyal bir ortalama normalize gerektiğini unutmayın. Ayrıca, bilinen bir konsantrasyonda bir kalibrasyon eğrisi veya bir kalibrasyon standardı normalize 19 F sinyali (Şekil 2) hücrelerin sayısını hesaplamak için gereklidir.
- Tarama tamamlandıktan sonra, örnek kaldırmak bir sonraki örnek yerleştirin ve adım 5.3 ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intrakutanöz uygulamasını takiben on sekiz yirmi bir saat, 19 F-etiketli dendritik hücreler (DC) drenaj popliteal lenf nodu göç. Boşaltma politeal lenf nodu içine lenf kanalları üzerinden DC hareketi 19 F DC görüntüleri (Şekil 2A) ile 1 H anatomik görüntüleri kaplanacağı tarafından takdir edilebilir. Daha önce in vivo olarak, bu hücrelerin göç, hem de alım verimi 11 dahil DC Immunobiology, 19 F-parçacık boyutunun etkisi bildirilmiştir. Lenf düğümleri içine DC göç ölçüde ölçmek için, biz lenf düğümleri ayıklamak ve 19 F MRS (Şekil 2B) gerçekleştirin. Biz anlamak için aynı PFCE parçacıklar (kalibrasyon eğrisi, Şekil 2C) ile etiketli DC farklı sayıda elde edilen 19 F sinyal her lenf nodu elde edilen 19 F sinyal karşılaştırdığımızdalenf nodu ulaşmak 19 F-etiketli DC sayısı. Şekiller 2A ve 2B'de gösterilen temsili deneyde, antijen ile yüklü değildi 7.5 x 10 4 DC doğru lenf nodu ulaşmıştır 3.6 x 10 5 antijen yüklü DC doğru lenf nodu ulaştığını anlamak olabilir.
Şekil 1. Küçük hayvan MR tarayıcı fare tutucu üzerinde fare konumu.
Şekil 2. 19 F MRS kullanarak in vivo 19 F-etiketli DC göç miktarının belirlenmesi. (A) DC 1 mM 560 nm PFCE particl ile işaretlendi es, ile (sağ) veya (sol) antijen olmadan yüklenir ve arka bacak içinde intrakutanöz uygulandı. Bütün tavuk ovalbumin (OVA) antijen olarak kullanıldı; OVA 19 F parçacıklarla birlikte DC ile kuluçkalanmıştır. Lenf düğümleri ve lenf kanalları 1 H anatomik MR görüntüsü (gri tonlama) gösterilir ise dendritik hücreler, 19 F MR sinyali (kırmızı) olarak gösterilmiştir. Görüntüler rezonatör bir 19 F / 1 H çift ayarlanabilir hacimli kuş kafesi ile elde edildi. (B) fare Lenf düğümleri bir çıkarılan ve bir NMR tüpü yerleştirildi gösterilmiştir. 19 F sinyal 19 F MRS (Protokol Text) ve genlik elde edilen serbest indüksiyon çürüme (FID) bir hızlı Fourier dönüşümü (FFT) yaparak hesaplanmıştır ölçüldü. (C) 24 saat bir süre içinde, farklı DC miktarda, 1 mM 560 nm PFCE partikülleri ile etiketlenmiş ve 19 F sinyali B'de olduğu gibi 19 F MRS ile ölçüldüef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
19 F / 1 H MRI lenf nodu içine DC hareketini takip etmek istihdam Bu yöntem in vivo bağışıklık hücrelerinin göç yollarını incelemek için fırsat verir. Dendritik hücreler hızla sıkı belirli yüzeylere 17 kalarak olmadan üç boyutlu yapılar aracılığıyla manevra edebiliyoruz bağışıklık hücrelerinin göç mükemmel örnekleridir. Tanımlanan teknik uzaysal çözünürlüğü (mikron aralığında) bu teknikle, multiphoton mikroskobu ile elde edilebilen yüksek çözünürlüklü (nm aralığında) ile karşılaştırılabilir olmamasına rağmen, in vivo ve fazla hücre göçü doğası incelemek mümkündür uzun bir süre. Ayrıca, mikroskopi bir canlı organizma içinde görüntüleme geniş alanlar için şu anda uygun hale, sınırlı bir derinlemesine nüfuz ve görüş sınırlı bir alanı vardır.
Tekniğin girişimsel nedeniyle, mon mümkündürinceleme sonra fare ödün vermeden itor birkaç gün için immün hücrelerin göç. Bu tekniğin bir diğer avantajı, anatomik 1H taramaları ile göç eden hücrelerin yakalama 19 F görüntüler, böylece canlı organizma içindeki hücrelerin doğru bir lokalizasyon sağlayan bindirme olasılığıdır. Bu teknik bize DC göç altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek sağlayacaktır. In vitro göç deneyleri tipik farklı olarak, bu yöntem, bir fizyolojik 3D ortamda hücre göçü çalışma sağlar.
MRS ve MRG 19 F potansiyel uygulama uzun 7,18 kabul edilmiştir. Yüksek dönermıknatıslık oranı, yüksek spin ve doğal izotopik bolluk 19 F MR görüntüleme 7 için ideal bir aday yapar. Buna ek olarak, 19 F ve 1 H (kendi NMR özellikleri ile ilgili) arasındaki benzerlik t arasında anlamlı bir kaplama için bir ön koşulduro işaretli hücrelerin MR 19 F ile anatomik 1H MR. Gerçekten de diğer 1H / X çekirdekleri MRG üzerinden MR 1 H / F 19 arasında bir avantajı rezonatör aynı RF 19 F ve 1H çekirdeklerin her ikisi için de kullanılabilir olmasıdır. 19 F / 1 H MRG, bir birim rezonatör için kullanılan çoğu uygulamada 19 F ve 1 H. hem ayarlı olabilir kullanılır Her iki kanal için hemen hemen aynı B 1 alanı, 19 F kanala 1 H kanal (bu ölçmek daha kolaydır) güç ayarları bir transfer nedeniyle mümkündür.
Her boyutta parçacıklar (ultra-küçükten büyüğe mikro ölçekli parçacıklar) ile hücrelerin etiketleme zaman dikkate alınması gereken önemli bir faktör biyolojik manipülasyon ve toksisite potansiyelidir. Biz son zamanlarda etiketleme parçacıkların boyutunu artırarak, biz DC 11 olgunlaşma durumunu teşvik olabilir göstermiştir. Olası birbizim bulgu için açıklama yerine endositoz 19 daha fagositoz tarafından alınacak 500 nm daha büyük parçacıklar için üstünlüğü olan, eski alımı mekanizması DC doğasını tanımlayan. Diğer fiziksel özellikleri (örneğin, partikül şekli ve yüzey şekli) de işaretli hücrelerin biyolojik fonksiyonunu değiştirebilir ve dikkatli bir şekilde 20 dikkate alınmalıdır. Parçacıkları ile DC etiketleme gerektiren herhangi bir deney düzeneği için, bu nedenle son derece tipik hücre biyolojisi deneyleri bu hücrelerin biyolojik özellikleri üzerindeki parçacıkların herhangi bir etkisi tespit / dışlamak için deney paralel olarak yapılmaktadır önerilir. Çeşitli tahlillerde Söz konusu deney çalışmaya bağlı olarak, gerçekleştirilebilir. DC olgunlaşma üzerinde etkisi hariç tutmak için, hücre yüzey işaretleyici (örneğin CD80, CD86) FACS ifade ölçümleri önerilir. Antijen alımı ve sunumu, fagositoz exper üzerinde bir etkisi dışlamak içiniments sırasıyla T-hücresi priming deneyler, tavsiye edilir. Geçiş deneylerinin durumunda, kemokin ifadesi (CC) reseptörleri (örneğin, CCR7 gibi) ve in vitro göç deneyleri tavsiye edilir.
19 F / 1 H MRI özellikle klinik amaçlı hücre göçü eğitim için umut vaat ediyor olsa da, sınırlamalar bir dizi bulunamamıştır. Bu, (i) bir tek hücrelerin doğrudan görselleştirme önleyen uzaysal çözünürlüğü, (II) 19 F yetersiz hassasiyeti (ROI içinde bir çok 10 5 hücrelerin tespit limiti), (III) 'ün bir sonucu olarak tarama süresi artmış telafi etmek için ortalama artış bulunmaktadır Piyasada 19 F RF rezonatörler ve bu Isofluorane ve politetrafloroetilen (PTFE) içinde MR donanım bileşenleri (diğer flor içeren elemanları ile (v) olası istenmeyen bir arka plan sinyali 19 F daha önceki sınırlama için, (IV), sınırlıörneğin kapasitörler ve bağlantı kabloları).
Apart gibi manyetik alan şiddeti ve degrade güçlü gibi faktörler, uzaysal çözünürlük düzeyini belirler bir ana belirleyici rezonatör 21 kullanılan radyo frekans hassasiyeti (RF) 'dir. MR çözünürlük yakından sinyal-gürültü oranı (SNR) 21 ile ilgili ve uzaysal çözünürlüğü yükseltmek için voksel boyutunu azaltarak üzerine, SNR bir kayıp beklenebilir. Olduğunu Sinyal hassasiyeti ödün vermeden uzaysal çözünürlüğü artırmak için bir yolu termal gürültü 22 azaltarak SNR artırmak cryogenically soğutmalı bobinleri istihdam etmektir. Bir kriyojenik sistemini kullanan bir 1H kafa bobin yardımıyla, biz son zamanlarda düzey çözünürlük (35x35) mikron 2 23 bir kullandıktan sonra deneysel otoimmün ensefalomyelit hücresel infiltrasyon görselleştirmek olabilir. 19 F / 1 için bu cryogenically soğutmalı teknolojisinin uygulama H MRI op olacaktıryararlanmanıza imkan hücre sinyal algılama ve çözünürlüğü ile ilgili MR sınırlamaları bazılarının üstesinden gelmek için.
MRG ile hücrelerin in vivo takibi için önemli bir sorun, bir canlı organizma içinde belirli bir yerde bu hücrelerin miktar olduğunu. Bunun için 19 F MRS (5,1-5,9 bakınız) gerçekleştirmek mümkündür. 19 F-etiketli DC farklı sayıda 19 F MRS ölçümlerinden elde edilen kalibrasyon eğrileri kullanılarak, bu lenf düğümü ulaşan hücrelerin sayısını anlamak mümkündür. Lenf nodlarının 19 F MRS ölçümleri 19 F MRS DC kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırılabilir. Ayrıca, saf PFCE ile DC hücre kalibrasyon eğrilerinden MRS verileri karşılaştırarak, bunun işaretlemenin ardından, hücre başına yaklaşık 10 13 19 F spin tespit etmek mümkün olduğu sonucuna varıyoruz. MR ilkelerine göre, en düşük saptama sınırı voksel 24 başına 10 18 spin olduğunu. Bu nedenle, biz 9.4 T MR kullanarak voksel başına 10 5 DC en az sayıda tespit edebiliyoruz varsayabiliriz.
Özetle, burada açıklamak bu protokol patofizyolojik sürecinde hücre göçü okuyan in vivo soruşturmalarda için faydalıdır. 1 H anatomik görüntülerde etiketli hücreleri 19 F görüntüleri kaplamak yeteneği göç hücrelerin optimal ve çok seçici izleme teşvik,, tekniğin girişimsel hayvanların çok sayıda feda gerek kalmadan uzunlamasına çalışmalar sağlar ve 19 F MRS sağlar in vivo belirli anatomik bölgelere lokalize hücrelerin sayısını tahmin için bir fırsat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Berlin'de Moleküler Tıp ve Charite Tıp Fakültesi Merkezi Delbrück Deneysel ve Klinik Araştırma Merkezi, Max bir işbirliğinden SW için Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WA 2.804) ve SW için bir üniversite hibe tarafından finanse edildi. Fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz laboratuvarda yaptığı staj sırasında teknik destek için Sayın Robert Westphal teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA | ||
References
- Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
- Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
- Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
- de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
- Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
- Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
- Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
- Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
- Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
- Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
- Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
- Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
- Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
- Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
- Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
- Haacke, E. M. Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , John Wiley & Sons. (1999).
