Summary
전위의 활동 (LMA)는 생쥐의 행동을 간단하고 쉽게 수행 측정이다. 비디오 추적 소프트웨어 (VTS) 및 LMA의 커플 링 LMA 분석 설명서, 라인 교차 방식에 비해 특히, 특이성 및 감도 개선 할 수 있습니다. 또한 VTS 마우스 LMA의 장기 추적을 할 수 있습니다.
Abstract
전위의 활동 (LMA)는 마우스 및 기타 설치류 행동의 간단하고 쉽게 수행 측정이다. 비디오 추적 소프트웨어 (VTS)의 개선은 수동 득점으로 선 횡단 방법에 비해 획기적으로 특이성과 감도를 향상 LMA 테스트를 결합 할 수있다. 또한, VTS는 높은 처리량 실험을 할 수 있습니다. 열기 필드 테스트 (OFT)에 사용되는 자동 비디오 추적 유사한 LMA 테스트 고유 동안한다는 점에서 쥐가 자신의 홈 케이지에 남아있는 것을 허용하고 빛을 어둠의 활성 단계 밝은 조명 anxiogenic 자극을 사용하지 않습니다 주기. 이상 운동 연구 (시간 - 일) 자주 사용하는 송신기 및 biotelemetry를 이식하는 동안 전통적으로, LMA는 시간 (분)의 짧은 기간 동안 사용되었다. 실시간 추적 옵션과 함께, 장기, 단기 LMA 테스트처럼, 지금은 비디오 그래피를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 장기 LMA 테스트는 전문이 필요합니다하지만, 음식과 물 (어떤은 일반적으로 케이지 상단에 위치) 비디오 촬영을 방해하지 않도록 쉽게 케이지를 구축. 중요한 것은, 비디오 그래피와 VTS가 어렵거나 선 교차점 및 / 또는 biotelemetry로 측정으로 실행할 수 있습니다 같은 마우스 움직임의 경로와 매개 변수의 정량화 할 수 있습니다. 결론적으로, VTS에 연결된 LMA 테스트는 마우스 동작에 대한 자세한 설명과 오랜 기간 동안 운동을 검사 할 수있는 능력을 준다.
Protocol
1. 단기 LMA 세트 업 및 절차
- 단기 LMA 케이지 설정
- 단일 보관 마우스의 홈 케이지에서 단기 LMA를 테스트합니다. VTS에 의존하는 이미지 분석을 용이하게하기 위해 마우스 색상 (흰색 쥐와 검은 쥐에 대한 밝은 색의 침구 즉, 어두운 색의 침구)와 높은 콘트라스트의 침구를 사용합니다.
- 단기 LMA 테스트 기간 동안, 11 X ¼ 직경 구멍에 적절한 통풍을 지원하기로 플렉시 유리에 일반 ¼로 새장을 포함한다.
- 단기 LMA 테스트 실
- 그들이 적어도 24 시간 전 8 풍토에 순화되어있는 깨끗한 환경에서 마우스를 테스트합니다.
- 테스트 환경을 조명하기 위해, 빨간색 전구 (<125 루멘)과 육추 클램프 등을 사용합니다. 비디오 그래피에 앞서, 플렉시 유리 케이지 정상에서 눈부심이나 반사를 제거하는 빛의 각도와 위치를 조정합니다.
- 객실의 소음을 제거하거나 방지70dB 이상. 간헐적 인 소음 마우스 테스트 중에 피할 수없는 경우 화이트 노이즈 생성기를 사용합니다.
- 케이지는 케이지 침구에 정육점 또는 유사한 색상의 실험실 벤치 종이로 시험 방에 배치되는에 따라 시험 표면을 커버, 경우에 케이지 바닥 비디오 촬영 중 노출됩니다.
- 단기 LMA 비디오 촬영
- 센터와 테스트 실에서 녹음 영역 위 이상의 메모리 120 GB의 천장에 장착 된 야간 시계를 지원하는 비디오 카메라를 배치합니다. 비디오 카메라 뷰 프레임 (Noldus 정보 기술 (리스 VA)에 의해 예를 들어, Ethovision XT 7을 동시에 실시간으로 8 쥐를 추적 할 수 있습니다) 내에 너무 많은 새장을 배치하여 사용 VTS의 해상도 능력을 초과하지 마십시오.
- 단기 LMA 테스트 절차
- 라이트 사이클의 어두운 / 활성 단계에서 단기 LMA를 테스트합니다. 빛의주기를 기준으로 시간을 일 있는지 확인모든 그룹에 걸쳐 동일한 전자, LMA는 어두운주기 1 초 이상 기간 동안 더 많은 활동 어두 컴컴한 패턴을 다음과 같이. 최소화 LMA의 시간적 차이의 잠재적 영향을 확인하기 위해 기록 된 생쥐의 각 그룹 모두 실험 및 제어 과목을 포함합니다.
- 개인적으로 집과 순응 마우스 적어도 24 LMA 테스트 8 시작하기 전에 시간.
- 직접 카메라에서 케이지 분할기와 케이지 (개인 마우스 포함) 놓습니다. 이 마우스의 뷰 (마우스 굴 / 중첩 재료 자체를 포함하는 경우 등) 방해 및 VTS의 정확성을 방해 할 수 있으므로, 케이지에서 모든 중첩 / 농축 물질을 제거합니다. 기록 된 각 케이지 명확한 플렉시 유리 뚜껑을 놓습니다.
- 동시에 여러 개의 케이지있다 videoing 때, 해상도가 선택한 VTS와 호환되는지 확인하십시오. VTS 분석을 쉽게하기 위해 (즉, 오른쪽 상단) 각 분할 내에 동일 케이지의 위치를.
- 녹음을 시작합니다. 추가 비디오가 아닌 문서의 독립적 인 비디오의 적절한 식별을 보장하기 위해 모든 관련 실험 정보를 식별 슬레이트 각 비디오를 시작합니다. LMA 테스트 (5-10 분)의 기간을 추적하기 위해 타이머, 스톱워치를 사용합니다. 타이밍 정보가 손실 된 경우, 영상 기록에서 복구 할 수 있습니다.
- 단기 LMA 방법을 사용하여 반복 측정의 경우, 마우스가 아닌 측정 간격 동안 음식과 물에 접근 할 수 있습니다.
- 테스트하는 동안 생쥐의 눈에 띄지 않도록 외부의 시각적 인 역할을하는 어떤 실험자를 유지합니다.
- 테스트가 완료되면 반환 / 둥지 / 농축 물질을 대체, 불안과 같은 행동 8의 개발 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 단기 LMA 분석
- 테스트 세션에서 사용 된 VTS와 호환 아카이브 미디어에 비디오 녹화를 저장합니다. Ethovision XT 7, 하드 드라이브 디스크 (HDD)를 사용.
- 실시간으로 비디오를 분석, 관련 미디어 플레이어를 사용하여 VTS에서 동영상을 재생합니다. 그림 1에서 검출 변수는 : 2cm / 초 추적을 시작, 1.75 cm / 초 정지 추적.
- 처음에, 추적을위한 관심 영역 (ROI)로 전체 케이지 바닥을 선택합니다. 이러한 thigmotaxis의 평가와 같은 고급 분석을 위해 여러 내부 케이지 ROI를 만듭니다.
- 높은 처리량 연구에 대한 개별 모든 케이지 바닥 ROI를 동시에 비디오 내의 모든 새장을 분석합니다.
- 총 거리 (cm) 이동 속도 (cm / 초)과 움직임의 지속 시간 (초) 이동 계산 VTS를 사용합니다. Ethovision XT 7, 저장, 추가 분석을 위해 마이크로 소프트 엑셀로 생성 된 데이터를 내보낼 수 있습니다.
2. 장기 LMA의 테스트 설정 및 절차
- 장기 LMA 테스트 케이지 건설
- 짧은 끝 벽에 5.5 cm 직경 구멍을 잘라표준 마우스 케이지. 직류 전기를 통한 강철 메쉬 ¼로 구멍 덮개를 만들 수 있습니다. 음식에 마우스 접근을 허용하기 위하여 오프닝에서 여러 ½을 만드는 메쉬를 잘라. 날카로운 모서리를 제거하는 절단 메시를 닦다.
- 직접 5.5 cm의 구멍을 커버하는 데 사용되는 메쉬에 연결된 외부 호퍼를 생성하기 위해 추가 메쉬를 사용합니다. 구멍을 커버하는 데 사용되는 메쉬 호퍼를 연결하고, 알루미늄 리벳을 사용하여 케이지 어셈블리를 연결합니다.
- 표준 50 ML 원뿔 (코닝)와 노 드립 sipper 튜브의 삽입 (역 퓨어 시스템)를 허용하는 오버 뚫은 1 홀 고무 마개 (피셔)에서 물 한 병을 구축합니다. 벨크로 테이프와 케이지 (3M)에 물병을 확보하고 메쉬 커버 구멍을 통해 sipper 튜브를 삽입합니다.
- 장기 LMA 테스트 기간 동안, 11 X ¼ 직경 구멍에 적절한 통풍을 지원하기로 플렉시 유리에 일반 ¼로 새장을 포함한다.
- 장기 LMA 테스트 실
- 설정 장기 LMA 테스트 실 단기 LMA와 동일합니다. 절차에 대해서는 1.2 절을 참조하십시오.
- 장기 LMA 비디오 촬영
- 센터 직접 테스트 실에서 녹음 영역 위 PC에 연결된 천장에 장착 된 적외선 보안 스타일, 카메라를 배치합니다. 만 (예 : Ethovision XT 7 동시에 실시간으로 8 쥐를 추적 할 수 있습니다)를 사용 VTS의 기능 내의 개별 케이지 해상도 번 그 결과를 케이지의 수를 기록한다.
- 장기 LMA 테스트 절차
- 라이트 사이클의 어두운 / 활성 단계 동안 장기 LMA를 테스트합니다. LMA는 어두운주기를 1 초 이상 기간 동안 더 많은 활동 어두 컴컴한 패턴을 다음과 같이 빛을주기에 상대적으로 시간이 모든 그룹에서 동일한 지 확인합니다. 기록 된 생쥐의 각 그룹 모두 실험 및 제어 과목 가능성을 최소화하기 위해 테스트LMA의 시간적 차이의 효과.
- 개인적으로 집에 적어도 24 시간 동안 수정 된 새장에서 테스트 쥐를 적응.
- 직접 카메라에서 케이지 분할기와 케이지 (개인 마우스 포함) 놓습니다. 마우스보기의 방해를 보장하기 위해 케이지에서 모든 중첩 / 농축 물질을 제거합니다. 둥지 재료로 굴을 마우스 마우스를 추적하는 VTS의 기능을 방해합니다. 기록 할 케이지의 각 명확한 플렉시 유리 뚜껑을 놓습니다.
- 한 번에 여러 새장을 녹음 할 때, 해상도가 선택한 VTS와 호환되는지 확인합니다. 각 분할 내에서 동일 VTS 분석, 위치 새장을 쉽게하기 위해 (즉, 오른쪽 상단).
- 장기 LMA 테스트는 일반적으로 실시간으로 분석하고, 영상 기록은 일반적으로 생성되지 않습니다. 영상 기록은 보조 카메라를 사용하거나 기본 카메라에 연결된 DVD 레코더를 통해 기록 할 수 있습니다. 개인의 상세한 기록을 보관해야마우스 및 그룹 정보를 제공합니다.
- 실시간 분석을위한 VTS를 설정합니다. 전체 케이지 바닥 추적을위한 투자 수익 (ROI)을 포함한다. 기록되는 모든 케이지에 대한 ROI를 설정. 총 거리 (cm) 이동 속도 (cm / 초)과 움직임의 지속 시간 (초) 이동 계산 VTS를 사용합니다. 그림 2에서 검출 변수는 : 2cm / 초 추적을 시작, 1.75 cm / 초 정지 추적.
- 마우스 장기 LMA를 녹음을 시작합니다. 분석 컴퓨터와 관련된 시계를 통해 장기 LMA 테스트의 기간을 모니터링합니다.
- 테스트하는 동안 생쥐의 눈에 띄지 않도록 외부의 시각적 인 역할을하는 모든 실험자를 유지합니다.
- 테스트가 완료되면 반환 / 둥지 / 농축 물질을 대체, 불안과 같은 행동 8의 개발 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 장기 LMA 분석
- 장기 LMA 분석 영상 기록의 생성없이 실시간으로 발생. Ethovision XT 7을 사용하는 경우, 저장 및 분석 용 Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
- 장기 LMA에 대한 영상 기록을 생성하려면, 보조 카메라를 사용합니다. 보조 카메라가 잠재적으로 긴 기록 (들)을 저장하기에 충분한 충분한 저장 용량을 가지고 있어야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
반복 측정 결과의 예를 들어, 단기 LMA 시험은 그림 1에 표시됩니다. 이 그림은 리포 다당류 (LPS) 투여 후, 마우스는 빠르게 주위 환경 동물 수용 (AEC) 6에 보관 쥐보다 단기 전위의 활동을 복구 개별적으로 환기 동물 수용 (IVC)에 보관되어 있음을 보여줍니다. 전위의 활동의 초기 손실이 LPS 주입 군간에 유사하지만, 기초 LMA에 복구 IVC - 보관 쥐에서 더 빠르다는 운동의 속도 (그림 1b)과 움직임 (그림 1C)의 기간이었다. 이 짧은 기간 LMA 테스트와 반복 측정 모델의 사용은 다른 그룹 사이의 시간에 관찰 및 복구의 비교를 할 수 있습니다.
장기 LMA 테스트 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 그림은 2 개의 분리하지만, 연속적인 일 동안 매일 테스트를 12 시간 동안 마우스 운동력을 보여줍니다. 유의 diffe 없습니다 거리 rence 움직임 (그림 2B) 또는 이동 (그림 2C) 기간의 속도는이 2 개의 일 (미발표 파일럿 데이터) 사이에서 발견되었다 (그림 2A)로 이동. 작은 샘플 크기 오류로 인해 상당한 양의가 있지만, 이러한 결과는 장기 운동 연구의 가능성을 이식 할 필요없이 수행 할 수 있도록 일관되고 반복 가능한 데이터가 연속적인 일의 과정을 통해 생성 될 수 있음을 보여 송신기와 biotelemetry. 파워 부족하지만, 거리의 2 일차 대 1 일 운동 시간 (그림 2C)에서가 아니라 속도의 차이 (그림 2B)의 차이점으로 인해 나타납니다 (그림 2A)로 이동.
PG "/>
그림 1. AEC 또는 IVC 주택 중 하나에서 LPS에 의한 주변 환경 동물 수용 (AEC)에 보관 생쥐의 전위 활동의 손실 및 개별 환기 동물 수용 (IVC). 그룹 보관 쥐 (케이지 당 4) 개별적으로 단기 LMA이 시작되기 전에 보관 된 테스트. 마우스는 LPS (100 ㎍ / kg)으로 주입 (A) 거리 (B) 이동 (cm / 초) 및 운동 (들)의 (C) 시간의 속도가 표시되는 시간에 평가 하였다 (cm) 이동되었습니다. 결과는 백분율 기준 (사전 LPS) LMA로 표현되며, ± SEM을, N = 6을 의미합니다. 거리 주 효과 이동 시간 : (F (3,77) = 13.08, P <0.01), 주택 유형 (F (1,77) = 3.69, P = 0.06), 시간을 X 주거 유형의 상호 작용 (F (3,77) = 3.31, P = 0.02). 운동의 속도 주 효과 : 시간 (F (3,77) = 13.08, P <0.01), 주택 유형 (F (1,77) = 3.69, P = 0.06), 시간 X 하우징 ING 유형의 상호 작용 (F (3,77) = 3.31, P = 0.0243). 운동 시간은 주 효과 : 시간 (F (3,77) = 12.92, P <0.01), 주택 유형 (F (1,77) = 0.69, P = 0.41), 시간 X 주거 유형의 상호 작용 (F (3,77 ) = 3.26, P = 0.03). 일반적 첨자 문자가없는 개별 시점에서 바 (P <0.05) 유의 한 차이가 있습니다. 뇌의 난연성 : #에서 재판. 및 Immun., 26 (6), 요크, JM, 외., 개별 환기 케이지는 엘스 비어의 허가와 hematologically과 행동으로 만성 낮은 수준의 저산소증 영향을 미치는 마우스, 951-958, 저작권 2012가 발생합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
load/50252/50252fig2.jpg "/>
그림 2. 쥐 장기 LMA. 그룹 보관 쥐 (케이지 당 4) 개별적으로 장기 LMA 시험이 시작되기 전에 보관 하였다. 마우스 LMA는 12 시간 (1 일)에 대한 실시간 분석 및 결과 1 일 이후 같은 쥐 (2 일)합니다. 결과는 () 총 거리 (cm가 X 1,000) 이동으로 표현된다 (B) 이동 (cm / 초)와 (c) 운동의 지속 시간 (초 X 1,000) 수단 ± SEM을, N = 4 (유의 한 차이의 속도 0 24 시간)과 (미발표 파일럿 데이터).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
마우스에서 질병의 증상은 혼수, 사회적, 환경 적 환경에 대한 관심의 상실, 권태감 및 식욕 부진 2-3 이용하실 수 있습니다. 마우스 및 기타 설치류에, LMA는 면역 활성화에 4-5 후 질병을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 장기 LMA는주기 동작이나 잠자기 / 깨우기 패턴의 장애에 치료에 의한 변화의 분석을 허용, 24 시간 (또는 그 이상) 동안 움직임을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 이 비 침습 쉽게 반복 측정 또는 연속 양상으로 수행하고 최소한의 혼란입니다 때문에 LMA는 질병에 대한 다른 시험에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 여러 케이지가 기록 / 동시에 분석 할 수 있기 때문에 다른 방법 및 시스템 (예 : Phenotyper, Intellecage, photobeam 시스템), VTS와 LMA 분석에 비해 상대적으로 저렴합니다. 여기에 사용되지 않지만, 양육 및 벽 등반과 같은 LMA 활동의 추가 분석의 사용을 통해 달성 될 수있다측면에 장착 된 카메라. VTS와 함께, LMA는 적응력이 높은 처리량입니다. VTS는 시간, 거리, 속도, 경로 5의 결정 등 운동의보다 철저한 검사를 할 수 있습니다. 그것은 불안 행동의 기초가 있기 때문에 경로 추적은 특히 강력하다.
그 많은 장점에도 불구하고, VTS와 LMA에 잠재적 인 함정 고유는 최대의 분리 / 마우스 단일 하우징 (그리고 아마도 초과) 24 시간입니다. 사회적 고립은 스트레스 반응과 침략 연장 11을 유도 할 수 있습니다. 조사자는이 제한을 인식하고 적절한 실험 제어 및 결과 해석을 보장하기 위해 조치를 취해야한다.
모든 행동 테스트하는 동안 마우스 LMA, 사전 실험 사항에주의를 포함하여 일관된 결과를 달성하는 데 중요합니다. 시험 장소 및 시험 케이지 환경에 적응이 필수적이다. 비정상적인 소음, 빛과 소리, 특히 interfe 있습니다그들은 7-8 놀라게 응답 및 / 또는 불안 행동을 자극 수 있으므로 반지. 이상적으로, LMA 테스트는 유해 냄새 (특히 자연 포식자 냄새) 무료로 온도 및 습도 환경에서 발생합니다. 시간 (일) 오랜 기간 동안 동물의 주택을 허용하는 고정 된 행동 테스트 스위트는 것이 바람직하다. 반복 테스트를 노화 나 만성 질환의 연구에 매우 유용하기 때문에 동물 보호 시설에 마우스를 반환하는 기능은 유용합니다.
거의 모든 이러한 테스트는 마우스의 움직임을 필요로하기 때문에 마지막으로, LMA 시험은 거의 모든 다른 행동 검사와 함께 수행되어야한다. 인지에 대한 LMA 영향 테스트 (반즈 미로, Y 미로, T 미로, 새로운 객체 인식), 행동 (제로 미로, 오픈 필드), 쾌락 추구 (바퀴가 실행), 우울증 같은 행동 (자당 / 사카린 환경 불안 등을 교란 )와 질병 (사회적 철수와 굴) 8-9. 단기 및 L을 테스트하여크게 다음 행동 테스트를 좌우하지 않는 동안 사연 기간 LMA는 마우스 하위 변종, 유전자형과 질병 / 개입 모델 사이 10 표현형의 차이를 신속하게 평가할 수 있습니다. 중요한 움직임의 차이가 확인하는 경우 또한, 적절한 조치들은 유도 고유의 혼동에 의해 제한됩니다 더 복잡한 행동 검사의 제정 이전에 반입 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
지원 :이 연구는 건강의 국립 연구소 (DK064862, NS058525 및 GGF에 AA019357)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Sony | HDR-XR500V | Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility. |
| Opaque cage dividers | Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps. | ||
| Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color) | Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location. | ||
| Clear Plexiglas cage tops | Custom fabricated based on cage dimensions. | ||
| Automated video tracking software (EthoVision XT 7) | Noldus Information Technology | A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice. | |
| PC | Dell Inc. | See VTS software providers minimum PC .requirements | |
| White noise generator | Dohm | DS | A variety of white noise generators are available, depending on need. |
| Brooder clamp lights with red light bulbs | Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room. | ||
| Lab bench or butcher paper | Paper should match or be very similar in color to the cage bedding. |
References
- Goulding, E. H., Schenk, A. K., Juneja, P., MacKay, A. W., Wade, J. M., Tecott, L. H. A robust automated system elucidates mouse home cage behavioral structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20575-20582 (2008).
- Kent, S., Bluthé, R. M., Kelley, K. W., Dantzer, R. Sickness behavior as a new target for drug development. Trends Pharmacol. Sci. 13, 24-28 (1992).
- Dantzer, R. Cytokine, sickness behavior, and depression. Immunol. Allergy Clin. North Am. 29, 247-264 (2009).
- Godbout, J. P., et al. Exaggerated neuroinflammation and sickness behavior in aged mice following activation of the peripheral innate immune system. FASEB J. 19, 1329-1331 (2005).
- York, J. M., et al. The biobehavioral and neuroimmune impact of low-dose ionizing radiation. Brain Behav. Immun. 26, 218-227 (2012).
- York, J. M., et al. Individually ventilated cages cause chronic low-grade hypoxia impacting mice hematologically and behaviorally. Brain Behav. Immun. 26, 951-958 (2012).
- Jennings, M., et al. Refining rodent husbandry: the mouse. Report of the Rodent Refinement Working Party. Lab. Anim. 32, 233-259 (1998).
- York, J. M., Blevins, N. A., Baynard, T., Freund, G. G. Mouse testing methods in psychoneuroimmunology. Methods in Molecular Biology. 934, 243-276 (2012).
- Dantzer, R., O'Connor, J. C., Freund, G. G., Johnson, R. W., Kelley, K. W. From inflammation to sickness and depression: when the immune system subjugates the brain. Nat. Rev. Neurosci. 9, 46-56 (2008).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping of rodents. Comp. Med. 53, 140-146 (2003).
- Karelina, K., et al. Social isolation alters neuroinflammatory response to stroke. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5895-5900 (2009).
