鼠标短期和长期活动性分析视频跟踪软件

Summary

运动活性（LMA）是一个简单而容易地进行测量，在小鼠的行为。视频跟踪软件（VTS）和LMA的耦合允许的特异性和灵敏度的提高，尤其是当同手动，线相交时，LMA分析方法相比。此外，VTS允许长期跟踪鼠标LMA。

Abstract

自主活动（LMA）在老鼠及其他啮齿动物的行为是一种简单，方便地完成测量。视频目标跟踪软件（VTS）中的改进，使得它能够被连接到LMA的测试，方法与人工计分的线交叉时相比，显着提高的特异性和敏感性。此外，VTS使高通量实验。虽然类似的开放的现场测试（OFT）用于自动视频跟踪，LMA测试的独特之处在于它可以让老鼠留在他们家笼不利用导致焦虑的刺激，明亮的灯光明暗，在活跃期周期。传统上，LMA已被用于很短的时间（分钟），而较长的运动的研究（小时，天）是经常用的发射器和生物遥测植入。随着实时跟踪的选项，长，像短期LMA测试，现在可以进行录像。长期的LMA测试需要专门的但容易建造，笼，使食物和水（通常定位上笼顶）不妨碍摄像。重要的是，录像和VTS可量化的参数，如鼠标移动的路径，有困难或不可行的测量线道口和/或生物遥测。总之，LMA测试耦合到VTS中的鼠标移动，在一段较长的时间，它可以检查运动提供了一个更完整的描述。

Protocol

1。短期LMA设置和程序

1. 短期LMA笼成立
   1. 测试短期LMA一个单一的容纳鼠标内的家笼。为了促进的VTS依赖图像分析，使用床上用品用鼠标颜色（ 即深色白老鼠和黑鼠浅色床上用品床上用品）的高对比度。
   2. 在短期LMA测试，覆盖有机玻璃笼有明确的¼11×¼英寸直径的孔，以支持适当通风。
2. 短期LMA检测室
   1. 测试小鼠在干净的环境中，它们已被驯化的至少24小时^8。
   2. 要照亮的测试环境，使用育雏钳灯与红色灯泡（125流明）。录像前，调整角度和位置灯有机玻璃笼顶以消除眩光或反射。
   3. 删除或避免室内噪声低于70分贝。如果间歇背景噪声是不可避免的鼠标测试期间，使用白噪声发生器。
   4. 覆盖测试笼子放置在考场屠夫或实验室工作台笼床上用品颜色相近的纸张表面，笼地板的情况下被暴露在摄像过程中。
3. 短期LMA录像
   1. 中心和至少120 GB以上的内存在测试室的记录区，放置安装在天花板上的夜视能力的摄像机。不要超过VTS所使用的网箱内放置太多的摄像机视图框架（ 如 Ethovision XT 7 Noldus信息技术（弗吉尼亚州利斯堡）可同时跟踪8只实时）的分辨能力。
4. 短期LMA测试程序
   1. 测试短期LMA在主动/暗的光周期阶段。确保时间相对光周期日在所有组中的相同，，LMA如下开化的格局，更多的活动在暗周期¹期的早期和晚期。包括两个实验组和对照组，各组记录小鼠，以确保在LMA时空差异的潜在影响最小化。
   2. 个别房子驯化老鼠至少在24小时前的LMA测试⁸开始。
   3. 将分笼笼（含个体小鼠）直属相机。从笼子里移除所有嵌套/富集材料，因为这可能会妨碍鼠标的观点（ 例如，如果鼠标洞 ​​穴/遮掩自己的筑巢材料）和干扰VTS的准确性。记录每个笼子上放置​​一个透明有机玻璃盖。
   4. 同时映像几个笼子时，要确保分辨率是与VTS选择兼容。为了缓解VTS分析，定位相同的笼子内每个分压器（ 即右上角）。
   5. 开始录制。开始用石板标识所有相关实验资料，以确保正确识别独立于任何其他非视频文件的视频每个视频。使用定时器或秒表持续跟踪的LMA测试（5-10分钟）。如果定时信息被丢失，恢复从视频记录。
   6. 对于重复的措施，使用短期LMA方法，让老鼠进入的非测量间隔期间的食物和水。
   7. 在测试过程中，保持任何实验者的老鼠的视线，以免作为一个外部的视觉线索。
   8. 当测试完成后，返回/替换嵌套/富集材料，以减少潜在的发展焦虑样行为^8。
5. 短期LMA分析
   1. 从测试会话到归档介质兼容使用的VTS录像存储。对于Ethovision XT 7，一个硬盘驱动器的磁盘（硬盘）是用来。
   2. 在VTS使用，分析其相关的媒体播放器中的视频实时视频重播。在图1中，检测变量为：2厘米/秒开始跟踪; 1.75厘米/秒停止跟踪。
   3. 最初，选择整个笼地板的感兴趣区域（ROI）的跟踪。先进的分析方法，如评估thigmotaxis，创建多个网箱内的投资回报率。
   4. 对于高通量研究，分析所有的网箱内的视频同时与个体笼地板的投资回报。
   5. 使用的VTS，计算总的移动距离（厘米）的运动速度（厘米/秒）的运动的持续时间（秒）。对于XT 7 Ethovision，将数据导出到Microsoft Excel中用于存储和额外的分析。

2。长期LMA测试设置和程序

1. 长期LMA测试笼建设
   1. 在短端壁切5.5厘米直径的孔一个标准的鼠笼。创建一个覆盖为¼镀锌钢丝网孔。切网，创建几个半开口，让鼠标获得食物。打磨切割的网格，以除去锐边。
   2. 使用额外的网格创建外部料斗直接连接到用于覆盖5.5厘米的开放网格。用于覆盖孔网状连接料斗，并使用铝铆钉连接组件笼。
   3. 构建一个水瓶，一个标准的50毫升锥形（康宁）和1孔的橡胶塞（费希尔）钻允许无滴吸管插入（站纯系统）。水瓶固定笼魔术贴（3M）和插入吸管通过网覆盖开幕。
   4. 在长期LMA测试，覆盖有机玻璃笼有明确的¼11×¼英寸直径的孔，以支持适当通风。
2. 长期LMA检测室
   1. 长期LMA检测室设立短期LMA相同的。程序见1.2节。
3. 长期LMA录像
   1. 中心，并把吊顶安装的红外线，安全式，相机直接连接到一台PC以上的记录区考场。只记录一次使用（ 例如 Ethovision XT 7可同时跟踪在实时的8只小鼠）的VTS的能力，结果在个别决议笼内网箱数量。
4. 长期LMA测试程序
   1. 测试长期LMA在主动/暗的光周期阶段。确保时间相对光周期是一样的，在所有群体中，LMA如下黄昏模式，更多的活动在暗周期¹期的早期和晚期。测试记录各组小鼠的实验和对照组，以确保尽量减少潜在的LMA时空差异的影响。
   2. 个别的房子，并在修改后的至少24小时的笼驯化试验鼠。
   3. 将分笼笼（含个体小鼠）直属相机。从笼子里取出所有嵌套/富集材料，以确保通畅的鼠标。鼠标挖洞进入排料将干扰的能力的VTS跟踪鼠标。放置一个透明有机玻璃盖每个网箱被记录上。
   4. 当记录几个笼子，确保该决议是与VTS选择兼容。为了简化的VTS分析，位置相同的笼子里，在每个分（ 即右上角）。
   5. 长期LMA的测试一般是在实时进行分析，通常不创建的视频记录。通过使用一个辅助摄像头，或者通过DVD刻录机连接到主摄像头，可以记录的视频记录。一定要保持个人的详细记录鼠标和组信息。
   6. 设立VTS实时分析。整个笼地板应包括跟踪的投资回报率。设定投资回报的所有笼子里被记录。使用的VTS，计算总的移动距离（厘米）的运动速度（厘米/秒）的运动的持续时间（秒）。在图2中，检测变量为：2厘米/秒开始跟踪; 1.75厘米/秒停止跟踪。
   7. 开始记录鼠标长期LMA。分析的计算机与通过时钟监视长期LMA测试的持续时间。
   8. 在测试过程中，让所有实验者的老鼠的视线，以免作为一个外部的视觉线索。
   9. 当测试完成后，返回/替换嵌套/富集材料，以减少潜在的发展焦虑样行为^8。
5. 长期LMA分析
   1. 长期LMA分析的一代的视频记录的情况下发生在实时。导出到Microsoft Excel中的数据进行存储和分析，如果使用XT Ethovision 7。
   2. 长期LMA要生成的视频记录，使用辅助摄像机。要确保副摄像头，拥有充足的存储容量足以存储潜在的冗长记录（S）。

Representative Results

重复测量的结果的一个例子中，短期LMA测试图1中所示。这一数字表明，脂多糖（LPS）管理后，小鼠独立通风笼具（IVC）坐落在短期复苏的自发活动的速度比周围环境隔离罩^（AEC）6安置在小鼠。虽然最初的运动活性的损失LPS注射组之间是相似的，恢复至基底LMA更迅速的下腔静脉安置老鼠的移动速度（ 图1b）和持续时间的移动（ 图1c）。重复测量模型的使用与这种短期LMA测试允许随着时间的推移在不同群体之间的恢复的观察和比较。

图2中所示的长期LMA试验例。这个数字在12小时，每天超过2个独立的，但连续两天的测试，演示鼠标运动。无显着性迪菲移动的距离何正兵（ 图2a），2天（未公布的导频数据）之间的移动速度（ 图2b），或持续时间的移动（ 图2c）。虽然有一个显着量的误差，由于一个小的样本大小，这些结果表明，一致的和可重复的数据，可以生成连续数天的过程中，允许潜在的较长期的运动研究的植入，而无需进行发射器和生物遥测。虽然动力不足，提出的距离差与2天1天（ 图2a）中的运动的持续时间（ 图2c），而不是速度的差（ 图2b）出现由于相异。

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图1。 LPS诱导的亏损周围环境隔离罩（AEC）坐落在小鼠自主活动和独立通风笼具（IVC）。集团坐落小鼠（每笼4）无论从AEC或IVC住房的单独住开始前短期LMA测试。小鼠注射LPS（100微克/公斤），并且（a）的移动距离（厘米），（二）的移动速度（厘米/秒）及（c）的运动的持续时间（次）所示的时间进行了评价。结果表示为％的基线（预LPS）LMA，指±SEM，N = 6。移动距离主要功效：时间（F（3,77）= 13.08，P <0.01），房屋类型（F（1,77）= 3.69，P = 0.06）;时间所述房屋类型交互作用（F（3,77） = 3.31，P = 0.02）。运动速度主要功效：时间（F（3,77）= 13.08，P <0.01）;房屋类型（F（1,77）= 3.69，P = 0.06）;时间x HOUS ING型互动（F（3,77）= 3.31，P = 0.0243）。运动持续时间主要功效：时间（F（3,77）= 12.92，P <0.01）;房屋类型（F（1,77）= 0.69，P = 0.41）;时间×房屋类型交互作用（F（3,77 ）= 3.26，P = 0.03）。没有共同的上标字母的各个时间点的酒吧内有显着性差异（P <0.05）。 ＃转载自： 脑性HB。免疫 ，26（6），纽约，JM 等，独立通风笼引起慢性低度缺氧影响小鼠血液学和行为，951-958，2012年版权所有，爱思唯尔的许可。 点击这里查看大图 。

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图2。小鼠长期LMA收纳组小鼠（每笼4）单独圈养长期LMA测试开始前。实时分析小鼠LMA 12小时（1天），并在相同的小鼠一天后（第2天）。结果表示为（一）总的移动距离（厘米×1,000），（二）的移动速度（厘米/秒）及（三）的运动的持续时间（秒×1,000）±标准差中，n = 4（无显着差异介于0和24小时）（未公布的导频数据）。

Discussion

小鼠疾病的症状包括嗜睡，利息损失在社会和环境方面的环境，全身乏力和厌食^2-3。在小鼠和其他啮齿类动物，LMA可以被用来评估疾病的免疫激活后^4-5。此外，长期LMA提供能够跟踪运动超过24小时（或更大）期间，允许分析治疗引起的昼夜行为或干扰睡眠/唤醒模式的改变。 LMA提供几个优势超过其他疾病的测试，因为它是无创，简单地进行重复测量或连续的方式，是微创混杂。与其他方法和系统（ 例如 ，Intellecage Phenotyper，photobeam的系统），与VTS中的LMA分析相比是相对便宜的，因为多个笼可以通过同时记录/分析。虽然这里没有利用额外的分析使用LMA饲养和攀岩等活动，可以通过的的一侧安装的摄像头。随着VTS，LMA是高通量的适应性。 VTS也使运动更彻底的检查，包括确定的持续时间，距离，速度和路径^5。焦虑行为的基础，尤其是强大的，因为它的路径跟踪。

尽管它的许多优点，一个潜在的缺陷所固有的LMA与VTS是长达老鼠隔离/单住房（可能超过）24小时。社会隔离，可诱发应激反应和侵略时延长^11。主持人应注意此限制，并采取措施，以确保适当的实验控制和结果解释。

在所有的行为的测试，包括鼠标LMA，密切关注预实验的考虑是实现一致的结果至关重要。驯化试验室和测试笼的环境是必不可少的。异常噪音，光线和声音都特别interfe环，因为它们可能引发的惊吓反应和/或焦虑的行为^7-8。理想的情况下，LMA测试应该发生在温度和湿度控制的环境中免费恶臭（尤其是天敌的气味）。一个固定的行为的测试套件，允许​​住房动物长时间的时间（天）是可取的。返回小鼠的动物护理设施的能力是有利的，因为老化或慢性疾病的研究，反复的测试是非常有用的。

最后，LMA测试应配合几乎所有其他行为测试，因为几乎所有的这些测试需要鼠标移动。扰动LMA影响认知测试（巴恩斯迷宫，Y迷宫，T迷宫，新物体识别），行为（零迷宫，开放的领域），贪图享乐（转轮），抑郁样行为（蔗糖/糖精偏好的焦虑样）和疾病（社会退缩和穴居^）8-9。通过测试短期和lONG长期^LMA，10鼠标的子株，基因型和疾病/干预模式之间的表型差异，可以迅速而不是显着影响后续行为测试评估。此外，如果发现显着的运动差异适当的措施可以采取事先制定更复杂的行为的测试是有限的固有混淆它们诱导。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.