Mus kort og lang sigt motorisk aktivitet Analyzed by Video Tracking Software

Summary

Bevægelsesaktivitet (LMA) er en enkel og let udføres måling af adfærd hos mus. Kobling af video tracking software (VTS) og LMA muliggør forbedring af specificitet og sensitivitet, især sammenlignet med den manuelle, linie krydser metode LMA analyse. Derudover VTS tillader langsigtet sporing af muse LMA.

Abstract

Bevægelsesaktivitet (LMA) er en enkel og let udføres måling af adfærd hos mus og andre gnavere. Forbedringer i video tracking software (VTS) har gjort det muligt at blive koblet til LMA testning, dramatisk forbedring specificitet og sensitivitet i forhold til linjekrydsninger metode med manuel scoring. Derudover giver VTS high-throughput eksperimenteren. Mens ligner automatiseret Videosporingssystemet anvendes til åben mark test (OFT), LMA test er enestående, fordi det giver mulighed for mus til at forblive i deres hjem bur og ikke udnytter anxiogen stimulus af skarpt lys i den aktive fase af lys-mørke cyklus. Traditionelt har LMA blevet brugt til korte perioder (minutter), mens de længere bevægelse undersøgelser (timer-dage) ofte har brugt implanteret sendere og biotelemetry. Med mulighed for real-time tracking, lange, ligesom kortsigtet LMA test, kan nu udføres ved hjælp af videography. Langsigtet LMA test kræver en specialiseret, Men let bygget, bur, så mad og vand (som normalt er placeret på buret øverst) ikke hindrer videography. Vigtigere er det, videography og VTS giver mulighed for kvantificering af parametre, såsom vej musen, der er vanskelige eller umuligt at måle med line passage og / eller biotelemetry. I summen, giver LMA test koblet til VTS en mere fuldstændig beskrivelse af muse bevægelse og evnen til at undersøge bevægelse over en længere tidsperiode.

Protocol

1.. Kortsigtet LMA Set Up and Procedure

1. Kortsigtet LMA bur oprettet
   1. Test kortsigtet LMA i hjemmet bur af en enkelt opstaldet mus. For at lette VTS-afhængig billedanalyse, bruge strøelse i høj kontrast med musen farve (dvs. mørkt farvet strøelse til hvide mus og lys farvet sengetøj for sorte mus).
   2. Under kortvarig LMA test dækker bure med klare ¼ i plexiglas med 11 x ¼ i diameter huller for at støtte passende ventilation.
2. Kortsigtet LMA test værelse
   1. Test mus i et rent miljø, hvor de er tilvænnet i mindst 24 timer ^8..
   2. At belyse testmiljø, brug brooder klemme lys med røde pærer (<125 lumen). Før videography, vinkel og position af lysene tilpasse til at fjerne blænding eller refleksioner fra Plexiglas bur toppe.
   3. Fjern eller undgå værelse støjover 70 dB. Brug en hvid støj-generator, hvis intermitterende baggrundsstøj er uundgåelig under mus test.
   4. Dæk måleoverfladen hvorpå burene er placeret i test værelse med slagter eller laboratoriebord papir af samme farve til buret strøelse, i tilfælde buret gulvet udsættes for under videography.
3. Kortsigtet LMA videography
   1. Center og placere en loftmonteret nattesyn-stand videokamera med mindst 120 GB hukommelse over optagelsen område i test værelse. Må ikke overstige opløsning kapacitet af de VTS anvendes ved at placere for mange bure inden for video kamera view frame (f.eks Ethovision XT 7 ved Noldus Informationsteknologi (Leesburg VA) kan samtidig spore 8 mus i real-tid).
4. Kortsigtet LMA testprocedure
   1. Test kortsigtet LMA under den aktive / mørke fase af lys cyklus. Sørg for, at tiden i forhold til lyset cyklus er the samme på tværs af alle grupper, som LMA følger en crepuscular mønster, med mere aktivitet i de tidlige og senere perioder af den mørke cyklus ^1.. Omfatter både eksperimentelle og kontrol emner i hver gruppe af indspillede mus for at sikre potentielle virkninger af tidsmæssige forskelle i LMA er minimeret.
   2. Individuelt hus og akklimatisere mus i mindst 24 timer før starten af LMA test ^8..
   3. Placer bur skillevægge og bure (indeholdende individuelle mus) direkte under kameraet. Fjern alle nesting / berigelse materiale fra burene, da dette kan blokere visningen af mus (fx hvis musen jordhuler / dækker sig med redemateriale), og forstyrre VTS nøjagtighed. Placer en klar plexiglas låg på hver indspillet bur.
   4. Når videoing flere bure samtidigt, skal du sørge for, at opløsningen er kompatibel med de valgte VTS. For at lette VTS analysen placere burene identisk inden for hver divider (dvs. øverste højre hjørne).
   5. Start optagelse. Begynd hver video med en skifer, der identificerer alle relevante eksperimentelle oplysninger for at sikre korrekt identifikation af videoen uafhængigt af yderligere ikke-video-dokumentation. Brug en timer eller stopur til at spore varigheden af ​​LMA test (5-10 min.) Hvis timingen oplysninger går tabt, genoprette det fra videooptagelse.
   6. For gentagne målinger ved hjælp af kortsigtede LMA metoden, tillade mus adgang til mad og vand i løbet af de ikke-måleintervaller.
   7. Under testen, holde eventuelle eksperimentatorer ude af syne af de mus, så de ikke at fungere som en ekstern visuel cue.
   8. Når testen er overstået, vender tilbage / udskift nesting / berigelse materiale for at reducere risikoen for at udvikle angst-lignende adfærd ^8..
5. Kortsigtet LMA analyse
   1. Opbevar videooptagelser fra test session til en arkivers medier er kompatible med de anvendte VTS. For Ethovision XT 7, en harddisk disk (HDD) anvendes.
   2. Afspille videoer i VTS ved hjælp af sin tilhørende medieafspiller, analysere de videoer i real-tid. I figur 1, var påvisning variabler: 2 cm / sek begynder tracking, 1,75 cm / sek stopper sporing.
   3. I første omgang, skal du vælge hele buret gulvet, da regionen af ​​interesse (ROI) for sporing. Til avancerede analyser, såsom vurdering af thigmotaxis, oprette flere intra-bur rois.
   4. For high-throughput undersøgelser, analysere alle bure inden for video samtidig med individuel all-bur gulv ROIs.
   5. Brug VTS at beregne den samlede afstand flyttet (cm), bevægelseshastighed (cm / sek) og varigheden af ​​bevægelse (sek). For Ethovision XT 7, eksportere data, der genereres i Microsoft Excel til opbevaring og yderligere analyse.

2.. Langsigtet LMA Testing Set Up og Procedure

1. Langsigtet LMA test bur byggeri
   1. Skær en 5,5 cm diameter hul i den korte endevægaf en almindelig mus bur. Opret en overdækning hullet med ¼ i galvaniseret stål mesh. Skær mesh, skaber flere ½ i åbninger til at tillade musen adgang til mad. Polere enhver nedskæring maske for at fjerne skarpe kanter.
   2. Brug ekstra mesh til at oprette en ekstern hopper direkte forbundet til masker, der anvendes til at dække 5,5 cm åbning. Slut tragten til masker, der anvendes til at dække hullet, og fastgør samlingen til buret ved hjælp aluminiumnitter.
   3. Konstruere en vandflaske fra en standard 50 ml konisk (Corning) og en 1-hullers gummiprop (Fisher), der er over-boret for at tillade indsættelse af no-drop sipper rør (Sta-Pure Systems). Fastgør vandflaske til buret med velcro tape (3M) og indsæt sipper røret gennem masken dækkede åbningen.
   4. Ved langtidsbehandling LMA test dækker bure med klare ¼ i plexiglas med 11 x ¼ i diameter huller for at støtte passende ventilation.
2. Langsigtet LMA test værelse
   1. Langsigtet LMA test værelse oprettet er identisk med kortsigtet LMA. Se afsnit 1.2 for proceduren.
3. Langsigtet LMA videography
   1. Center og lægge loft monteret infrarød, sikkerhed-style, kamera direkte forbundet til en PC over optagelsen område i test værelse. Kun registrere antallet af bure på én gang der resulterer i individuelle bur resolution i evne til VTS anvendes (f.eks Ethovision XT 7 samtidig kan spore 8 mus i real-tid).
4. Langsigtet LMA testprocedure
   1. Test langsigtet LMA under den aktive / mørke fase af lys cyklus. Sørg for, at tiden i forhold til lyset cyklus er den samme på tværs af alle grupper, som LMA følger en crepuscular mønster med mere aktivitet i de tidlige og senere perioder af den mørke cyklus ^1.. Test både eksperimentelle og kontrol emner i hver gruppe af indspillede mus for at sikre minimering af potentielleeffekter af tidsmæssige forskelle i LMA.
   2. Individuelt hus og akklimatisere forsøgsmusene i den modificerede bure til mindst 24 timer.
   3. Placer bur skillevægge og bure (indeholdende individuelle mus) direkte under kameraet. Fjern alle nesting / berigelse materiale fra burene for at sikre en uhindret i lyset af musen. Mus gravende ind nesting materiale vil påvirke evnen for VTS at spore musen. Placer en klar plexiglas låg på hver af de bure, der skal registreres.
   4. Når du optager flere bure på én gang, skal du sørge for opløsningen er kompatibel med de valgte VTS. For at lette VTS analysen position bure identisk inden for hver divider (dvs. øverste højre hjørne).
   5. Langsigtet LMA test er generelt analyseres i realtid, og en videooptagelse er normalt ikke oprettet. En videooptagelse kan registreres ved hjælp af en sekundær kamera eller via en DVD-optager er forbundet med den primære kamera. Sørg for at holde detaljerede optegnelser over de enkeltemus og gruppen information.
   6. Opsætning af VTS for real-time analyse. Hele buret gulvet bør omfatte ROI for sporing. Opsætning ROIs for alle bure bliver optaget. Brug VTS at beregne den samlede afstand flyttet (cm), bevægelseshastighed (cm / sek) og varigheden af ​​bevægelse (sek). I figur 2, var påvisning variabler: 2 cm / sek begynder tracking, 1,75 cm / sek stopper sporing.
   7. Begynde at optage mus langsigtet LMA. Overvåge varigheden af ​​langsigtet LMA test via ur forbundet med at analysere computeren.
   8. Under testen, holde alle eksperimentatorer ude af syne af de mus, så de ikke at fungere som en ekstern visuel cue.
   9. Når testen er overstået, vender tilbage / udskift nesting / berigelse materiale for at reducere risikoen for at udvikle angst-lignende adfærd ^8..
5. Langsigtet LMA analyse
   1. Langsigtet LMA analyse forekommer i realtid uden frembringelse af en videooptagelse. Eksportere data til Microsoft Excel til lagring og analyse, hvis du bruger Ethovision XT 7..
   2. For at generere en videooptagelse for langsigtet LMA, bruge et sekundært kamera. Vær sikker på, sekundære kamera har rigelig lagerkapacitet tilstrækkelig til at gemme potentielt langvarige optagelse (r).

Representative Results

Et eksempel på resultaterne af gentagen foranstaltninger er kortvarig LMA test er vist i figur 1.. Dette tal viser, at efter (LPS) administration, mus huse i individuelt ventilerede bure (IVC) genvinde kortsigtede bevægelsesaktivitet hurtigere end mus opstaldet i omgivelserne bure (AEC) ^6.. Mens den oprindelige tab af motorisk aktivitet er ens mellem LPS injicerede grupper, inddrivelse til basal LMA er hurtigere i IVC-opstaldet mus, som var hastigheden af bevægelse (figur 1b) og varigheden af bevægelse (figur 1c). Anvendelsen af ​​en gentagen foranstaltninger model med denne kortsigtede LMA testen tillader observation og sammenligning af nyttiggørelse over tid mellem de forskellige grupper.

En langsigtet LMA test eksempel er vist i figur 2.. Denne figur viser muse bevægelse i løbet af 12 timer af den daglige test over 2 separate, men sammenhængende dage. Ingen signifikant forskel rence i afstand flyttet (figur 2a), bevægelseshastighed (figur 2b) eller varigheden af bevægelse (figur 2c) blev fundet mellem disse 2 dage (upublicerede pilotdata). Mens der er en betydelig mængde af fejl, der skyldtes en lille prøvestørrelse, disse resultater viser, at konsistente og gentagelig data kan genereres i løbet af på hinanden følgende dage, således at potentialet for mere langsigtede bevægelseskomponenter undersøgelser gennemført uden brug af implanterede sendere og biotelemetry. Selv underdimensioneret, flyttede en dag versus to dage forskel i afstand (figur 2a) forekommer på grund af en forskellighed i varigheden af bevægelsen (fig. 2c) og ikke til en forskel i hastighed (figur 2b).

pg "/>
Figur 1. LPS-induceret tab af motorisk aktivitet i mus opstaldet i omgivende miljø bure (AEC) og individuelt ventilerede bure (IVC). Gruppe opstaldet mus (4 pr bur) fra enten AEC eller IVC boliger var individuelt opstaldet før starten af kortsigtede LMA testning. Mus blev injiceret med LPS (100 ug / kg) og (a) afstand flyttet (cm), (b) bevægelseshastighed (cm / sek) og (c) varigheden af bevægelse (r) evalueres på angivne tidspunkter. Resultater udtrykkes som procent baseline (pre-LPS) LMA, betyder ± SEM, n = 6. Afstand flyttede væsentligste effekter: tid (F (3,77) = 13,08, P <0,01), boligtype (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), tid x boligtype interaktion (F (3,77) = 3,31, P = 0,02). Velocity bevægelighed væsentligste effekter: tid (F (3,77) = 13,08, P <0,01), bolig type (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), tid x bolig ing typen interaktion (F (3,77) = 3,31, P = 0,0243). Varighed bevægelighed væsentligste effekter: tid (F (3,77) = 12.92, P <0,01), bolig type (F (1,77) = 0,69, P = 0,41), tid x boligtype interaktion (F (3,77 ) = 3.26, P = 0,03). Barer inden de individuelle tidspunkter uden fælles hævet bogstaver er signifikant forskellige (P <0,05). # Gengivet fra: Brain Behav. og Immun., 26 (6), York, JM, et al., Individuelt ventilerede bure forårsage kroniske low grade hypoxi påvirker mus hematologically og adfærdsmæssigt, 951-958, Copyright 2012, med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se større figur .

load/50252/50252fig2.jpg "/>
Figur 2. Mus langsigtede LMA. Gruppe opstaldet mus (4 pr bur) blev huset individuelt før starten af langsigtede LMA test. Mus LMA blev analyseret i realtid i 12 timer (dag 1), og i de samme mus 1 dag senere (dag 2). Resultater udtrykkes som (a) total afstand flyttet (cm x 1.000), (b) bevægelseshastighed (cm / sek) og (c) varigheden af bevægelse (sek x 1.000) middelværdier ± SEM, n = 4 (ingen signifikant forskel mellem 0 og 24 timer) (upublicerede pilotdata).

Discussion

Symptomer på sygdom i mus omfatter sløvhed, tab af interesse for sociale og miljømæssige omgivelser, utilpashed og anoreksi ^2-3. I mus og andre gnavere, kan LMA bruges til at evaluere sygdom efter immunaktivering ^4-5. Derudover langsigtet LMA giver mulighed for at spore bevægelse over en 24 hr (eller højere) periode, så analysen af ​​behandlingen-inducerede ændringer i døgnrytmen adfærd eller forstyrrelser i søvn / vågner mønstre. LMA giver flere fordele frem for andre test for sygdom, da det er non-invasiv, let udføres som en gentagen foranstaltning eller kontinuerlig modalitet og er minimalt sammenblandede. Sammenlignet med andre metoder og systemer (f.eks Phenotyper, Intellecage, photobeam systemer) LMA analyse med VTS er relativt billigt, fordi flere bure kan optages / analyseres samtidigt. Selvom det ikke er udnyttet her, kan yderligere analyse af LMA aktiviteter som opdræt og væg klatring opnås gennem brug afen sidemonteret kamera. Med VTS, er LMA high-throughput fleksible. VTS giver også mulighed for en mere grundig undersøgelse af bevægelse herunder fastlæggelse af tid, strækning, hastighed og sti ^5.. Path tracking er særligt effektiv, da det ligger til grund angst adfærd.

Trods sine mange fordele, er en potentiel faldgrube uløseligt forbundet med LMA med VTS isolation / enkelt kabinet af mus i op til (og eventuelt over) 24 timer. Social isolation kan fremkalde en stress respons og aggression, når langvarig ^11. Efterforskere bør være opmærksomme på denne begrænsning og træffe foranstaltninger for at sikre korrekt eksperimentel kontrol og resultat fortolkning.

Under alle adfærdsmæssige test, er inklusive muse LMA, meget opmærksom på pre-eksperimentelle overvejelser afgørende for at opnå ensartede resultater. Akklimatisering til test værelse og test bur miljøer er afgørende. Afvigende støj, lys og lyd er særligt påvring, da de kan fremprovokere en forskrækkelse respons og / eller angst adfærd ^7-8. Ideelt set bør LMA test forekomme i en temperatur og fugtighed kontrolleret miljø fri for skadelige lugte (især naturlige rovdyr lugte). En fast adfærdsmæssige test suite, der giver mulighed for opstaldning af dyr i længere perioder (dage) er ønskelig. Evnen til at returnere mus til dyret pleje facilitet er fordelagtig, da gentagne test er meget nyttig i studiet af aldring eller kroniske sygdomme.

Endelig bør LMA testningen udføres sammen med næsten alle andre adfærdsmæssige test, fordi næsten alle disse tests kræver musen bevægelse. Urolig LMA påvirkninger test for kognition (Barnes maze, Y labyrint, T labyrint, roman objekt anerkendelse), angst-lignende adfærd (Zero maze, friland), livsnydende (hjul kører), depressive-lignende adfærd (saccharose / sakkarin præference ) og sygdom (social tilbagetrækning og gravende) ^8-9. Ved at teste kort-og Long sigt LMA, kan fænotypiske forskelle ¹⁰ mellem mus sub-stammer, genotyper og sygdom / indgriben modeller hurtigt blive evalueret samtidig ikke signifikant grad påvirkede efterfølgende adfærdsmæssige test. Desuden, hvis signifikante bevægelse forskelle identificeres relevante foranstaltninger kan træffes forud for vedtagelsen af ​​mere komplicerede adfærdsmæssige test, der er begrænset af de iboende forvirrer de inducerer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.