Mus Kort-og langsiktige Locomotor aktivitet Analyzed by Video Tracking Software

Summary

Lokomotorisk aktivitet (LMA) er en enkel og lett utføres måling av oppførsel i mus. Kobling av video sporing (VTS) og LMA åpner for forbedring av spesifisitet og sensitivitet, spesielt sammenlignet med den manuelle, linje krysset metode for LMA analyse. I tillegg VTS tillater langsiktig oppfølging av mus LMA.

Abstract

Lokomotorisk aktivitet (LMA) er en enkel og lett utføres måling av oppførsel i mus og andre gnagere. Forbedringer i video sporing (VTS) har tillatt det å bli koblet til LMA testing, dramatisk bedre spesifisitet og sensitivitet i forhold til linjen kryssinger metoden med manuell scoring. I tillegg gjør VTS high-throughput eksperimentering. Mens lik automatisert video sporing brukes for det åpne feltet test (OFT), er LMA testing unik ved at den tillater mus til å forbli i sine hjem bur og ikke utnytter den angstskapende stimulans av sterkt lys i løpet av den aktive fase av lys-mørk syklus. Tradisjonelt har LMA blitt brukt for korte perioder av gangen (min), mens lengre bevegelse studier (timer-dager) har ofte brukt implantert sendere og biotelemetry. Med mulighet for sanntids sporing, lang, som kortsiktig LMA testing, kan nå bli utført ved bruk av videoopptak. Langsiktig LMA testing krever en spesialisert, Men enkelt konstruert, bur, slik at mat og vann (som vanligvis er plassert på buret toppen) ikke hindrer videografi. Viktigste er at videography og VTS for kvantifisering av parametere, slik som banen musen bevegelse, som er vanskelig eller drivverdige å måle med linjen krysset og / eller biotelemetry. I sum, gir LMA testing koplet til VTS en mer fullstendig beskrivelse av mus bevegelse og evnen til å undersøke bevegelse over en forlenget tidsperiode.

Protocol

En. Kortsiktig LMA Set Up og prosedyre

1. Kortsiktig LMA bur satt opp
   1. Test kortsiktig LMA i hjemmet bur av en single-huset mus. For å lette VTS-avhengige bildeanalyse, bruker sengetøy i høy kontrast med musen farge (dvs. mørk farget sengetøy for hvite mus og lys farget sengetøy for svarte mus).
   2. Under kortsiktig LMA testing, dekke bur med klare ¼ i pleksiglass med 11 x ¼ i diameter hull å støtte riktig ventilasjon.
2. Kortsiktig LMA testing rom
   1. Test mus i et rent miljø der de har blitt akklimatisert til i minst 24 timer ^8.
   2. For å belyse testing miljø, bruk brooder klemme lys med røde pærer (<125 lumen). Før videography, justere vinkel og posisjon av lysene for å fjerne gjenskinn eller reflekser fra Pleksiglass bur topper.
   3. Fjern eller unngå romlydenover 70 dB. Bruk en hvit støy generator hvis intermitterende bakgrunnsstøy er uunngåelig under musen testing.
   4. Dekk testing overflaten der merdene er plassert i testrommet med slakter eller lab benk papir av tilsvarende farge til buret sengetøy, i tilfelle buret gulvet utsettes for i løpet videografi.
3. Kortsiktig LMA videography
   1. Sentrum og plassere en takmontert nattsyn-stand videokamera med minst 120 GB minne over opptaket området i testing rommet. Ikke overskrid oppløsning evne til VTS brukes ved å plassere altfor mange bur i videokamera view ramme (f.eks Ethovision XT 7 av Noldus Information Technology (Leesburg VA) kan samtidig spore åtte mus i sanntid).
4. Kortsiktig LMA testprosedyre
   1. Test kortvarig LMA under den aktive / mørke fasen av lys syklus. Pass på at tiden i forhold til lyset syklusen er the samme i alle grupper, som LMA følger en crepuscular mønster, med mer aktivitet i den tidlige og senere perioder av mørke syklusen ^en. Inkludere både eksperimentelle og kontroll fag i hver gruppe av innspilte mus for å sikre mulige effekter av tidsmessige forskjeller i LMA er minimert.
   2. Individuelt hus og akklimatisere mus i minst 24 timer før starten av LMA testing ^åtte.
   3. Plasser buret skillevegger og bur (som inneholder individuelle mus) direkte under kameraet. Fjern alle hekkende / berikelse materiale fra merdene, da dette kan hindre visning av musen (f.eks hvis musen Burrows / dekker seg med hekkende materiale) og forstyrre VTS nøyaktighet. Plasser en klar plexiglass lokk på hver merd registrert.
   4. Når videoing flere merder samtidig, være sikker på at oppløsningen er kompatibel med de valgte VTS. For å lette VTS analyse, plassere merdene identisk innenfor hver skillevegg (dvs. øverst i høyre hjørne).
   5. Starte opptaket. Begynn hver video med en skifer som identifiserer all relevant eksperimentelt for å sikre riktig identifikasjon av video uavhengig av eventuelle ytterligere ikke-videodokumentasjon. Bruk en tidtaker eller stoppeklokke for å spore varigheten av LMA testing (5-10 min). Hvis timing informasjon går tapt, gjenopprette den fra video-opptak.
   6. For repeterte målinger ved hjelp av kortvarig LMA-metoden, tillate mus tilgang på mat og vann i løpet av ikke-måleintervaller.
   7. Under testing, holde noen forskere ute av syne av musene ikke å fungere som en ekstern visuell indikator.
   8. Når testen er ferdig, returnere / bytte hekkende / berikelse materiale, for å redusere faren for utvikling av angst-lignende oppførsel ^åtte.
5. Kortsiktig LMA analyse
   1. Lagre videoopptak fra testøkt til en arkivmedier kompatible med VTS brukt. For Ethovision 7 XT, en harddisk disk (HDD) brukes.
   2. Spille av videoer i VTS med tilhørende media player, analysere video i sanntid. I figur 1, var de gjenkjenning variabler: 2 cm / sek begynner sporing, 1,75 cm / sek stopper sporing.
   3. I utgangspunktet velge hele buret etasje som region av interesse (ROI) for sporing. For avanserte analyser, for eksempel vurdering av thigmotaxis, opprette flere intra-buret ROIs.
   4. For høy gjennomstrømming og analyserer alle merder i videoen samtidig med individuell all-buret gulvet ROIs.
   5. Bruk VTS for å beregne den totale avstand beveget (cm), hastigheten av bevegelse (cm / sek) og varigheten av bevegelsen (sek). For Ethovision XT 7, eksportere data generert i Microsoft Excel for lagring og ytterligere analyse.

2. Langsiktig LMA Testing Set Up og prosedyre

1. Langsiktig LMA testing bur bygging
   1. Skjær en 5,5 cm diameter hull på kort endeveggenav en vanlig mus bur. Lag et dekke for hullet med ¼ i galvanisert stål mesh. Skjær mesh, skaper flere ½ i åpninger for å tillate musen tilgang til mat. Burnish eventuelle kutt mesh for å fjerne skarpe kanter.
   2. Bruk ytterligere mesh for å skape en ytre trakt direkte koblet til nettingen som brukes til å dekke 5,5 cm åpning. Koble beholderen til mesh brukes til å dekke hullet, og fest forsamlingen til buret bruke aluminium nagler.
   3. Konstruer en vannflaske fra en standard 50 ml konisk (Corning) og en 1-hulls gummipropp (Fisher) som er over-boret for å tillate innsetting av no-drypp sipper tube (Sta-Pure Systems). Fest vannflasken til buret med borrelås tape (3M) og sett sipper rør gjennom mesh dekket åpningen.
   4. Ved langtidsbehandling LMA testing, dekke bur med klare ¼ i pleksiglass med 11 x ¼ i diameter hull å støtte riktig ventilasjon.
2. Langsiktig LMA testing rom
   1. Langsiktig LMA testing rommet satt opp er identisk med kortsiktig LMA. Se pkt. 1.2 for prosedyren.
3. Langsiktig LMA videography
   1. Sentrum og plassere en takmontert infrarød, sikkerhet-stil, kameraet direkte knyttet til en PC over opptaket området i testing rommet. Bare registrere antall merder samtidig som resulterer i individuelle bur oppløsning innenfor kapasiteten til VTS brukes (f.eks Ethovision XT 7 kan samtidig spore åtte mus i sanntid).
4. Langsiktig LMA testprosedyre
   1. Test langvarig LMA under den aktive / mørke fasen av lys syklus. Pass på at tiden i forhold til lyset syklusen er den samme i alle grupper, som LMA følger en crepuscular mønster med mer aktivitet i den tidlige og senere perioder av mørke syklusen ^en. Test både eksperimentelle og kontroll fag i hver gruppe av innspilte mus for å sikre minimering av potensielleeffektene av tidsmessige forskjeller i LMA.
   2. Individuelt hus og akklimatisere test mus i de modifiserte burene i minst 24 timer.
   3. Plasser buret skillevegger og bur (som inneholder individuelle mus) direkte under kameraet. Fjern alle hekkende / berikelse materiale fra merdene for å sikre en uhindret syn på musen. Mus gravende inn nesting materiale vil interferere med evnen av de VTS å spore mus. Plasser en klar plexiglass lokk på hver av merdene for å bli registrert.
   4. Når du tar opp flere merder på en gang, være sikker på at oppløsningen er kompatibel med de valgte VTS. For å lette VTS analyse, posisjon bur identisk innenfor hver skillevegg (dvs. øverst i høyre hjørne).
   5. Langsiktig LMA tester er analysert i sanntid, og et video-opptak er vanligvis ikke opprettet. En video-opptak kan tas opp ved hjelp av et sekundært kamera eller via en DVD-opptaker knyttet til den primære kamera. Pass på å holde detaljerte registreringer av individuellemus og gruppeinformasjon.
   6. Sett opp VTS for sanntids analyse. Hele buret gulvet bør omfatte ROI for sporing. Sett opp ROIs for alle burene blir registrert. Bruk VTS for å beregne den totale avstand beveget (cm), hastigheten av bevegelse (cm / sek) og varigheten av bevegelsen (sek). I figur 2, var påvisning variabler: 2 cm / sek begynner sporing, 1,75 cm / sek stanser sporing.
   7. Starte innspillingen av mus langsiktig LMA. Overvåke varigheten for langvarig LMA prøving via klokke forbundet med analysering datamaskin.
   8. Under testing, holder alle forskere ute av syne av musene ikke å fungere som en ekstern visuell indikator.
   9. Når testen er ferdig, returnere / bytte hekkende / berikelse materiale, for å redusere faren for utvikling av angst-lignende oppførsel ^åtte.
5. Langsiktig LMA analyse
   1. Langsiktig LMA analysen skjer i sanntid uten generering av et video-opptak. Eksportere dataene til Microsoft Excel for lagring og analyse, hvis du bruker Ethovision XT 7.
   2. For å generere en video rekord for langsiktig LMA, bruke et sekundært kamera. Pass på at det sekundære kameraet har god lagringskapasitet tilstrekkelig til å lagre den potensielt lange opptak (s).

Representative Results

Et eksempel på et resultat av en gjentatt tiltak, er kortvarig LMA test vist i figur 1.. Denne figuren viser at etter lipopolysakkarid (LPS) administrasjon, mus ligger i individuelt ventilert bur (IVC) gjenopprette kortsiktig bevegelsesaktiviteten raskere enn mus plassert i ambient miljø caging (AEC) ^6. Mens den første tap av motorisk aktivitet er lik mellom LPS injisert grupper, er oppgangen til basal LMA raskere i IVC-plassert mus som var hastighet av bevegelse (Figur 1b) og varighet av bevegelse (figur 1c). Bruken av en repeterte målinger modell med denne kortsiktige LMA test tillater observasjon og sammenligning av utvinning over tid mellom forskjellige grupper.

En langsiktig LMA test eksempel er vist i figur 2.. Dette tallet viser musen bevegelse i løpet av 12 timer daglig testing over 2 separate, men sammenhengende dager. Ingen signifikant forskjeller ranse i avstand flyttet (figur 2a), hastighet av bevegelse (Figur 2b) eller varighet av bevegelse (figur 2c) ble funnet mellom disse to dager (upubliserte pilot data). Mens det er en betydelig mengde av feil på grunn av en liten prøve størrelse, disse resultatene illustrerer at konsistente og repeterbare data kan genereres i løpet av påfølgende dager, slik at potensialet for mer langsiktige bevegelsesmønstrene undersøkelser som skal utføres uten behov for implantert sendere og biotelemetry. Selv seg svak, flyttet inn 1 dag 2 dag versus forskjell i avstand (figur 2a) ser ut som følge av en ulikhet i varighet av bevegelse (figur 2c) og ikke til en forskjell i hastighet (figur 2b).

pg "/>
Figur 1. LPS-indusert tap av motorisk aktivitet hos mus plassert i ambient miljø caging (AEC) og individuelt ventilert bur (IVC). Konsernet plassert mus (4 per bur) fra enten AEC eller IVC boliger ble individuelt plassert før starten av kortsiktig LMA testing. Mus ble injisert med LPS (100 ug / kg) og (a) beveget avstand (cm), (b) hastigheten av bevegelse (cm / sek), og (c) varigheten av bevegelsen (e) ble evaluert på de tidspunkter som er angitt. Resultatene er uttrykt som prosent basislinje (pre-LPS) LMA, gjennomsnitt ± SEM, n = 6. Avstand flyttet viktigste effektene: tid (F (3,77) = 13,08, P <0.01), boligtype (F (1,77) = 3.69, P = 0,06), tid x boligtype interaksjon (F (3,77) = 3.31, P = 0.02). Velocity av bevegelse viktigste effektene: tid (F (3,77) = 13,08, P <0.01), boligtype (F (1,77) = 3.69, P = 0,06); tid x hous ing typen interaksjon (F (3,77) = 3.31, P = 0,0243). Varighet av bevegelse viktigste effektene: tid (F (3,77) = 12,92, P <0.01), boligtype (F (1,77) = 0,69, P = 0,41); tid x boligtype interaksjon (F (3,77 ) = 3.26, P = 0.03). Barer innen enkelte tidspunkter uten felles hevet bokstaver er signifikant forskjellig (P <0,05). # Gjengitt fra: Brain Behav. og Immun., 26 (6), York, JM, et al., Individuelt ventilerte bur forårsake kroniske lavgradige hypoksi påvirker mus hematologically og atferdsmessig, 951-958, 2012 Copyright, med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se større figur .

load/50252/50252fig2.jpg "/>
Figur 2. Mus langsiktige LMA. Konsernet plassert mus (4 per bur) ble individuelt plassert før starten av langsiktig LMA testing. Mus LMA ble analysert i sanntid i 12 timer (dag 1), og i de samme musene en dag senere (dag 2). Resultatene er uttrykt som (a) total avstand beveget (cm x 1,000), (b) hastigheten av bevegelse (cm / sek), og (c) varigheten av bevegelsen (sek x 1000) middelverdier ± SEM, n = 4 (ingen signifikant forskjell mellom 0 og 24 hr) (upubliserte data pilot).

Discussion

Symptomer på sykdom hos mus er slapphet, tap av interesse for sosiale og miljømessige omgivelser, ubehag og anoreksi ^2-3. Hos mus og andre gnagere kan LMA brukes til å vurdere sykdom etter aktivering av immunsystemet ^4-5. I tillegg tilbyr langsiktige LMA muligheten til å spore bevegelse over en 24-timers (eller større) periode, slik at analyse av behandling-induserte endringer i circadian atferd eller forstyrrelser i søvn / våkne mønstre. LMA tilbyr flere fordeler fremfor andre tester for sykdom siden den er ikke-invasiv, lett utføres som en gjentatt måling eller kontinuerlig modalitet og er minimalt forvirrende. Sammenlignet med andre metoder og systemer (f.eks Phenotyper, Intellecage, photobeam systemer), LMA analyse med VTS er relativt billig fordi flere bur kan tas opp / analysert samtidig. Selv om ikke benyttet her, kan ytterligere analyse av LMA aktiviteter som oppdrett og vegg-klatring oppnås gjennom bruk aven sidemontert kamera. Med VTS, er LMA høy gjennomstrømming tilpasningsdyktig. VTS gir også mulighet for en mer grundig undersøkelse av bevegelsen inkludert fastsettelse av varighet, distanse, hastighet og bane ^fem. Sti sporing er spesielt kraftig siden det ligger bak angst atferd.

Til tross for sine mange fordeler, er en potensiell felle iboende til LMA med VTS isolering / enkelt hus av mus i opp til (og muligens overstiger) 24 hr. Sosial isolasjon kan indusere en stressrespons og aggresjon når forlenget ^11. Etterforskerne bør være klar over denne begrensningen og treffe tiltak for å sikre riktig eksperimentell kontroll og resultat tolkning.

Under alle atferdsmessige testing, inkludert mus LMA, nær oppmerksomhet til pre-eksperimentelle hensyn er avgjørende for å oppnå konsistente resultater. Akklimatisering til testing rom og test bur miljøer er avgjørende. Avvikende støy, lys og lyd er spesielt interfering som de kan provosere en skremmeeffekt og / eller angst atferd ^7-8. Ideelt sett bør LMA testing oppstå i en temperatur og luftfuktighet kontrollert miljø fritt for skadelige lukter (spesielt naturlige predator lukt). Et fast atferdsmessige testing suite som gir mulighet for boliger av dyr over lengre tid (dager) er ønskelig. Evnen til å returnere mus til dyret omsorg anlegget er fordelaktig ettersom gjentatt testing er svært nyttige ved studiet av aldring eller kroniske sykdommer.

Endelig bør LMA-testing utføres i forbindelse med nesten alle andre atferdsmessige tester fordi nesten alle slike tester krever mus bevegelse. Opprørt LMA virkninger tester for kognisjon (Barnes labyrint, Y labyrint, T labyrint, roman objekt gjenkjenning), angst-lignende oppførsel (Zero labyrint, åpent felt), glede-søkende (hjul kjører), depressive-lignende oppførsel (sukrose / saccharine preferanse ) og sykdom (sosial tilbaketrekning og gravende) ^8-9. Ved å teste korte og long sikt LMA, kan fenotypiske forskjeller ¹⁰ mellom mus sub-stammer, genotyper og sykdom / intervensjon modeller bli raskt evaluert samtidig ikke vesentlig påvirke påfølgende atferdsmessige tester. Videre, hvis betydelige bevegelse forskjellene er identifisert egnede tiltak kan iverksettes før lovfesting av mer kompliserte atferdsmessige tester som er begrenset av de iboende confounds de induserer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.