Rato de curto e longo prazo da atividade locomotora analisados ​​pelo software Rastreamento Vídeo

Summary

Atividade locomotora (LMA) é uma medida simples e de fácil execução de comportamento em camundongos. O acoplamento do software de rastreamento de vídeo (VTS) e LMA permite a melhoria da especificidade e sensibilidade, especialmente quando comparado com o manual, o método de análise cruzando a linha de LMA. Além disso VTS permite o acompanhamento a longo prazo de rato LMA.

Abstract

Atividade locomotora (LMA) é uma medida simples e de fácil execução de comportamento em ratos e outros roedores. Melhorias no software de monitoramento de vídeo (VTS) ter permitido que ele seja acoplado a LMA testes, melhorando drasticamente a sensibilidade e especificidade quando comparado com o método de cruzamentos de linha com a pontuação manual. Além disso, o VTS permite a experimentação de alto rendimento. Embora semelhante ao controle de vídeo automatizado usado para o teste de campo aberto (OFT), LMA teste é o único que permite a ratos para permanecer em sua gaiola e não utiliza o estímulo ansiogênico de iluminação brilhante durante a fase ativa do claro-escuro ciclo. Tradicionalmente, o LMA tem sido usada durante curtos períodos de tempo (minutos), enquanto os estudos de circulação mais longos (HRS-dia), muitas vezes têm utilizado transmissores e biotelemetria implantado. Com a opção de rastreamento em tempo real, de longo, como testes de LMA de curto prazo, podem agora ser realizados utilizando videografia. LMA testes a longo prazo requer um especialista, Mas facilmente construído, de modo que a gaiola de comida e água (o que é normalmente posicionado na parte superior da gaiola) não obstrua videografia. Importante, videografia e VTS permite a quantificação de parâmetros, como caminho de movimento de mouse, que são difíceis ou inviáveis ​​para medir com a linha de cruzamento e / ou biotelemetria. Em resumo, o teste LMA acoplado a VTS proporciona uma descrição mais completa do movimento do rato e a capacidade de examinar locomoção ao longo de um período de tempo prolongado.

Protocol

1. Curto prazo LMA Set Up and Procedure

1. Curto prazo LMA gaiola configurar
   1. Teste LMA curto prazo dentro da gaiola de um rato alojados individualmente. Para facilitar a análise de imagens VTS-dependente, usar roupa de cama em alto contraste com a cor do mouse (ou seja, roupa de cama de cor escura para ratos brancos e luz de cama colorida para ratos pretos).
   2. Durante os testes de LMA de curto prazo, cobrir gaiolas com ¼ claro em acrílico com 11 x ¼ em furos de diâmetro para suportar a ventilação adequada.
2. Curto prazo sala de testes LMA
   1. Teste ratinhos num ambiente limpo, em que tenham sido aclimatados durante pelo menos a 24 horas ^8.
   2. Para iluminar o ambiente de teste, use chocadeira luzes braçadeira com lâmpadas vermelhas (<125 lumens). Antes de videografia, ajustar o ângulo ea posição das luzes para remover o brilho ou reflexos dos topos de gaiola de acrílico.
   3. Remover ou evitar o ruído ambienteacima de 70 dB. Use um gerador de ruído branco se o ruído de fundo intermitente é inevitável durante o teste de mouse.
   4. Cubra a superfície de teste no qual as gaiolas são colocadas na sala de testes com o açougueiro ou laboratório de banco de papel de cor semelhante à da cama gaiola, caso o chão da gaiola é exposto durante videografia.
3. Curto prazo LMA videografia
   1. Centro e coloque a noite câmera de vídeo com capacidade de visão do tecto com pelo menos 120 GB de memória acima da área de gravação na sala de testes. Não exceda a capacidade de resolução dos VTS usados, colocando muitas gaiolas dentro da câmera quadro de visualização de vídeo (por exemplo, Ethovision XT 7 por Noldus Tecnologia da Informação (Leesburg VA) pode rastrear simultaneamente oito camundongos em tempo real).
4. Procedimento de teste LMA curto prazo
   1. Teste LMA curto prazo durante a fase ativa / escuro do ciclo de luz. Certifique-se o tempo em relação ao ciclo de luz é the mesmo para todos os grupos, como LMA segue um padrão crepuscular, com mais actividade durante os períodos de início e depois do ciclo de escuro ^1. Incluir tanto os sujeitos experimentais e controle em cada grupo de camundongos gravadas para garantir os potenciais efeitos das diferenças temporais na LMA são minimizados.
   2. Individualmente casas e aclimatar os ratos, pelo menos, 24 horas antes do início do teste de LMA ^8.
   3. Coloque as divisórias de gaiolas e jaulas (contendo camundongos individuais) diretamente sob a câmera. Remova todo o material de nidificação / enriquecimento das gaiolas, pois isso pode obstruir a visão do mouse (por exemplo, se o mouse tocas / cobre-se com o material do assentamento) e interferir com VTS precisão. Coloque uma tampa de acrílico claro em cada gaiola gravado.
   4. Quando videoing várias gaiolas ao mesmo tempo, certifique-se de que a resolução é compatível com os VTS escolhidos. Para facilitar a análise VTS, posicione as gaiolas de forma idêntica em cada um divisor (ou seja, canto superior direito).
   5. Iniciar a gravação. Comece cada vídeo com uma lousa que identifica todas as informações experimental relevante para assegurar a identificação correcta do vídeo independente de qualquer documentação não-vídeo adicional. Use um temporizador ou cronômetro para acompanhar o tempo de LMA testes (5-10 min). Se a informação de tempo é perdida, recuperá-lo a partir do registro de vídeo.
   6. Para as medidas repetidas usando a curto prazo método LMA, permitir ratos acesso a comida e água durante os intervalos de medição não.
   7. Durante o teste, manter todos os experimentadores fora da vista dos ratos de modo a não agir como um sinal visual externo.
   8. Quando o teste estiver concluído, o retorno / substitua o material do assentamento / enriquecimento, para reduzir o potencial de desenvolvimento da ansiedade-como o comportamento ^8.
5. LMA análise de curto prazo
   1. Armazenar as gravações de vídeo da sessão de testes para uma mídia de arquivamento compatíveis com os VTS usados. Para Ethovision XT 7, uma unidade de disco rígido (HDD) é usado.
   2. Reproduzir os vídeos no VTS usando seu player de mídia associada, analisando os vídeos em tempo real. Na Figura 1, as variáveis ​​de detecção eram: 2 cm / seg começa rastreamento e 1,75 cm / s rastreamento pára.
   3. Inicialmente, escolher todo o chão da gaiola, como a região de interesse (ROI) para o rastreamento. Para as análises avançadas, tais como a avaliação de tigmotatismo, criar várias ROIs intra-gaiola.
   4. Para os estudos de alto rendimento, analisar todas as gaiolas no vídeo simultaneamente com piso ROIs all-gaiola individual.
   5. Usar o VTS para calcular a distância total movida (cm), a velocidade de movimento (cm / seg) e da duração do movimento (seg). Para Ethovision XT 7, exportar os dados gerados em Microsoft Excel para armazenamento e análise adicional.

2. Teste LMA longo prazo Configurar e Procedimento

1. LMA testes de construção de gaiola de longo prazo
   1. Corte um buraco de diâmetro 5,5 centímetros na parede de curto-endde uma gaiola padrão mouse. Criar uma cobertura para o buraco com ¼ de malha de aço galvanizado. Corte a malha, criando vários ½ nas aberturas para permitir o acesso do rato à alimentação. Polir qualquer malha corte para remover bordas afiadas.
   2. Use malha adicional para criar uma tremonha externa directamente ligada à malha utilizada para cobrir a abertura de 5,5 cm. Conecte o funil para a malha usada para cobrir o buraco, e anexar a montagem da gaiola usando rebites de alumínio.
   3. Construir uma garrafa de água a partir de um padrão de 50 ml cônico (Corning) e uma rolha de borracha 1-hole (Fisher), que é o excesso de perfuração para permitir a inserção de não-gotejamento tubo sipper (Sistemas de Sta-Pure). Fixe a garrafa de água para a gaiola com fita de velcro (3M) e inserir o tubo sipper através da abertura coberta mesh.
   4. Durante os testes de LMA de longo prazo, cobrir gaiolas com ¼ claro em acrílico com 11 x ¼ em furos de diâmetro para suportar a ventilação adequada.
2. Longo prazo sala de testes LMA
   1. Longo prazo sala de testes LMA criado é idêntico ao LMA curto prazo. Consulte a seção 1.2 para procedimento.
3. Longo prazo LMA videografia
   1. Center e colocar um tecto montado no infravermelho, de estilo de segurança, a câmara directamente ligado a um PC por cima da área da gravação na sala de teste. Apenas registrar o número de gaiolas de uma vez que resulta em resolução gaiola indivíduo dentro da capacidade dos VTS utilizados (por exemplo, Ethovision XT 7 pode controlar simultaneamente oito camundongos em tempo real).
4. Procedimento de teste LMA longo prazo
   1. Teste LMA longo prazo durante a fase ativa / escuro do ciclo de luz. Certifique-se o tempo em relação ao ciclo de luz é a mesma em todos os grupos, como LMA segue um padrão crepuscular com mais atividade durante os períodos iniciais e depois do ciclo escuro ^1. Teste os dois sujeitos experimentais e controle em cada grupo de camundongos gravadas para garantir a minimização do potencialefeitos das diferenças temporais na LMA.
   2. Individualmente casa e aclimatar os ratos nas gaiolas de teste modificados, para, pelo menos, 24 horas.
   3. Coloque as divisórias de gaiolas e jaulas (contendo camundongos individuais) diretamente sob a câmera. Remover todo o material de assentamento / enriquecimento das gaiolas para assegurar uma vista desimpedida do do rato. Rato enterrando-se o material de assentamento irá interferir com a capacidade do VTS para controlar o rato. Colocar uma tampa de Plexiglas claro em cada uma das gaiolas a ser gravados.
   4. Ao gravar várias gaiolas de uma vez, ter certeza que a resolução é compatível com os VTS escolhidos. Para facilitar a análise VTS, posição idêntica gaiolas dentro de cada um divisor (ou seja, canto superior direito).
   5. LMA testes a longo prazo é geralmente analisada em tempo real, e um registro de vídeo geralmente não é criado. A gravação de vídeo pode ser gravado usando uma câmera secundária, ou através de um gravador de DVD ligado à câmera principal. Certifique-se de manter registros detalhados de indivíduorato e informações sobre o grupo.
   6. Configure os VTS para análise em tempo real. O chão da gaiola deve abranger todo o ROI para rastreamento. Configure ROIs para todas as gaiolas a ser gravado. Usar o VTS para calcular a distância total movida (cm), a velocidade de movimento (cm / seg) e da duração do movimento (seg). Na Figura 2, as variáveis ​​de detecção eram: 2 cm / seg começa rastreamento e 1,75 cm / s rastreamento pára.
   7. Começar a gravar rato longo prazo LMA. Monitorar a duração do ensaio de LMA de longo prazo através do relógio associado com o computador analisar.
   8. Durante o teste, manter todos os experimentadores fora da vista dos ratos de modo a não agir como um sinal visual externo.
   9. Quando o teste estiver concluído, o retorno / substitua o material do assentamento / enriquecimento, para reduzir o potencial de desenvolvimento da ansiedade-como o comportamento ^8.
5. LMA análise de longo prazo
   1. Análise LMA longo prazo podem ocorrer em tempo real, sem a geração de uma gravação de vídeo. Exportar os dados para Microsoft Excel para armazenamento e análise, se estiver usando Ethovision XT 7.
   2. Para gerar um registro de vídeo para LMA longo prazo, usar uma câmera secundária. Certifique-se a câmera secundária tem ampla capacidade de armazenamento suficiente para armazenar o potencialmente longa de gravação (s).

Representative Results

Um exemplo dos resultados de uma série de medidas repetidas, teste de LMA de curto prazo é mostrado na Figura 1. Esta figura mostra que, após administração de lipopolissacarídeo (LPS), ratos alojados em enjaular ventilado individualmente (IVC) recuperar a atividade locomotora de curto prazo mais rápido do que os ratos alojados em ambiente ambiente prendendo (AEC) ^6. Enquanto a perda inicial de actividade locomotora é semelhante entre os grupos injectados com LPS, a recuperação de basal LMA é mais rápida na VCI alojados ratinhos como foi velocidade de movimento (Figura 1b) e da duração do movimento (Figura 1c). A utilização de um modelo de medidas repetidas com este teste LMA curto prazo permite a observação e comparação de recuperação ao longo do tempo entre os diferentes grupos.

Um exemplo de teste LMA longo prazo é mostrado na Figura 2. Esta figura demonstra locomoção mouse durante 12 horas de testes por dia, durante dois dias separados, mas consecutivo. No diferen significativa rência na distância percorrida (Figura 2a), foi encontrado velocidade de movimento (figura 2b) ou do tempo de circulação (Figura 2c) entre estes 2 dias (dados piloto não publicados). Embora exista uma quantidade significativa de erro devido ao pequeno tamanho da amostra, estes resultados ilustram que os dados consistentes e reproduzíveis possam ser geradas ao longo de dias consecutivos, permitindo que o potencial para a estudos de locomoção de longo prazo para ser executado sem a necessidade de implantado transmissores e biotelemetria. Apesar de fraca potência, a um dia versus 2 dia diferença na distância percorrida (Figura 2a) aparece devido a uma heterogeneidade da duração do movimento (Figura 2c), e não a uma diferença de velocidade (Figura 2b).

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Figura 1. Perda induzida por LPS da actividade locomotora em ratos alojados em Enjaulamento ambiente ambiente (AEC) e de encarceramento individualmente ventiladas (VCI). Murganhos alojados em grupo (4 por gaiola), quer a partir de AEC ou IVC carcaça foram alojados individualmente, antes do início do LMA curto prazo teste. Os ratinhos foram injectados com LPS (100 ug / kg) e (a) a distância movida (cm), (b), a velocidade de movimento (cm / seg), e (c) tempo de movimento (s) foi avaliada nos tempos indicados. Os resultados são expressos como percentagem da linha de base (pré-LPS) LMA, médias ± SEM, n = 6. Distância percorrida efeitos principais: tempo (F (3,77) = 13,08, P <0,01), o tipo de habitação (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), tempo x interação tipo de habitação (F (3,77) = 3,31, P = 0,02). Velocidade de movimento efeitos principais: tempo (F (3,77) = 13,08, P <0,01), tipo de habitação (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), tempo x hous interação tipo ing (F (3,77) = 3,31, P = 0,0243). Duração do movimento de efeitos principais: tempo (F (3,77) = 12,92, P <0,01), tipo de habitação (F (1,77) = 0,69, P = 0,41), tempo x interação tipo de habitação (F (3,77 ) = 3,26, P = 0,03). Bares em momentos individuais sem letras sobrescritas comuns são significativamente diferentes (P <0,05). # Reproduzido de: Cérebro Behav. e Immun., 26 (6), York, JM, et al., gaiolas individualmente ventilados causar baixo grau de hipóxia camundongos crônicos que afetam hematologicamente e comportamentalmente, 951-958, Copyright 2012, com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 2. Rato LMA Grupo ratinhos. Alojados a longo prazo (4 por gaiola) foram alojados individualmente, antes do início dos testes a longo prazo LMA. Ratos LMA foi analisada em tempo real, durante 12 h (dia 1), e nos mesmos ratinhos um dia mais tarde (dia 2). Os resultados são expressos como (a) a distância total movida (cm x 1,000), (b), a velocidade de movimento (cm / seg), e (c) tempo de circulação (seg x 1.000) média ± SEM, n = 4 (sem diferença significativa entre 0 e 24 h) (dados do piloto não publicados).

Discussion

Os sintomas da doença em camundongos incluem letargia, perda de interesse em ambientes sociais e ambientais, mal-estar e anorexia ^2-3. Em ratos e outros roedores, LMA pode ser utilizado para avaliar a doença após a activação imunitária ^4-5. Além disso, LMA longo prazo oferece a capacidade de acompanhar o movimento ao longo de 24 horas (ou mais) período, permitindo a análise de alterações induzidas pelo tratamento no comportamento circadiano ou distúrbios nos padrões de sono / vigília. LMA oferece várias vantagens sobre outros testes de doença, uma vez que é não invasivo, facilmente realizada como uma medida repetida ou contínua modalidade e é minimamente confusão. Comparado com outros métodos e sistemas (por exemplo, Phenotyper, Intellecage, sistemas photobeam), análise de LMA com VTS é relativamente barato porque várias gaiolas podem ser gravados / analisados ​​simultaneamente. Embora não seja utilizada aqui, uma análise adicional de actividades como LMA de criação e de escalada de parede pode ser conseguido através do uso deuma câmera montado na lateral. Com VTS, LMA é high-throughput adaptável. VTS também permite uma análise mais aprofundada de circulação, incluindo a determinação de duração, a distância, a velocidade e caminho ^5. Rastreamento caminho é especialmente poderosa, uma vez que subjaz comportamentos de ansiedade.

Apesar das suas inúmeras vantagens, uma armadilha potencial inerente a LMA com VTS é o isolamento / invólucro único dos ratinhos durante até (e possivelmente superior) 24 hr. O isolamento social pode induzir uma resposta de estresse e agressividade quando prolongada ^11. Os investigadores devem estar conscientes dessa limitação e tomar medidas para garantir o controle experimental adequado e interpretação dos resultados.

Durante todos os testes comportamentais, incluindo rato LMA, muita atenção às considerações de pré-experimentais é fundamental para alcançar resultados consistentes. Aclimatação à sala de testes e ambientes gaiola de teste é essencial. Ruído aberrante, luz e som são especialmente interferindoanel, pois podem provocar uma resposta de sobressalto e / ou o comportamento de ansiedade ^7-8. Idealmente, LMA de teste deverá ocorrer num ambiente de temperatura e humidade controlada livre de odores nocivos (odores especialmente predadores naturais). Uma série de testes comportamentais fixo que permite o alojamento de animais por longos períodos de tempo (dias) é desejável. A capacidade de retornar para a instalação de ratinhos cuidados animais é vantajoso uma vez que o teste é repetido muito útil no estudo de envelhecimento ou de doenças crónicas.

Finalmente, o teste LMA deve ser realizado em conjugação com quase todos os outros testes comportamentais, porque quase todos estes testes requerem movimento do rato. Perturbada LMA impactos testes para a cognição (Barnes labirinto, labirinto Y, T labirinto, novela reconhecimento de objetos), ansiedade-como o comportamento (Zero labirinto, campo aberto), o prazer-seeking (roda de corrida), o comportamento depressivo-like (sacarose / sacarina preferência ) e doença (isolamento social e construção de galerias) ^8-9. Através de testes de curto e long prazo LMA, as diferenças fenotípicas entre ¹⁰ rato sub-linhagens, os genótipos e doenças / modelos de intervenção podem ser avaliados rapidamente, enquanto não influenciando significativamente testes comportamentais subseqüentes. Além disso, se as diferenças de movimentos significativos são identificados podem ser tomadas antes da promulgação de testes comportamentais mais complicados que são limitados pelas confunde inerentes eles induzem as medidas adequadas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.