Mus på kort och lång sikt rörelseaktivitet Analyzed by Video Tracking Software

Summary

Rörelseaktivitet (LMA) är en enkel och lätt utförs mätningar av beteende hos möss. Koppling av video spårningsprogram (VTS) och LMA möjliggör förbättring av specificitet och sensitivitet, särskilt jämfört med den manuella, korsar metod LMA analys. Dessutom VTS möjliggör långsiktig uppföljning av mus LMA.

Abstract

Rörelseaktivitet (LMA) är en enkel och lätt utförs mätningar av beteende hos möss och andra gnagare. Förbättringar i video spårningsprogram (VTS) har gjort det möjligt att kopplas till LMA testning, vilket dramatiskt förbättrar specificitet och sensitivitet jämfört med linje korsningar metoden med manuell scoring. Dessutom möjliggör VTS hög genomströmning experiment. Medan liknande automatiserad video tracking används för det öppna fältet testet (OFT), är LMA testning unik genom att den tillåter möss att stanna kvar i sitt hem bur och inte utnyttja ångestökande stimulans av ljus belysning under den aktiva fasen av ljus-mörker cykel. Traditionellt har LMA använts för korta tidsperioder (min), medan längre rörelse studier (h-dagar) har ofta använt implanterade sändare och biotelemetry. Med möjlighet till spårning i realtid, lång, liksom kortsiktiga LMA testning, kan nu utföras med hjälp av Videografi. Långsiktig LMA testning kräver en specialiserad, Men lätt konstruerade, bur så att mat och vatten (som vanligtvis är placerad på burtopp) inte hindrar Videografi. Viktigt ger Videografi och VTS för kvantifiering av parametrar, såsom väg musrörelser, som är svåra eller omöjliga att mäta med linjekorsning och / eller biotelemetry. Sammanfattningsvis ger LMA testning kopplad till VTS en mer fullständig beskrivning av mus rörelse och förmågan att undersöka förflyttning över en utsträckt tidsperiod.

Protocol

Ett. Kortfristiga LMA Set Up and Procedure

1. Kortfristiga LMA bur inrättas
   1. Testa kortsiktiga LMA i hemmet buren av en enda inrymt mus. För att underlätta VTS-beroende bildanalys, använder sängkläder i hög kontrast med musen färg (dvs. mörka sängkläder för vita möss och ljusa sängkläder för svarta möss).
   2. Under kortsiktiga LMA testning, täcka burar med tydlig ¼ i plexiglas med 11 x ¼ i diameter hål att stödja lämplig ventilation.
2. Kortfristiga LMA testrum
   1. Testa möss i en ren miljö där de har acklimatiserad till minst 24 tim ^8.
   2. För att belysa testmiljö, använd grubblare klämma lampor med röda lampor (<125 lumen). Före Videografi, justera vinkeln och positionen av lamporna för att ta bort reflexer och speglingar från plexiglas burtaket.
   3. Ta bort eller undvik rum bulleröver 70 dB. Använd ett vitt brus generator om intermittent bakgrundsljud är oundviklig under musen testning.
   4. Täck testa yta på vilken burarna placeras i test rummet med slaktaren eller lab bänk papper av samma färg till buren sängkläder, ifall buren golv utsätts under Videografi.
3. Kortfristiga LMA videography
   1. Center och placera en takmonterad mörkerseende-kapabel videokamera med minst 120 GB minne ovanför inspelningen område i test rummet. Överskrid inte upplösningsförmåga VTS används genom att placera alltför många burar inom videokamera vyn ram (t.ex. Ethovision XT 7 av Noldus Informationsteknologi (Leesburg VA) kan samtidigt spåra 8 möss i realtid).
4. Kortfristiga LMA provningsförfarande
   1. Testa kortsiktiga LMA under den aktiva / mörka fasen av ljuset cykeln. Kontrollera att tiden i förhållande till ljuset cykeln är the samma för alla grupper, som LMA följer en skymmning mönster, med mer aktivitet under de tidiga och senare perioder av mörker-cykel ^1. Inkludera både experimentella och kontroll patienter i varje grupp av inspelade möss för att säkerställa eventuella effekter av tidsmässiga skillnader i LMA minimeras.
   2. Individuellt hus och acklimatisera möss minst 24 timmar före starten av LMA test ^8.
   3. Placera buren avdelare och burar (innehållande individuella möss) direkt under kameran. Ta bort alla häckande / anrikning material från burarna, eftersom det kan hindra vyn i musen (t.ex. om musen hålor / täcker sig med bomaterial) och störa VTS noggrannhet. Placera en klar plexiglas lock på varje inspelad bur.
   4. När videoing flera burar samtidigt vara säker på att upplösningen är förenligt med de valda VTS. För att underlätta VTS analys, placera burarna identiskt inom varje delare (dvs. övre högra hörnet).
   5. Starta inspelningen. Börja varje video med en griffeltavla som identifierar all relevant experimentell information för att säkerställa korrekt identifiering av videon oberoende av eventuella ytterligare icke-video dokumentation. Använd en timer eller stoppur för att spåra varaktighet LMA testning (5-10 min). Om timing information går förlorad, återställa den från videoinspelning.
   6. För upprepade mätningar med hjälp av kortsiktiga LMA metoden, ge mössen tillgång till mat och vatten under de icke-mätintervallen.
   7. Under provningen, hålla några praktiker utom synhåll för mössen att inte fungera som en extern visuell.
   8. När testet är klart, returnera / byta häckande / anrikning material, för att minska risken för utveckling av ångest-liknande beteende ^8.
5. Kortfristiga LMA-analys
   1. Förvara videoinspelningarna från test session till ett arkiv medier som är kompatibla med de använda VTS. För Ethovision XT 7, en hårddisk hårddisk (HDD) används.
   2. Spela videoklipp i VTS med dess tillhörande mediaspelare, analysera video i realtid. I fig. 1, var för påvisande variabler: 2 cm / sek börjar spårning, 1,75 cm / s stannar spårning.
   3. Inledningsvis välja hela burgolvet som regionen av intresse (ROI) för spårning. För avancerade analyser, exempelvis bedömning av thigmotaxis, skapa flera intra-bur ROI.
   4. För hög genomströmning studier, analysera alla burar inom video samtidigt med individuella all-burgolvet ROI.
   5. Använd VTS för att beräkna den totala distansen flyttade (cm), hastigheten av rörelsen (cm / sek) och varaktigheten av rörelse (sek). För Ethovision XT 7, exportera data som genererats i Microsoft Excel för lagring och ytterligare analys.

2. Långsiktig LMA testning Set Up och arbetsordningen

1. Långsiktig LMA testning burkonstruktion
   1. Skär en 5,5 hål cm diameter på kort gavelväggenav en vanlig mus bur. Skapa ett överdrag för hålet med ¼ i galvaniserat stålnät. Skär nätet, skapar flera ½ i öppningar för att tillåta musen tillgång till mat. Polera varje snitt nät för att ta bort vassa kanter.
   2. Använd extra mesh för att skapa en extern behållare i direkt anslutning till nät som används för att täcka 5,5 cm öppning. Anslut magasinet till nät som används för att täcka hålet, och sätta den till buren med aluminiumnitar.
   3. Konstruera en vattenflaska från en vanlig 50 ml koniskt (Corning) och ett en-håls gummipropp (Fisher) som är över-borras för att möjliggöra insättning av no-dropp sipper rör (Sta-Pure Systems). Säkra vattenflaska till buren med kardborreband (3M) och sätt in sipper röret genom den täckta masköppningen.
   4. Under långtidsbehandling LMA testning, täcka burar med tydlig ¼ i plexiglas med 11 x ¼ i diameter hål för att stödja lämplig ventilation.
2. Långsiktig LMA testrum
   1. Långsiktig LMA testrum inrättats är identisk med kortsiktiga LMA. Se avsnitt 1.2 för förfarandet.
3. Långsiktig LMA videography
   1. Center och placera en takmonterad IR, säkerhet-stil, kameran direkt kopplade till en dator över inspelningen område i test rummet. Bara registrera antalet burar på en gång som resulterar i individuella bur upplösning inom förmågan hos VTS används (t.ex. Ethovision XT 7 kan samtidigt spåra 8 möss i realtid).
4. Långsiktig LMA provningsförfarande
   1. Testa långsiktigt LMA under den aktiva / mörka fasen av ljuset cykeln. Kontrollera att tiden i förhållande till ljuset cykeln är densamma i alla grupper, som LMA följer en skymmning mönster med mer aktivitet under de tidiga och senare perioder av mörker-cykel ^1. Testa både experimentella och kontroll försökspersoner i varje grupp av inspelade möss för att säkerställa minimering av potentielleffekter av tidsmässiga skillnader i LMA.
   2. Individuellt hus och acklimatisera testmössen i de modifierade burar minst 24 tim.
   3. Placera buren avdelare och burar (innehållande individuella möss) direkt under kameran. Ta bort alla häckar / anrikning material från burar för att säkerställa en ostörd med tanke på musen. Musen gräva i bomaterial kommer att störa förmågan hos VTS att spåra musen. Placera en klar plexiglas lock på varje burar som ska registreras.
   4. När du spelar in flera burar på en gång, se till att resolutionen är förenlig med de valda VTS. För att underlätta VTS analys, placera burar identiskt inom varje delare (dvs. övre högra hörnet).
   5. Långsiktig LMA testning i allmänhet analyseras i realtid, samt en videoinspelning är oftast inte skapas. En videoinspelning kan spelas in med hjälp av en sekundär kamera eller via en DVD-brännare kopplad till den primära kameran. Var noga med att föra detaljerade register över enskildamus och gruppinformation.
   6. Ställ upp VTS för analys i realtid. Hela buren golv bör omfatta ROI för spårning. Konfigurera ROI för alla burar som spelas in. Använd VTS för att beräkna den totala distansen flyttade (cm), hastigheten av rörelsen (cm / sek) och varaktigheten av rörelse (sek). I figur 2, var upptäckt variabler: 2 cm / sek börjar spårning, 1,75 cm / sek stannar spårning.
   7. Börja spela in mus långsiktigt LMA. Övervaka varaktighet långsiktiga LMA testning via klockan i samband med analys av datorn.
   8. Under provningen, hålla alla praktiker utom synhåll för mössen att inte fungera som en extern visuell.
   9. När testet är klart, returnera / byta häckande / anrikning material, för att minska risken för utveckling av ångest-liknande beteende ^8.
5. Långsiktig LMA-analys
   1. Långsiktig LMA analys sker i realtid utan generering av en videoinspelning. Exportera data till Microsoft Excel för lagring och analys, om du använder Ethovision XT 7.
   2. För att generera en videoinspelning för långsiktig LMA, använd en sekundär kamera. Var noga med den sekundära kameran har gott om lagringskapacitet är tillräcklig för att lagra potentiellt långa inspelningen (s).

Representative Results

Ett exempel på resultat från en upprepad åtgärder, är kortsiktiga LMA testet visas i figur 1. Denna siffra visar att efter lipopolysackarid (LPS) administration, möss inrymt i individuellt ventilerade bur (IVC) återhämta kortsiktiga rörelseaktivitet snabbare än möss inrymt i omgivande miljö caging (AEC) ^6. Medan den initiala förlusten av rörelseaktivitet är likartad mellan LPS injicerade grupper, är återhämtningen för basala LMA snabbare i IVC hysta möss var som hastigheten av rörelser (Figur 1b) och varaktigheten av rörelse (figur 1c). Användningen av en upprepad åtgärder modell med detta kortsiktiga LMA testet tillåter observation och jämförelse av återhämtning över tiden mellan olika grupper.

Ett långsiktigt LMA testet exempel visas i figur 2. Denna figur visar mus förflyttning under 12 h för dagliga tester under två separata men sammanhängande dagar. Ingen signifikant diffe rens i tillryggalagd sträcka (figur 2a), hastighet rörlighet (figur 2b) eller varaktigheten av rörelse (figur 2c) påträffades mellan dessa 2 dagar (opublicerade pilotdatan). Medan det finns en betydande mängd av fel på grund av små provmängder dessa resultat illustrerar att konsekventa och repeterbara data kan genereras under loppet av på varandra följande dagar, vilket gör att risken för långsiktiga locomotion undersökningar som behöver göras utan behov av implanterade sändare och biotelemetry. Även underpowered, flyttade 1 dag jämfört med 2 dagars skillnad i avstånd (Figur 2a) visas eftersom en olikhet i hela rörelsen (figur 2c) och inte till en skillnad i hastighet (figur 2b).

pg "/>
Figur 1. LPS-inducerad förlust av rörelseaktivitet hos möss inrymt i omgivande miljö caging (AEC) och individuellt ventilerade bur (IVC). Group inhyste möss (4 per bur) från antingen AEC eller IVC bostäder inhystes individuellt innan kortsiktiga LMA testning. Möss injicerades med LPS (100 ng / kg) och (a) tillryggalagd sträcka (cm), (b) hastighet rörligheten (cm / s) och (c) varaktigheten av rörelse (er) utvärderades vid de tidpunkter som anges. Resultaten uttrycks som procent baseline (pre-LPS) LMA, medelvärde ± SEM, n = 6. Avstånd flyttade huvudsakliga effekter: tid (F (3,77) = 13,08, P <0,01), bostäder typ (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), tid x bostäder typ interaktion (F (3,77) = 3,31, P = 0,02). Velocity rörlighet huvudsakliga effekter: tid (F (3,77) = 13,08, P <0,01), bostadstyp (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), tid x hous Ing typ interaktion (F (3,77) = 3,31, P = 0,0243). Varaktighet rörlighet huvudsakliga effekter: tid (F (3,77) = 12.92, P <0,01), bostadstyp (F (1,77) = 0,69, P = 0,41), tid x bostäder typ interaktion (F (3,77 ) = 3,26, P = 0,03). Bars inom enskilda tidpunkter utan vanliga upphöjda bokstäver är signifikant skilda (P <0,05). # Utdrag ur: Brain Behav. och Immun., 26 (6), York, JM, et al., individuellt ventilerade burar orsakar kroniska låggradig hypoxi påverkar möss hematologiskt och beteendemässigt, 951-958, Copyright 2012, med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att visa en större bild .

load/50252/50252fig2.jpg "/>
Figur 2. Mouse långsiktiga LMA. Grupp inrymt möss (4 per bur) inhystes individuellt före starten av långsiktiga LMA testning. Möss LMA analyserades i realtid för 12 h (dag 1), och i samma möss en dag senare (dag 2). Resultaten uttrycks som (a) total sträcka flyttas (cm x 1,000), (b) hastighet rörlighet (cm / sek) och (c) varaktigheten av rörelse (sek x 1,000) medel ± SEM, n = 4 (ingen signifikant skillnad mellan 0 och 24 timmar) (opublicerade pilotdata).

Discussion

Symtom på sjukdom i möss letargi, förlust av intresse för sociala och miljömässiga omgivningar, sjukdomskänsla och anorexi ^2-3. Hos möss och andra gnagare kan LMA användas för att utvärdera sjukdom efter immun aktivering ^4-5. Dessutom erbjuder långsiktiga LMA möjlighet att spåra rörelser över en 24 h (eller högre) period, vilket gör att analysen av behandling-inducerade förändringar i dygnsrytm beteende eller störningar i sömn / vakna mönster. LMA erbjuder flera fördelar jämfört med andra tester för sjukdom eftersom den är icke-invasiv, lätt utföras som en upprepad åtgärd eller kontinuerlig modalitet och är minimalt confounding. Jämfört med andra metoder och system (t.ex. Phenotyper, Intellecage, photobeam system), LMA analys med VTS är relativt billigt eftersom flera burar kan spelas in / analyseras samtidigt. Även om det inte utnyttjas här, kan ytterligare analys av LMA aktiviteter som uppfödning och väggklättring uppnås genom användning aven sidomonterad kamera. Med VTS är LMA hög genomströmning anpassningsbar. VTS möjliggör också en mer grundlig undersökning av rörelse inklusive fastställande av tid, distans, hastighet och bana ^5. Stig spårning är särskilt kraftfull eftersom den ligger till grund ångest beteenden.

Trots dess många fördelar, är en potentiell fallgrop inneboende LMA med VTS isoleringen / enda hölje av möss för upp till (och eventuellt mer än) 24 timmar. Social isolering kan inducera en stressreaktion och aggression när långvarig ^11. Utredarna bör vara medvetna om denna begränsning och vidta åtgärder för att säkerställa korrekt experimentell kontroll och resultat tolkning.

Under alla beteendemässiga tester, inklusive mus LMA, stor uppmärksamhet åt pre-experimentella överväganden är avgörande för att uppnå jämna resultat. Acklimatisering till testning rummet och testmiljöer bur är viktigt. Avvikande ljud, ljus och ljud är speciellt interfering, eftersom de kan framkalla en reaktion på plötsliga ljud och / eller ångest beteende ^7-8. Helst bör LMA testning ske i en temperatur och luftfuktighet kontrollerad miljö fri från skadliga lukter (särskilt naturliga rovdjur lukter). Ett fast beteendetestning svit som låter för bostäder av djur under längre tidsperioder (dagar) är önskvärd. Förmågan att återvända möss till djuret vård anläggning är fördelaktigt eftersom upprepad testning är mycket användbara vid studium av åldring eller kroniska sjukdomar.

Slutligen bör LMA testerna genomföras i samband med nästan alla andra beteendetester eftersom nästan alla sådana tester kräver musrörelser. Perturbed LMA konsekvenser tester för kognition (Barnes labyrint, Y labyrint, T labyrint, nya objekt erkännande), ångest-liknande beteende (Zero labyrint, öppet fält), nöjeslysten (hjul kör), depressiva-liknande beteende (sackaros / sackarin önskemål ) och sjukdom (social tillbakadragande och grävande) ^8-9. Genom att testa kort-och lOng sikt LMA kan fenotypiska skillnader ¹⁰ mellan mus sub-stammar, genotyper och sjukdom / ingripande modeller snabbt utvärderas samtidigt inte nämnvärt påverka efterföljande beteendetester. Dessutom, om betydande rörelse skillnader identifieras lämpliga åtgärder kan vidtas före antagandet av mer komplicerade beteendetester som begränsas av de inneboende förvirrar de kan orsaka.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.